MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

Práctica Nº 4
Bacterias: Aislamiento y Sintomatología.
I.- OBJETIVOS: Logros que deben alcanzar al término de la Práctica.

 Conocer y aplicar técnicas de aislamiento de bacterias en medios de cultivo a

partir de diferentes muestras.
 Conocer las técnicas más comúnmente empleadas en el aislamiento de bacterias.
 Evidenciar la presencia de las bacterias presentes en diversos hábitat como:
plantas, suelo, agua, leche, aire, saliva, etc.

II.- ASPECTOS GENERALES:

SIEMBRA.- Es el procedimiento por el cual se inocula los microorganismos en un

medio de cultivo adecuado para su desarrollo y multiplicación.

AISLAMIENTO.- Es la obtención de colonias puras de un determinado microorganismo

en un medio de cultivo agarizado.

Las bacterias deben de ser cultivadas en medios de cultivos para caracterizar su

crecimiento, hacer su identificación y determinar sus actividades metabólicas. Un medio de
cultivo es una solución acuosa de diferentes compuestos que contienen todos los elementos
indispensables que requieren los microorganismos para su crecimiento.

Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios líquidos (caldos)

o solidificados con agar para su propagación y/o conservación, así como para estudiar sus
características de crecimiento. Es importante recordar que la inoculación de los
microorganismos en los medios de cultivo, siempre deberán realizarse en zona aséptica
(cerca del mechero), condiciones que limitan la presencia de microorganismos indeseables
o contaminantes.

Las técnicas de aislamiento, permiten la obtención de microorganismos a partir de

muestras complejas (planta, suelo, agua, leche, aire, saliva, etc.) en las que existe una gran
diversidad microbiana, así como para comprobar la pureza de los cultivos obtenidos. Los
cultivos puros están formados por un solo tipo de microorganismo y son indispensables para
conocer las características morfológicas, propiedades de tinción, actividad microbiana,
patogenicidad e identificación de las especies microbianas.

El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por métodos de dilución en

medios sólidos por estría en placa o en medios líquidos. En el primer caso se considera que
cada célula bacteriana que se separa dará origen a una población que formara una colonia
característica, visible a simple vista.

Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad se aplican métodos de

cultivos especiales, que contienen nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones
de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura para favorecer el crecimiento de
microorganismos de interés y se conocen como selectivos o de enriquecimiento. En
ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros componentes como: sangre,
colorantes, indicadores, etc. para distinguir especies bacterianas diferentes por la forma en

Pág. Nº 41
 MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

que metabolizan los sustratos que se manifiesta por cambios en la apariencia o modificación
del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como medios diferenciales y son de
gran utilidad para la caracterización e identificación de especies bacterianas.

III.- MATERIALES:

 Placas petri.
 Pipetas.
 Matraces.
 Mechero.
 Asas de kolle.
 Alcohol yodado.
 Medios de cultivo.

MUESTRAS:

 Plantas con síntomas.

 Hojas infectadas.
 Suelo.
 Raíces.
 Yogurt.

IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

El profesor realizará la demostración del aislamiento de cada una de las muestras,

luego cada subgrupo de práctica procederá a realizar cada uno de los aislamientos de las
diferentes bacterias.

4.1.- RECOMENDACIONES GENERALES PARA REALIZAR AISLAMIENTOS EN BACTERIAS:

1. Desinfectarse las manos con alcohol medicinal.

2. Desinfectar el ambiente con alcohol medicinal o clorox (2.5%).
3. Esterilizar a la llama de un mechero, asas de kolle, pinzas u otros materiales, antes
y después de la siembra.
4. Efectuar la inoculación o siembra de los microorganismos cerca de la llama de un
mechero.
5. Para evitar la contaminación de los medios de cultivo, con microorganismos
extraños al que queremos aislar, no se debe hablar ni exponer los medios de
cultivo a corrientes de aire.
6. Marcar claramente las siembras, indicando siglas del medio de cultivo Ejm.
Levadura manitol agar: LMA), tipo de muestra sembrado (Ejm. Zanahoria), fecha,
grupo, sub-grupo.

4.2.- MÉTODOS DE SIEMBRA EN ESTRÍAS POR AGOTAMIENTO:

Pág. Nº 42
 MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

En los procedimientos 1,2 y 3 se realiza la siembra sin quemar el asa de kolle en el

proceso; en el procedimiento 4 se quema el asa de kolle al pasar de un estriado a otro.

4.3.- AISLAMIENTO DE BACTERIAS QUE CAUSAN ENFERMEDADES EN

PLANTAS:

Existen 5 géneros de bacterias que causan enfermedades en plantas:

 Pseudomonas y Xanthomonas, producen manchas necróticas y marchites en

tallos, hojas, vainas, tubérculos y bulbos (Ej. Tomate, fríjol, papa, cebolla,
cladodio).
 Erwinia (Pectobacterium), causa las pudriciones blandas en hortalizas y otras
plantas (Ej. Zanahoria, cebolla, papa).
 Agrobacterium, produce agallas o tumores en raíces de diferentes plantas (Ej.
Durazno, pera, fríjol)
 Clavibacter, produce enfermedades vasculares, presentando como síntoma
marchitamiento (Ej. Alfalfa, papa, tomate).

PROCEDIMIENTO:

1. Para el aislamiento de estas bacterias se puede utilizar material vegetal enfermo

como bulbos, raíces, tubérculos, hojas, tallos, vainas, etc.
2. El material vegetal enfermo se debe lavar con agua destilada.
3. Cortar en pequeños trozos (0.5 cm.) y desinfectar con hipoclorito de calcio al 2%
(clorox).
4. Enjuagar con agua destilada estéril varias veces.
5. Con la ayuda de una pinza desinfectada tomar la porción del vegetal enfermo y
colocar en un tubo con 5 ml. de agua destilada estéril.
6. Con una bagueta desinfectada, proceder a triturar la muestra.
7. A partir de esta muestra, tomar un poco de líquido con una asa de kolle en forma
de ansa y estriar directamente en el medio de cultivo YCDA.
8. Las placas así sembradas se incuban a temperatura de ambiente durante 3 a 5
días.
9. Al término de este tiempo se observarán diferentes tipos de colonias de acuerdo a
los géneros de bacterias.

Esquema del aislamiento de bacterias que causan enfermedades en plantas.

Pág. Nº 43
 MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

4.4.- AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEL GÉNERO RHIZOBIUM:

La simbiosis más conocida es la que se produce entre las bacterias del género
Rhizobium y las plantas leguminosas, estas bacterias infectan las raíces y forman nódulos
dentro de los cuales se fija y se transforma el nitrógeno atmosférico brindando a la planta en
forma asimilable.

PROCEDIMIENTO:

1. El aislamiento de estas bacterias se puede realizar de nódulos de diferentes

leguminosas, ya sea anuales (arveja, haba, vicia, frijol, soja) o perennes (alfalfa,
tréboles).
2. En el campo se deben escoger leguminosas que tengan un color verde oscuro, de
talla grande, buen vigor.
3. De estas plantas se escogen nódulos con características de efectividad (ubicados
en las raíces principales o primarias, de talla grande y que al aplastar presenten
una coloración rojo intenso.
4. Los nódulos seleccionados se colocan en un tubo con tapa de baquelita y se lavan
enérgicamente varias veces con agua corriente, con la finalidad de eliminar la tierra
de los nódulos.
5. Los nódulos lavados son desinfectados con hipoclorito de calcio al 2% por un
tiempo variable (1 a 5 minutos) de acuerdo al tamaño de los nódulos, finalmente se
enjuagan 5 a 6 veces con agua destilada estéril.
6. Se toma un solo nódulo con una pinza desinfectada y en el borde del medio LMA
se aplasta el nódulo para extraer el jugo nodular.
7. Se homogeniza y se realiza el estriado con una asa de kolle en ansa.
8. Incubar las placas sembradas en estufa a 28°C por 5 días, después de este
periodo se formarán colonias características.

Esquema del aislamiento de bacterias del género Rhizobium

Pág. Nº 44
 MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

4.5.- AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEL SUELO:

Existe una gran diversidad de microorganismos que viven en el suelo. El número y

tipos de microorganismos presentes en el suelo dependen de diversos factores
ambientales como son los nutrientes, humedad, aireación, temperatura, pH, prácticas
agrícolas, etc. Existen del orden de varios miles de millones de bacterias por gramo de
suelo. La mayor parte son heterótrofos, siendo comunes los bacilos esporulados, los
actinomicetos que son los responsables del olor a tierra mojada, y en la rizosfera
(región donde el suelo y las raíces de las plantas entran en contacto) especies de los
géneros Rhizobium y Pseudomonas.

PROCEDIMIENTO:

1. Mezclar la muestra de suelo (en un recipiente de 100 ml) con 50 ml de agua

destilada esterilizada. Agitar vigorosamente durante unos 5 minutos. Dejar
reposar para que sedimente el material grueso.
2. Hacer una dilución 1/50 a partir del líquido sobrenadante de las muestras
(200μl en 10ml de agua destilada esterilizada)
3. Inocular las placas con medio agar nutritivo utilizando 200μl de sobrenadante
sin diluir y 200μl de la dilución 1/50.
4. Incubar las placas a 30º C. x 3 días

Esquema del aislamiento de bacterias del suelo

Pág. Nº 45
 MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

4.6.- AISLAMIENTO DE BACTERIAS EPÍFITAS:

Son aquellas bacterias que se encuentran en las superficies de tejidos vegetales,

como hojas, sin causar síntomas. La resistencia de algunas especies vegetales al ataque de
diferentes patógenos puede deberse a la presencia de estos microorganismos.

PROCEDIMIENTO:

1. El haz y el envés de una hoja que se desea analizar, se presiona suavemente en

el medio de cultivo Agar nutritivo.
2. Luego se retira la hoja.
3. Incubar a temperatura ambiente por 5 días.

Esquema del aislamiento de bacterias Epífitas

Pág. Nº 46
 MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

4.7.- AISLAMIENTO DE ENTEROBACTERIAS DE LA LECHE:

Generalmente las bacterias que invaden la leche provienen del polvo, por ello pueden
encontrarse casi todos los tipos de bacterias que se encuentran en el suelo, aunque
prosperan mejor, el Streptococcus lactis y otras especies de Lactobacillus. Si la leche se
contamina con heces puede desarrollar enterobacterias como Shiguella, Salmonella y
Proteus. A través de las gotículas de saliva puede contaminarse con Staphilococcus y
Mycobacterium tuberculosis que causa la tuberculosis en humanos.

PROCEDIMIENTO:

1. Para el aislamiento de estas bacterias se puede emplear cualquier tipo de leche

fresca sin hervir.
2. Como medio de cultivo se empleará el medio Mac Conkey, medio selectivo que
permitirá aislar solamente enterobacterias.
3. De la muestra de leche se toma una asada.
4. Se siembra por estrías en el medio Mac Conkey.
5. Los medios sembrados se incuban en estufa a 37°C. por 48 hrs.
6. Observándose después de este tiempo diferentes colonias características.

Esquema del aislamiento de bacterias de la leche

Pág. Nº 47
 MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

4.8.- OBERVACIÓN DE LA SINTOMATOLOGÍA DE LAS BACTERIAS:

4.8.1. Con la ayuda del manual de prácticas observe la diversidad de síntomas

producidos por las bacterias:

Agallas y tumores

Manchas foliares

Pág. Nº 48
 MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

Costras en frutos

Lesiones en frutos

Pág. Nº 49
 MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

Podredumbres húmedas

Manchas necróticas en tallos Síntomas de bacterias (zoogleas)

Zooglea saliendo de los haces

vasculares de una papa afectada por
Pseudomonas solanacearum.

Pág. Nº 50
 MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

4.8.2. Observe las muestras vegetales siguientes, luego esquematice y describa los
síntomas observados

a) Imagen y nombre del síntoma Descripción del síntoma

observado
 La enfermedad aparece en forma de
pequeños crecimientos excesivos y
de las raíces de la planta.
 Tumores casi esféricos, blancos o de
colores vivos y bastante blandos.
 Conforme se extiende, sus
superficies se hacen más o menos
intricados.
 Posteriormente los tejidos de la
superficie se vuelven pardo-oscuro o
negro debido a la muerte y podrición
de las células periféricas.

b) Imagen y nombre del síntoma Descripción del síntoma

observado
 clorosis intervenal.
 amarillamiento entre las venas.
 abrasador ennegrecido, rizado, o
la caída prematura de las hojas.
  ramas marchitas.
 muerte regresiva de la copa.

Pág. Nº 51
 MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

c) Imagen y nombre del síntoma Descripción del síntoma

observado
Costra: lesiones levantadas, más o
menos circulares, en relieve, a veces
rugosa, sobre frutos, tubérculos, hojas o
tallos. (STACKMAN, 1960)

d) Imagen y nombre del síntoma Descripción del síntoma

observado
Los síntomas en los frutos comienzan
como lesiones circulares acuosas y
levemente hundidas que luego toman un
color cremoso. (WALLER 2002)

e) Imagen y nombre del síntoma Descripción del síntoma

observado
 aparecen las hojas pequeñas (2-3
mm).
 aparecen manchas redondas.
 oscuras con el centro más claro.

Pág. Nº 52
 MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

 formándose puntos negros en los

tallos.
 las Manchas son rodeadas
poniendo amarillo el tejido.
 Si el número de manchas es alto,
estas, se unen y forman áreas
necróticas grandes que acaban por
matar a la hoja.

V.- TRABAJO ENCARGADO:

Leer el artículo científico asignado referente a aislamiento de bacterias que afectan

plantas y conteste lo siguiente:
1. Mencione los materiales y métodos de la investigación.
Los materiales utilizados en la investigación Se realizaron tres muestreos del género
Bacillus en el cultivo del arroz, biofertilizados. Las muestras se tomaron de plantas
de aproximadamente quince días después de germinadas.
Métodos:
 Aislamiento. - Para el aislamiento se utilizó el modelo microcosmos (Kabir et
al. 1995). Se desinfectaron las semillas de arroz (Oryza sativa L.). Las
semillas desinfectadas se colocaron en cámaras húmedas entre tres y cinco
días para su pre germinación y se sembraron en la columna con suelo
rizosférico de este cultivo. Las columnas se colocaron a temperatura ambiente
durante catorce días, en un fotoperiodo de ocho horas de luz y catorce de
oscuridad. Las cepas aisladas se conservaron en tubos con agar nutriente y
en glicerol al 20% a -20°C.

 Determinación de la solubilización de fosfatos. - La determinación

cualitativa de la solubilización de fosfatos se llevó a cabo por siembra directa
en el medio de cultivo NBRIP.

 Cuantificación de la solubilización de fosfatos. - Para la cuantificación de

fosfato soluble en medio NBRIP líquido se siguió la metodología utilizada por
Alikhani et al. (2007) y la misma se realizó a 0, 24, 48 y 42 horas de
incubación a 37°C y bajo condiciones de agitación y por triplicado.
2. Explique brevemente los resultados de la investigación.

Pág. Nº 53
 MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

Se obtuvieron 58 aislados, distribuidos entre la rizosfera y el interior de

raíces y hojas, en los dos cultivares de arroz muestreados: IACuba 30 y
Perla.
Se obtuvieron 34 aislamientos del cultivar Perla y 24 del cultivar IACuba 30,
distribuidos entre 36 de la rizosfera, 16 del interior de las raíces y 4 del
interior de las hojas.
La mayoría de los aislamientos obtenidos son rizosféricos donde existe
mayor diversidad de microorganismos que en el interior de la planta.
En este sentido, se plantea que los géneros Bacillus y Pseudomonas
predominan en la rizosfera por encima del resto de los géneros asociados
a la misma
VI.- BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA:

STACKMAN, 1960.Costras en frutos.

(WALLER 2002). https://www.google.com/search?q=lesiones+en+frutos.
https://slideplayer.es/slide/1021828/tumures vegetales.
https://www.google.com/search?q=sintomas+Manchas

Pág. Nº 54