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PRACTICA 6: ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LOS HONGOS

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ANÁLISIS MICROBIOLOGICO HONGOS

PRACTICA Nº 6

ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE LOS HONGOS

I.- INTRODUCCIÓN a) OBSERVACIÓN DE LOS HONGOS Frecuentemente pueden observarse crecimiento de hongos sobre los alimentos y otros materiales. Se examinan estos sustratos con un lente simple pueden distinguirse el cuerpo vegetativo formado por una masa de filamentos ramificados e interlazados denominada Micelio. Cada filamento de micelio constituye una Hifa. En algunos hongos, el protoplasma recorre las hifas en forma interrumpida, constituyendo hifas Aceptadas o Cenociticas. Las hifas de otros hongos tienen paredes transversales llamadas septos con uno o varios poros que permiten el paso del protoplasma. A este tipo de hifas se les denomina Septadas. Los hongos se reproducen asexualmente a través de esporas asexuales desarrolladas dentro de un esporangio, se denominan Esporangiosporas. Si las esporas se reproducen libremente en el extremo o al lado de las hifas, se denominan Conidiosporas. Existen hongos unicelulares que no forman estructuras filamentosas, estos reciben el nombre de levaduras y pueden distinguirse de las bacterias por su mayor tamaño y por la presencia de un núcleo simple. Ocasionalmente puede observarse el desarrollo de estructuras conspicuas denominadas Cuerpos Fructíferos los cuales portan las esporas sexuales de reproducción. Estas estructuras se utilizan como base de la clasificación natural de los hongos. De esta manera se Ascomicota y Basidiomycota. definen tres divisiones: Zygomicota,

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El micelio de los Zygomycota es aceptado excepto en las estructuras de reproducción. Los miembros de esta división forman esporas asexuales de tipo esporangiosporas. Las esporas sexuales son la denominadas Zigosporas que desarrollan en ausencia de un cuerpo fructífera. Los hongos al igual que la mayoría de las bacterias son heterótrofos, ningún hongo es capaz de crecer bien en ausencia de sustancias alimenticias orgánicas. Ningún hongo posee pigmentos fotosintetizantes y ninguno es capaz de utilizar el dióxido de carbono. Sin embargo, en presencia de un suministro exterior de azucares de otro alimento orgánico, muchos hongos exhiben una sorprendente capacidad de síntesis y produce una gran variedad de sustancias orgánicas complejas. La mayor parte de hongos son filamentosos. Los filamentos conocidos por hilos están ordinariamente muy ramificados y forman colectivamente el talo vegetativo o Micelo. En los hongos superiores las hifas pueden agregarse para formar estructuras sólidas complejas que en algunas especies pueden alcanzar un tamaño muy considerado. Los Ascomycotas tienen micelio septado. La reproducción asexual es muy variada involucrando procesos de fisión, gemación, fragmentación, formación de Clamidiosporas o formación de conidias, dependiendo de las especies y de las condiciones ambientales. La fisión y la gemación son comunes en levaduras mientras que la mayoría de ascomicetos forman uno o varios grupos de esporas terminales Esterigmas. Las esporas sexuales son llamadas Ascosporas desarrolladas dentro de sacos y protegidos en cuerpos fructíferos denominados Ascoscarpos. Estas estructuras pueden ser de tres tipos: CLEISTOTECIO, PERITECIO Y APOTECIO, dependiendo de las características de cada grupo de Ascomycota.
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llamadas

Conidia que desarrollan a partir de hifas ramificadas llamadas Conidioforos y

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Los presentantes de los Basidiomycota incluyen especies filamentosas levaduriforme. Entre las formas filamentosas y levaduriforme. Entre las formas filamentosas puede encontrarse especies microscópicas y macroscópicas. Estas últimas forman cuerpos fructíferos visibles que portan las Basidias y estas a las Basidiosporas o esporas sexuales. Los basidiomicetos se reproducen asexualmente a través de conidias, el micelio es septado y mayormente constituido en porciones anastomosadas a manera de pseudotejido, que forma los Cuerpos. Fructiferos.

b) HABITAD: Los hongos ocupan una amplia variedad de ambientes. La mayoría ocupa los lugares húmedos de la tierra, aunque algunos en particular las especies de Aspergillus, Penicillum pueden resistir unas condiciones de mayor sequedad. Muchos hongos son parientes activos de plantas, incluso de las más importantes plantas cultivadas y algunas especies causan enfermedades en el hombre y en los animales domésticos. C) REPRODUCCIÓN: La reproducción en los hongos se realiza habitualmente por esporas. Los más frecuentes son unas células aisladas incoloras, pero pueden poseer gruesas membranas esculpidas pueden llamar apéndices o pueden estar rodeadas de una cubierta gelatinosa. La mayor parte de los hongos producen mas de una especie de esporas, cuando las condiciones son favorables al crecimiento de estas. La mayoría de los hongos son muy variables, tanto en condiciones naturales como en el cultivo de laboratorio. Algunas veces la variación esta inducida por cambios en las condiciones ambientales y el hongo regresa a la forma manual cuando revierten los cambios ambientales.
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También ocurren al tener una base genética de los cultivos de placas petri se pueden producir sectores que difiere del resto del cultivo con algunas características, como la forma, el color, la velocidad de crecimiento y la intensidad de esporulación. d) VARIACIÓN AMBIENTAL: Los hongos son afectados por muchas influencias ambientales, como la naturaleza y la concentración del suministro nutritivo, la humedad, la temperatura, la luz y la concentración de hidrogeniones. Los cambios de estos factores pueden inducirnos cambios tan grandes en la morfología, que hace difícil el reconocimiento del hongo. e) VARIACIÓN GENETICA: Los estudios recientes sobre las bases genéticas de la variación en los hongos han demostrado que son validos los mismos principios que para los organismos superiores.

II.- OBJETIVOS: Observar el desarrollo de hongos miceliares frecuentes.  Aislar en medio de cultivo los diferentes géneros de hongos que frecuenta el medio ambiente y determine sus características.  Determinar las características del desarrollo vegetativo de los hongos a través de un cultivo en cámara húmeda y mediante observaciones periódicas al microscopio. y levaduriformes y

sustratos de diferentes orígenes e identificación de los géneros mas

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III.- MATERIALES Y METODOS Material infectado Lamina porta y cubre objeto Solución colorante: azul de metileno Dispositivo para cultivo en cámara húmeda Asa de siembra con mango de kolle Tubos de ensayo con tapa estériles Placa petri Pyrex estériles Agua destilada estéril Gradilla de tubos Lunas de reloj, espátula y baguetas Vasos precipitados y Erlenmeyers Probetas y Pipetas estériles Goteros Varilla de Vidrio en *U* Gillette estéril Mechero Bunsen Incubadora Estufa Autoclave Balanza Analítica Microscopio Aceite de Inmersión.

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Reactivos y medios de cultivo Agua destilada Agua Peptonada Agar Saboraud Agar Nutritivo Agar Plate Count 124
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IV.- PROCEDIMIENTOS 1.- OBSERVACIÓN DE HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS a).- OBSERVACIÓN MACROSCOPICA Observe cuidadosamente cada substrato infectado y determine el tipo de colonia que desarrolla.  Describa el aspecto externo de las colonias de hongos.

b).- OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA Coloque una gota de azul de metileno en una porta objetos limpio y drenado.  Con ayuda del asa de kolle en forma de gancho o de un estilete, extraiga una pequeña cantidad del micelio de una muestra y colóquelo en la gota de colorante.    Coloque sobre la preparación la lamina cubre objeto. Observe al microscopio bajo el objetivo de 10-40 de aumento. Reconozca las estructuras más características del cuerpo vegetativo del hongo.  Con la ayuda de láminas referentes trate de identificar él o los géneros que observe. 2.- AISLAMIENTO DE HONGOS DEL MEDIO AMBIENTE Elija un punto determinado del ambiente que quiera evaluar. Destape la placa petri exponiendo el medio de cultivo al aire (se asume que las esporas de hongo se encuentran suspendidas). El tiempo de exposición puede ser de 5 a 10 minutos, vuelva a tapar la placa, identifíquela con su nombre, grupo y el lugar de muestreo.   Trabaje de manera similar para cada placa y lugar. En el laboratorio incube las placas en una estufa de 30 ºC por 4 a 5 días. 125
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Transcurrido el tiempo, examine las placas y realiza una descripción detallada de las mismas.

2.1.- PREPARACIÓN DE MEDIOS a).- Preparación del Agar Nutritivo.- Pesar 2 gr. de agar nutritivo y disolverlo en 100 ml de agua destilada. Licuarlo y luego colocar 9 ml de este en 3 tubos y luego esterilizar. b).- Preparación de Agua Peptonada.- Pesar peptona al 0.1% para 120 ml de agua destilada, es decir pesar 0.012 gr. de peptona. Luego colocar también 9 ml en 3 tubos y luego llevar a esterilizar en la autoclave a temperatura de 121ºC por un espacio de 15 minutos. 2.2. - CONTEO EN PLACAS En teoría, la enumeración de bacterias y hongos en muchos tipos de especimenes, se basa en el supuesto de que cada microorganismo dará origen a una colonia después de la incubación en medios adecuados. Una cantidad medida del especimen o de una dilución de la misma mezcla en una placa petri esterilizada que contiene agar derretido. Después de la incubación se cuenta el número de colonias que están creciendo en el agar, para obtener el cálculo de la población bacteriana del espécimen original. Aunque existen diversos factores que limitan contra este como un método inexacto, la técnica es sencilla y rinde resultados bastante satisfactorios para el uso rutinario. Observe la placa contra el fondo iluminado y cuente él número de colonias. Multiplique el número de colonias por la dilución de la muestra. Escoger la placa que contenga 30 – 300 colonias.

Para evitar una actitud física y sin embargo expresar los resultados numéricos mediante un método conforme con la precisión de la técnica empleada, el GUIA DE LABORATORIO Biol. Ms. C. Alicia Decheco Egusquiza 126
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número registrado de bacteria por ml no debe incluir más de 2 cifras significativas. Por ejemplo un conteo de 142 se registra como 140 y un conteo de 155 como 160 y mientras que un conteo de 35 se registra como 35. 3 .- CULTIVO EN CAMARA HUMEDA Un dispositivo para cultivo en cámara húmeda es un sistema que consta de una placa petri conteniendo un disco de papel filtro y una varilla de vidrio de “U” que soporta dos laminas porta y cubre objetos. Asépticamente se selecciona una pequeña porción de medio de cultivo estéril (Agar Saboraud), y se coloca sobre la lámina porta objetos. Realizada la siembra del hongo en estudio, la preparación se cubre con la otra lamina y el papel filtro humedece conservando la asepsia. La placa es incubada a temperatura ambiente (20 – 25º C) por 4 a 5 días.

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PROCEDIMIENTO 1. Utilizando aguja de kolle o estilete, pique una colonia y extraiga una fracción mínima de esporas o micelio. 2. En forma aséptica deposite esta fracción sobre la porción de agar dispuesta en el porta objeto de la cámara húmeda. 3. Con la ayuda de una pinza estéril cubra cuidadosamente la preparación con la lamina cubre objetos. 4. Humedezca el papel filtro de la placa con agua destilada estéril. 5. Incube la placa a temperatura ambiente (20 – 25 º C). 6. Examine diariamente al microscopio la lámina sembrada hasta verificar el completo desarrollo del hongo. Retire cada vez la lamina de cultivo de la cámara húmeda y una vez realizada la observación vuélvala a su lugar cuidando de mantener la humedad constante, si es necesario añada mas agua al sistema. 7. Observa la germinación de las esporas, el crecimiento y ramificación del micelio, la aparición de hifas diferenciadas y el desarrollo de las estructuras de reproducción. 8. Con la ayuda de un manual de identificación de hongos determine el género correspondiente. 9. Elabore en detalle los esquemas de cada etapa de desarrollo.

VI- RESULTADO Y DISCUSION VII.- RECOMENDACIONES VIII.-CONCLUSIONES

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IX.- CUESTIONARIO: 1. Defina: Factores intrínsicos, Factores extrínsecos, microorganismos endógenos, microorganismos exógenos. 2. ¿Qué consideraciones se deben tener para elegir la Temperatura de incubación? 3. Explique los microorganismos como productores de almidón. 4. ¿Cuáles son los controles de calidad que se realizan durante la elaboración de productos de confitería. 5. Explique sobre las levaduras.

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