Análisis de los efectos de detergente sobre el organismo de prueba Allium

cepa
ARÉVALO LOZANO, Sebastián
sebastian.arevalo.l@uni.pe

Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental. Facultad de Ingeniería Ambiental. Universidad

Nacional de Ingeniería Ambiental. Av. Túpac Amaru 210 - Rímac. Apartado 1301. Lima-Perú.
28 de noviembre de 2021

RESUMEN
Se determinó experimentalmente la toxicidad de un detergente detergentes doméstico,
empleando a Allium cepa como organismo de prueba. Se utilizó el programa Excel y
RStudio para poder determinar datos estadísticos como el ANOVA (con un intervalo de
confianza de 95 %), Test Tukey, Test Dunet, entre otros. Los resultados que se obtuvieron
fueron los de CL50%, LOEC y NOEC. Finalmente, el uso de la prueba de Allium cepa como
biomarcador en ensayos de genotoxicidad y biotoxicidad es reconocido mundialmente. En
este trabajo se propone el uso de la prueba como indicador para analizar la efectividad de
los tratamientos que las industrias realizan en su líquido efluentes antes de descargarlos al
sistema de alcantarillado general.
Palabras clave: Allium cepa test, Test ANOVA, grado de inhibición, bioensayo,
comparación de medidas.

INTRODUCCIÓN
Los detergentes ocasionan varios
impactos sobre el ambiente como es la
eutrofización, debido a los altos niveles de
fósforo procedentes del tripolifosfato,
principal ingrediente de las formulaciones
detergentes. Además, pueden aumentar
los niveles de cloro y de compuestos
organoclorados; algunos posiblemente de
carácter tóxico y carcinógeno.
La importancia del Allium cepa test radica
en que es un excelente modelo de ensayo
in vivo, donde es posible evaluar el daño
producido por una sustancia o solución de
interés sobre el crecimiento de las raíces
y sobre el ADN vegetal. Es ventajoso el
uso del Allium cepa test por emplearse
como indicador una planta vascular, que
permite configurar un modelo excelente
para realizar ensayos sobre sustancias
contaminantes, mutagénicas
cancerígenas cuyos datos pueden ser
extrapolados a toda la biodiversidad de
plantas y animales.
PARTE EXPERIMENTAL
Cuando un bulbo de cebolla (Allium cepa)
se rehidrata se produce una estimulación
del crecimiento de las células, lo cual
permite la elongación de las raíces de la
planta. Sin embargo, cuando la
hidratación se lleva a cabo en presencia
de sustancias tóxicas, la división celular
de los meristemos radiculares puede
inhibirse, ya sea retardando el proceso de
mitosis o destruyendo las células. Este
tipo de alteraciones generalmente impide
el crecimiento normal de la raíz, y por
tanto su elongación. El efecto puede
determinarse en forma indirecta,
mediante la comparación de la elongación
o de las raíces de cebollas expuestas al
compuesto tóxico contra la de cebollas no
expuestas, luego de un período de tiempo Las disoluciones están conectados a la
(en el caso expuesto se tomó 15 días de distribución de los grupos:
exposición). La cuantificación del efecto
se realiza estableciendo el porcentaje de
inhibición del crecimiento de las raíces
respecto a la longitud promedio de las
raíces del control.

MATERIALES Figura 2: Concentraciones

- Detergente Marsella (sustancia Es importante mencionar que el

tóxica) bioensayo se dio durante 15 días en el
- Cebolla roja (Allium cepa) distrito de San Miguel – Lima. A una
- Vasos de plástico temperatura promedio 18°. Una vez
- Bandeja para mezclar culminado el tiempo de exposición del
- Medidor de vidrio organismo frente al contaminante, se
- Escalímetro procedió a medir, con la ayuda de un
- Agua mineral contaminante, las raíces con mayor
significancia. Con el objetivo de analizar
PROCEDIMIENTO esos resultados mediante Excel y poder
tener datos estadísticos y determinar el
Se colocaron 4 organismos de Allium CL50%, NOEC y LOEC.
cepa de tamaño homogéneo en 4 grupos:
BLANCOS, C1, C2, C3 y C4.
Tabla 1. Condiciones recomendadas para
las pruebas de toxicidad con Allium cepa
Tipo de ensayo Estático
Temperatura 18 °C ambiente
Iluminación Indirecta
Recipientes de Vasos con tamaño
prueba que encaje el
organismo
Número de 20
réplicas
Material Cebollas de
biológico tamaño
homogéneo
Agua de dilución Agua mineral
Duración de la 1 a 2 semanas
prueba
Efecto medido % de inhibición
Resultado final CL50, NOEC,
LOEC
Figura 1: Distribución de las
muestras
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Al término del período de exposición se registra la longitud de las raíces, medición que se
lleva a cabo con un escalímetro.

Tabla 2: Datos de raíces

BLANCO R1 9.9 10.3 11.6 10.9 9.7
BLANCO R2 11.2 10.5 10.9 10.7 11.1
BLANCO R3 10.5 10.8 10.7 9.6 11.6
BLANCO R4 11.5 10.5 10.8 11.1 9.6
C1 R1 7.4 7.2 8.3 8.7 7
C1 R2 8.2 7.3 8 7.6 7.8
C1 R3 7.9 7.1 8.1 7.7 8.6
C1 R4 8.6 7.6 8 7.9 8.4
C2 R1 4 3.5 4.5 3 3.9
C2 R2 3.3 2.8 3.4 3.6 3.1
C2 R3 3.5 2.7 3 2.4 2.9
C2 R4 2 2.4 2.8 3 2.5
C3 R1 1.9 1.5 1.3 1 1.6
C3 R2 1.1 1 1.8 1.6 0.9
C3 R3 0.8 2.5 1.4 1.9 0.8
C3 R4 1.3 2.2 0.7 1.7 2.1
C4 R1 0.5 0.4 0.8 0.1 0.6
C4 R2 0.2 0.2 0.6 0.8 0.9
C4 R3 0.1 0.8 0.4 0.9 1.5
C4 R4 0.2 0.7 0.9 0.3 1.1

Tabla 3: Datos promedio

BLANCO C1 C2 C3 C4
10.48 7.72 3.78 1.46 0.48
10.88 7.78 3.24 1.28 0.54
10.64 7.88 2.9 1.48 0.74
10.7 8.1 2.54 1.6 0.64
Posteriormente, esos datos promedio se analiza mediante Excel. El primer paso es analizar
los datos de dispersión y determinar si pertenecen a una distribución normal

Tabla 4: Datos de dispersión

BLANCO C1 C2 C3 C4
Mean 10.675 7.87 3.115 1.455 0.6
Standard Error 0.08261356 0.08346656 0.26373914 0.06601767 0.05715476
Median 10.67 7.83 3.07 1.47 0.59

Standard
Deviation 0.16522712 0.16693312 0.52747828 0.13203535 0.11430952
Sample Variance 0.0273 0.02786667 0.27823333 0.01743333 0.01306667
- -
Kurtosis 0.87423687 0.96687347 0.26993934 1.63915344 1.64868805
Skewness 0.17336554 1.15566438 0.43601193 -0.6646925 0.38563395
Range 0.4 0.38 1.24 0.32 0.26
Maximum 10.88 8.1 3.78 1.6 0.74
Minimum 10.48 7.72 2.54 1.28 0.48
Sum 42.7 31.48 12.46 5.82 2.4
Count 4 4 4 4 4
Geometric Mean 10.6740417 7.86868271 3.08188998 1.45039446 0.59191817
Harmonic Mean 10.6730842 7.86737608 3.04942985 1.44568358 0.58402375
AAD 0.115 0.12 0.395 0.0875 0.09
MAD 0.11 0.08 0.35 0.07 0.08
IQR 0.145 0.17 0.565 0.095 0.14

Tabla 4: Datos Box plot

BLANCO C1 C2 C3 C4
Min 10.48 7.72 2.54 1.28 0.48
Q1-Min 0.12 0.045 0.27 0.135 0.045
Med-Q1 0.07 0.065 0.26 0.055 0.065
Q3-Med 0.075 0.105 0.305 0.04 0.075
Max-Q3 0.135 0.165 0.405 0.09 0.075
Mean 10.675 7.87 3.115 1.455 0.6
 Figura 3: Box plot

Box Plot
12

10

0
BLANCO C1 C2 C3 C4

Este resultado demuestra de forma gráfica que hay un efecto del contaminante sobre el
organismo. El siguiente paso es descartar datos que no tengan un efecto considerable. Es
por ello que se realizó dos test: El test de Shapiro y el test de Grubbs, con el objetivo de
calcular datos atípicos

Tabla 5: Test Shapiro

BLANCO C1 C2 C3 C4
W-stat 0.99135462 0.9238247 0.99023176 0.95304273 0.97442794
p-value 0.96430375 0.55859756 0.95865232 0.73516397 0.86867989
alpha 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
normal yes yes yes yes yes

Tabla 6: Test Grubbs

alpha 0.05
outlier 10.88
G 1.53560987
G-crit 2.55658133
sig no

El primer test indica que los datos pertenecen a una distribución normal y el segundo test
demuestra que se pueden tomar todos los datos medidos ya que cumplen con la condición
que hacen efecto considerable sobre el contaminante.
 Una vez terminado el análisis de los datos de dispersión y eliminación de datos atípicos, se
procede a establecer diferencias entre los tratamientos. Para esto se aplicó el análisis
estadístico ANOVA con 95% de grados de libertad.

Tabla 7: Test ANOVA

DESCRIPTION Alpha 0.05
Group Count Sum Mean Variance SS Std Err Lower Upper
BLANCO 4 42.7 10.675 0.0273 0.0819 0.13488884 10.3874912 10.9625088
C1 4 31.48 7.87 0.02786667 0.0836 0.13488884 7.58249124 8.15750876
C2 4 12.46 3.115 0.27823333 0.8347 0.13488884 2.82749124 3.40250876
C3 4 5.82 1.455 0.01743333 0.0523 0.13488884 1.16749124 1.74250876
C4 4 2.4 0.6 0.01306667 0.0392 0.13488884 0.31249124 0.88750876

ANOVA
Sources SS df MS F P value Eta-sq RMSSE Omega Sq
Between
Groups 302.37012 4 75.59253 1038.64427 3.9631E-18 0.99640251 16.1140022 0.9952045
Within Groups 1.0917 15 0.07278
Total 303.46182 19 15.9716747

Observación: Como el Pvalue es menor que 0.05, entonces un tratamiento, por lo menos
es diferente.

Posteriormente, para establecer diferencias entre los tratamientos y el control negativo se

realizan dos test importantes: Test Dunnett y Test Tukey

Tabla 7: Test Tukey

TUKEY HSD/KRAMER alpha 0.05
group mean n ss df q-crit
BLANCO 10.675 4 0.0819
C1 7.87 4 0.0836
C2 3.115 4 0.8347
C3 1.455 4 0.0523
C4 0.6 4 0.0392
20 1.0917 15 4.367
 Q TEST
group 1 group 2 mean std err q-stat
BLANCO C1 2.805 0.13488884 20.7949
BLANCO C2 7.56 0.13488884 56.0461475
BLANCO C3 9.22 0.13488884 68.3525767
BLANCO C4 10.075 0.13488884 74.6911291
C1 C2 4.755 0.13488884 35.2512475
C1 C3 6.415 0.13488884 47.5576768
C1 C4 7.27 0.13488884 53.8962292
C2 C3 1.66 0.13488884 12.3064292
C2 C4 2.515 0.13488884 18.6449816
C3 C4 0.855 0.13488884 6.3385524

OBSERVACIÓN: Todos los q-stat > q crit , por lo tanto todos los tratamientos son
diferentes entre sí

Tabla 8: Test Dunnett

DUNNETT'S TEST alpha 0.05
group mean size ss df d-crit
BLANCO 10.675 4 0.0819
C1 7.87 4 0.0836
C2 3.115 4 0.8347
C3 1.455 4 0.0523
C4 0.6 4 0.0392
20 1.0917 15 2.727
D-TEST
group mean std err d-stat
C1 2.805 0.19076163 14.7042148
C2 7.56 0.19076163 39.630611
C3 9.22 0.19076163 48.3325705
C4 10.075 0.19076163 52.8146039

OBSERVACIÓN: Todos los d-stat > d crit , por lo tanto todos los datos se pueden incluir
para la curva de DOSIS/RESPUESTA.

Finalmente, con los datos analizados con los diferentes test, se calcula el porcentaje de
inhibición utilizando las medias: se sustrae la medida de la raíz de cada tratamiento de la
medida del control y se divide entre la medida de la raíz del control por 100
 Tabla 9: Datos Curva/respuesta
BLANCO C1 C2 C3 C4
Mean 10.675 7.87 3.115 1.455 0.6
Standard Error 0.08261356 0.08346656 0.26373914 0.06601767 0.05715476
Median 10.67 7.83 3.07 1.47 0.59

Figura 4: Curva Dósis/respuesta

Tabla 10: Resultado %INHIBICIÓN %INHIBICIÓN: CURVA DÓSIS VS

CONCENTRACIONES %DILUCIÓN %INHIBICIÓN RESPUESTA
C1 0.0015 26.2763466 100
C2 0.0093 70.8196721 80
C3 0.015 86.3700234
60
C4 0.025 94.3793911 y = 2808.2x + 33.797
40 R² = 0.8347

20

0
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03

Para el cálculo del CI50, se reemplaza los datos en la ecuación de correlación. El resultado
es el siguiente:

%I (50%) 0.00576989

Para el cálculo del LOEC y NOEC, se utilizó el programa RStudio.

OBSERVACIÓN: Los resultados de la prueba de comparación, indican que el NOEC (que

es la concentración más alta de tóxico, de las empleadas en un bioensayo, que no causa
un cambio estadísticamente significativo en el valor de la variable dependiente) es de
0.0015%. Por otro lado, el LOEC (que es la concentración más baja de tóxico, de las
empleadas en un bioensayo, que causa un efecto estadísticamente significativo en el valor
de la variable dependiente) es de 0.093%.
DISCUSIÓN
La evaluación ecotoxicológica del
detergente Marsella sobre el organismo
de prueba Allium cepa, ha resultado de
gran interés, ya que los datos del presente
estudio muestran que el grado de
toxicidad del detergente va en aumento a
medida que se aumenta la dilución (figura
3: Box Plot). Existe el riesgo de que este
detergente cause efectos adversos a los
organismos a gran escala.
La evaluación del riesgo ecológico del
detergente dependerá de las condiciones
ambientales y el tiempo de exposición del
organismo frente al contaminante.
Durante los 15 días de análisis, los
resultados detallan que el detergente es
nocivo y perjudicial para el organismo de
prueba.
Para el caso del ANOVA (que fue el
estadístico principal para hallar diferentes
entre tratamientos), los resultados indican
que entre los tratamientos si hay
diferencias significativas y por lo tanto se
todos los datos medidos, se podrán incluir
en la curva de DOSIS/RESPUESTA.
Si nos basamos en los resultados de
medición de las raíces de la cebolla, al
medir con el escalímetro las raíces del
BLANCO y la C4, existe una gran
diferencia de tamaño entre estas dos.
Esto significa que la mortalidad aumenta
a mayor concentración de dilución.
Si analizamos el resultado de CI50 (esta
medida indica la concentración a la que un
contaminante es capaz de inhibir un
proceso biológico concreto en un 50%), el
resultado es de una concentración de
detergente del 0.005766889% ≈ 0.0058%.
Y si tomamos en cuenta la curva
DOSIS/RESPUESTA, se demuestra que
es alto el efecto del contaminante sobre
Allium cepa.
Por último, este bioensayo de
ecotoxicidad demostraron que Allium
cepa es sensible al detergente Marsella
expuesto a un tiempo de 15 días. Es por
ello que se recomienda exponer durante
menos tiempo el organismo frente al
contaminante, para tener más variabilidad
de resultados y poder determinar el efecto
a gran escala del detergente y poder
establecer formas de reducción de
contaminación del detergente. Por
ejemplo: reemplazar detergentes
normales por detergentes
biodegradables, que son aquellos que
contienen surfactantes que se
descomponen en un corto tiempo y que al
ser consumida por la propia naturaleza y
los microorganismos que contienen,
tardan poco tiempo en desaparecer,
evitando la contaminación del agua y la
acumulación en ríos o vertederos.
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos a partir de la
aplicación del test de Allium cepa, ha
permitido evaluar la biotoxicidad que
tuvieron los tratamientos aplicados.
El análisis progresivo de los datos de
medición de las raíces durante 15 días,
fueron inspeccionados gracias al
programa Excel y ayudó a un mejor
entendimiento del contaminante frente al
organismo. Ya que permitió conocer la
curva de DÓSIS/RESPUESTA, el LOEC,
el NOEC y el CI50.
La realización correcta de un bioensayo,
permitirá mejorar el diseño del
tratamiento, muchas veces con ahorro en
recursos económicos y optimización de
los resultados ambientales
FUENTES

Mean lethal concentration (LC50) of four Figura 7: Marcación de vasos

biodegradable household detergents in
Laeonereis culveri (Webster 1879)
(Polychaeta: Annelida)

Evaluating the Use of Bioindicators and

Bioassays as Techniques for Water
Quality Monitoring at the Community
Level

ANEXOS

Figura 5: Materiales

Figura 8: Exposición al ambiente

durante 15 días

Figura 6: Cebollas homogéneas

Figura 9: Raíces significativas Figura 10: Raíces significativas Figura 11: Raíces significativas
(BLANCO) (C1) (C2)

Figura 12: Raíces significativas Figura 13: Raíces significativas Figura 14: Raíces significativas
(C3) (C4) 5 tratamientos