Determinación de coliformes totales y

termotolerantes
I. INTRODUCCIÓN
Las bacterias del grupo de los coliformes totales que son capaces de
fermentar lactosa a 44-45 ºC se conocen como coliformes termotolerantes. En la
mayoría de las aguas, el género predominante es Escherichia, pero algunos tipos
de bacterias de los géneros Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter también son
termotolerantes. Escherichia coli se puede distinguir de los demás coliformes
termotolerantes por su capacidad para producir indol a partir de triptófano o por
la producción de la enzima β-glucuronidasa. E. coli está presente en
concentraciones muy grandes en las heces humanas y animales, y raramente se
encuentra en ausencia de contaminación fecal, aunque hay indicios de que
puede crecer en suelos tropicales. Entre las especies de coliformes
termotolerantes, además de E. coli, puede haber microorganismos ambientales.
(Fewtrell y Bartram 2001)

Se considera que Escherichia coli es el índice de contaminación fecal más

adecuado. En la mayoría de las circunstancias, las poblaciones de coliformes
termotolerantes se componen predominantemente de E. coli; por lo tanto, este
grupo se considera un índice de contaminación fecal aceptable, pero menos
fiable que E. coli. (Fewtrell y Bartram , 2001)

Escherichia coli (o bien los coliformes termotolerantes) es el microorganismo

de elección para los programas de monitoreo para la verificación, incluidos los
de vigilancia de la calidad del agua de consumo.
(Fewtrell y Bartram , 2001)

La evaluación de la Numeración de Coliformes Totales y Termotolerantes

por el Método de Tubos Múltiples (NMP), es un método se basa en el principio
de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El
método requiere la realización de una serie de diluciones en serie de la muestra
de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo
de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos
y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una
o más células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios,
mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán
transparentes. Se calcula mediante una tabla de acuerdo a la serie y dilución o
alícuotas según se utilice. (Apha, 1995)

Según el Instituto de Investigación Tecnológica Industrial y de Normas

Técnicas (ITINTEC) desarrolló la Norma Técnica Peruana (NTP) 214.003 “Agua
Potable: Requisitos”. La cual establece los requisitos físicos, químicos,
organolépticos y microbiológicos que debe cumplir el agua para ser considerada
potable. En esta NTP se consideran “Requisitos biológicos” para el agua y dentro
de ellos se considera la ausencia de Parásitos y Protozoarios para el agua
potable y “valor máximo admisible” para los requisitos microbiológicos: Recuento
total: 500 UFC/mL, Coliformes totales: Ausencia y Coliformes Fecales: Ausencia.
(Aycachi, 2011)

Según el reglamento de la calidad del agua para consumo humano (D.S. N°

031-2010-SA), nos muestra en la siguiente tabla los límites máximos permisibles
de parámetros microbiológicos y parasitológicos:
II. OBJETIVOS
 Conocer, aprender y desarrollar la técnica de Número Más Probable (NMP
– serie 5) con diferentes alícuotas para el respectivo análisis de agua.
 Determinar el número bacterias coliformes totales, coliformes
termotolerantes, mediante la técnica del Número Más Probable (NMP) en
el respectivo análisis de agua.

III. MATERIALES
a. Medios de Cultivo
 Caldo brila

b. Materiales de Laboratorio
 Campana de Durham  Frascos de Papilla
 Placas  Gradilla
 Tubos de dilución  Pipetas de 10 y 1 mL.
 Tubos bioquímicos  Mechero.

c. Muestra: pescado “jurel”

IV. METODOLOGÍA
 Preparar la muestra: Homogenizar mediante licuado con licuadora esteril
luego realizar suspensiones para posteriormente proceder a la siembra
en el caldo brila
A. MÉTODO PARA COLIFORMES TOTALES:
 Colocar en cada uno de los 5 tubos con caldo brila concentrado más
campana de Durham, 10 mL de muestra de agua. (Primera serie).
 Incubar los tubos a 35ºC por 24 - 48 h (Primera y Segunda lectura).
 Lectura: Resultados positivos: Turbidez y producción de gas.

 Análisis confirmativo: todos los tubos positivos se siembran en

placas con Agar ENDO. Incubar las placas por 24 h a 35ºC.
 Lectura: Las colonias positivas: presentar brillo metálico.

 Los resultados obtenidos deben llevarse a la Tabla de NMP.

B. PARA COLIFORMES TERMOTOLERANTES:

 De los tubos Caldo brila con gas positivo, se toma una o dos (1 ó 2)
azadas y se siembra en tubos con Caldo E.C. + Campana de Durham.
 Incubar los tubos a 45ºC por 24h
 Lectura: Tubos positivos: producción de gas y turbidez.
 Los datos obtenidos deben ser llevados a la tabla para NMP.
 Seleccionar colonias características de las placas
 Realizar la identificación mediante pruebas bioquímicas: IMViC, TSI,
LIA.

V. RESULTADOS
COLIFORMES TOTALES

Los 05 tubos con caldo brilla + campana de

Durham sembrados con 10 mL de muestra,
el resultados fue positivo con presencia
de gas y turbidez en todos los tubos.
Como se observa en la siguiente figura

 La serie de la Prueba presuntiva en Caldo brila para Coliformes

Totales mediante NMP el resultado fue: 555
 Al ubicar la serie en la Tabla NMP, el resultado fue: > 1600 UFC/100
mL.
 Los 15 tubos positivos a la prueba presuntiva, se sembraron en Placas
con Agar ENDO para confirmar, por lo tanto los resultados obtenidos
fueron positivos, observándose colonias características: Brillo
Metálico y lactosa positivo en las siguientes figuras se observan:
 COLIFORMES TERMOTOLERANTES
 La serie de la Prueba presuntiva en caldo brila para Coliformes
Totales mediante NMP el resultado fue: 521
 Al ubicar la serie en la Tabla NMP, el resultado fue son: 70 UFC/100
mL.

VI. INTERPRETACIÓN
 En la prueba presuntiva para Coliformes Totales, mediante el método
del NMP se obtuvo > 1600 UFC/mL, lo cual supera a la Decreto
Supremo y normas mencionadas, lo cual indicando que el resultado
debe ser de 0 UFC/mL, indicando una posible contaminación fecal.
 En la prueba confirmativa para Coliformes Totales, se utilizó el Agar
ENDO en cual fue positivo en todas las placas, dando colonias
características.
 En la prueba para Coliformes termotolerantes mediante el método del
NMP se obtuvo 70 UFC/100 mL, al igual supera a las normas
establecidas mencionadas, siendo indicadores en la vigilancia de la
calidad de agua de consumo.
 La muestra analizada de conchitas por los resultados obtenidos indica
posible contaminación con materia orgánica, fecal u otra fuente, ya
 que no cumple con los reglamentos establecidos para ser apta al
consumo.

VII. CONCLUSIONES
 En la confrontación con los reglamentos mencionados con
anterioridad , la muestra: pescado “jurel” no cumple con condiciones,
superando en grandes cantidades su presencia, lo es considerada NO
APTA para el consumo humano, al igual no tienen estándares de
calidad.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Reglamento de la calidad de Agua para Consumo Humano: D.S.
N° 031-2010-SA / Ministerio de Salud. Lima: Ministerio de Salud
 Fewtrell L, Bartram J, (2001). La calidad del agua: Directrices,
normas y -Evaluación sanidad del riesgo y la gestión del riesgo
para enfermedades infecciosas relacionadas con el agua.
Londres: OMS
 Aycachi, R. (2011). Evaluación de la calidad microbiológica del
agua de las fuentes utilizadas para abastecimiento de agua
potable de la ciudad de Rioja – San Martín. Cajamarca:
Universidad Nacional de Cajamarca. Tesis de maestría
 Apha, Wef, Awwa. (2005). Standard Methods for the Examination
of Water and Wastewater. Washington DC: American Public Health
Association.

ANEXOS
 Tabla 1. Número más probable de bacterias por 100 g (ml) de material analizado
empleando cinco tubos inoculados con 10, 1 y 0.1 ml o g de material

Pos* NMP Pos* MPN Pos* MPN Pos* MPN Pos* MPN Pos* MPN
10;1;0,1 10;1;0,1 10;1;0,1 10;1;0,1 10;1;0,1 10;1;0,1
000 <1.8 100 2 200 4.5 300 7.8 400 13 500 23
001 1.8 101 4 201 6.8 301 11 401 17 501 31
002 3.6 102 6 202 9.1 302 13 402 21 502 43
003 5.4 103 8 203 12 303 16 403 25 503 58
004 7.2 104 10 204 14 304 20 404 30 504 76
005 9 105 12 205 16 305 23 405 36 505 95
010 1.8 110 4 210 6.8 310 11 410 17 510 33
011 3.6 111 6.1 211 9.2 311 14 411 21 511 46
012 5.5 112 8.1 212 12 312 17 412 26 512 64
013 7.3 113 10 213 14 313 20 413 31 513 84
014 9.1 114 12 214 17 314 23 414 36 514 110
015 11 115 14 215 19 315 27 415 42 515 130
020 3.7 120 6.1 220 9.3 320 14 420 22 520 49
021 5.5 121 8.2 221 12 321 17 421 26 521 70
022 7.4 122 10 222 14 322 20 422 32 522 95
023 9.2 123 12 223 17 323 24 423 38 523 120
024 11 124 15 224 19 324 27 424 44 524 150
025 13 125 17 225 22 325 31 425 50 525 180
030 5.6 130 8.3 230 12 330 17 430 27 530 79
031 7.4 131 10 231 14 331 21 431 33 531 110
032 9.3 132 13 232 17 332 24 432 39 532 140
033 11 133 15 233 20 333 28 433 45 533 180
034 13 134 17 234 22 334 31 434 52 534 210
035 15 135 19 235 25 335 35 435 59 535 250
040 7.5 140 11 240 15 340 21 440 34 540 130
041 9.4 141 13 241 17 341 24 441 40 541 170
042 11 142 15 242 20 342 28 442 47 542 220
043 13 143 17 243 23 343 32 443 54 543 280
044 15 144 19 244 25 344 36 444 62 544 350
045 17 145 22 245 28 345 40 445 69 545 440
050 9.4 150 13 250 17 350 25 450 41 550 240
051 11 151 15 251 20 351 29 451 48 551 350
052 13 152 17 252 17 352 32 452 56 552 540
053 15 153 19 253 26 353 37 453 64 553 920
054 17 154 22 254 29 354 41 454 72 554 1600
055 19 155 24 255 32 355 45 455 81 555 >1600

Fuente: ENUMERATION OF COLIFORMS, FAECAL COLIFORMS AND OF E.

COLI IN FOODS USING THE MPN METHOD MFHPB-19 April 2002 por Donna
Christensen Crawford y Rick Szabo