INTRODUCCIN A LAS TCNICAS CROMATOGRFICAS

La primera aplicacin que se conoce es la de Tswett a comienzos del siglo XX (1906).

Separ varios pigmentos de plantas tales como la clorofila y xantfilas, haciendo pasar
soluciones de estos compuestos a travs de una columna de vidrio rellena con carbonato de
calcio finamente dividido.

Las especies pueden

identificarse por sus colores,
de ah el nombre
cromatografa.
Hoy en da tiene poco que ver
con la separacin por colores.
Cada banda puede colectarse
separadamente y analizarse
cuali y cuantitativamente.

INTRODUCCIN A LAS TCNICAS CROMATOGRFICAS

Es un conjunto de tcnicas de separacin en las que los diversos componentes de la muestra,
se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es fija (FASE ESTACIONARIA) y la otra es
mvil (FASE MVIL). Esta distribucin es caracterstica para cada sustancia o componente,
por lo que se logra una separacin.
La fase estacionaria puede ser un slido o un lquido y la fase mvil puede ser un gas, un
lquido o un fluido supercrtico.
La forma del sistema cromatogrfico, la naturaleza de las fases mvil y estacionaria, y el
fenmeno fsico-qumico involucrado en la distribucin de los solutos entre las fases,
permiten clasificar las tcnicas.

CP
CCD
CGL CGS
CLL CLS, incluye CE (CPG, FG), CII, CB
(HPLC)
CFS

CROMATOGRAFA INSTRUMENTAL EN COLUMNA

CROMATOGRAFA LQUIDO-LQUIDO (CLL)

DE REPARTO O PARTICIN
La separacin se basa en la diferencia de
los coeficientes de particin (solubilidades)
para cada componente de la muestra entre
dos solventes inmiscibles, uno fijo e
inmovilizado en la superficie de un soporte
slido y otro mvil.
Ej.: CP La celulosa del papel forma
puente de H con agua retenida formando
la fase estacionaria. La fase mvil sube por
accin capilar, los componentes ms
solubles en la fase estacionaria sern ms
retenidos y se movern ms lentamente.

El FACTOR DE RETENCIN (Rf) se calcula

por la relacin entre las distancias
recorridas.

CROMATOGRAFA LQUIDO-LQUIDO (CLL)

DE REPARTO O PARTICIN
Existen dos tipos:
Fase Normal y Fase Inversa
CLL FN: fases estacionarias muy
polares, como el agua. Eluyente no
polar como el ter. Sale primero el
componente menos polar. Al
incrementar la polaridad de la fase
mvil, disminuyen los tiempos de
retencin.

CLL FI: Fase estacionaria no polar

(hidrocarburo). Fase mvil polar
como el agua. Sale primero el
componente ms polar. Al
disminuir la polaridad de la fase
mvil, disminuyen los tiempos de
retencin.

CROMATOGRAFA LQUIDO-SLIDO (CLS)

DE INTERCAMBIO INICO
La fase estacionaria est constituida por una matriz
(polimrica) con grupos funcionales ionizables.
Intercambiadores catinicos: con sitios cargados
negativamente.

Intercambiadores aninicos: con sitios

cargados positivamente.

CROMATOGRAFA LQUIDO-SLIDO (CLS)

DE EXCLUSIN POR TAMAO O PERMEACIN EN GELES
O FILTRACIN EN GELES
La fase estacionaria es una matriz (polimrica, ej: Sephadex)
inerte, con partculas de forma, tamao y porosidad uniformes.
Las molculas de menor tamao pueden entrar en los poros y por
eso son ms retenidas, las de mayor tamao pasan entre los
granos sin penetrar y son arrastradas por la fase mvil

CROMATOGRAFA LQUIDO-SLIDO (CLS) o GAS-SLIDO (CGS)

POR ADSORCIN
Se basa en la adsorcin selectiva de los componentes de la muestra sobre la fase
estacionaria y en las diferentes solubilidades o volatilidades en la fase mvil.
Ej. CCD
La interaccin con el slido ocurre debido a enlaces con grupos o sitios activos en la
superficie, la desorcin ocurre por volatilizacin en el gas carrier (CGS) o por
disolucin en el lquido de elucin (CLS)

CROMATOGRAFA LQUIDO-SLIDO (CLS)

POR BIOAFINIDAD
Porath 1967- para separacin de protenas.
Fase estacionaria con grupos especficos para retencin de
las molculas de inters.

CROMATOGRAFA CON FLUIDOS

SUPERCRTICOS (CFS)
Esta tcnica permite la separacin y determinacin de compuestos que no pueden
analizarse por la cromatografa de gases ni por la de lquidos: compuestos no voltiles o
trmicamente lbiles.
Una sustancia a temperaturas y presiones por encima de su temperatura y de su presin
crtica (punto crtico) se denomina fluido supercrtico que es otro estado de agregacin de la
materia. Los fluidos supercrticos tienen propiedades distintas a las de esas sustancias en
estado gaseoso, lquido o slido.
Una propiedad importante de los fluidos supercrticos, que est relacionada con sus
densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm3), es su notable capacidad para disolver molculas
grandes no voltiles.
Por ejemplo, el dixido de carbono supercrtico disuelve fcilmente n- alcanos que poseen
entre 5 y 30 tomos de carbono. Otra propiedad notable de estos fluidos es que los analitos
disueltos en ellos pueden ser fcilmente recuperados por el procedimiento simple de
volatilizar el solvente al permitir que las soluciones se equilibren con la atmsfera.
Los equipos instrumentales para la esta cromatografa son parecidos los de HPLC con dos
diferencias importantes: es necesario un control preciso de la temperatura y de la presin, y
poseen un dispositivo restrictor que convierte en gas al fluido antes de que llegue al
detector.

CROMATOGRAMAS
Un cromatograma es un grfico de alguna propiedad relacionada con la concentracin de los
componentes en funcin del tiempo o del volumen de elucin.
Si en el extremo de la columna se coloca un detecor que responda a la concentracin de los
componentes y se grafica la seal en funcin del tiempo durante la elucin, se obtiene una
serie de picos. La posicin y el rea de los picos se utiliza para su anlisi cuali-cuantitativo.

CROMATOGRAMAS
Tiempo de retencin (tr): de un componente, es el tiempo que transcurre desde la
inyeccin de una mezcla en la columna hasta que ese componente llega al detector
(mximo del pico cromatogrfico).
Volumen de retencin (Vr): es el volumen de fase mvil necesario para eluir un soluto
determinado de la columna.
La fase mvil que no es retenida por la fase estacionaria atraviesa la columna en el mnimo
tiempo posible, denominado tiempo muerto (tm).
El tiempo de retencin corregido (tr) de un soluto es la diferencia entre el tiempo que
tarda un soluto en atravesar toda la columna y el que emplea un disolvente no retenido.
Se define la retencin relativa () o factor de selectividad para dos componentes, como el
cociente de los tiempos de retencin ajustados.
Para la cuantificacin se utiliza el rea de los picos, previa calibracin, generalmente por los
mtodos de estndar interno o externo.

EFICIENCIA DE LA COLUMNA
La eficiencia de una columna cromatogrfica para separar dos componentes depende de sus
velocidades de elucin relativas.
Estas velocidades estn determinadas por la relacin de las concentraciones de soluto en
entre la fase estacionaria y la fase mvil.
Para la especie A, el equilibrio implicado (si se llega al equilibrio en un plato terico, la Keq es
Kdistribucin) se describe:

A (mvil) A (estacionaria)
Kd = aAe / aAm
Las actividades pueden reemplazarse por las concentraciones molares en soluciones diluidas.

Podemos relacionar la constante con los parmetros cromatogrficos:

Kd = CAe / CAm = nAe . Vm / nAm. Ve = k Vm / Ve

Siendo el llamado factor de capacidad

k = tr / tm

Este factor adimensional que sirve para comparar la retencin de un compuesto por la fase
estacionaria, es independiente del caudal.

EFICIENCIA DE LA COLUMNA
Se define eficiencia de una columna como el nmero de platos tericos y es el cuadrado de la
relacin entre el tiempo de retencin corregido y la desviacin estndar del pico (el ancho del
pico en la base es 4).

N = (tr /)2 = 16 (tr / w)2

Altura equivalente
de un plato terico

H = L/ nplatos

Para aumentar la eficiencia de una columna se debe evitar el ensanchamiento de las

bandas o picos debido a varios factores

RESOLUCIN DE LA COLUMNA
El problema de la buena separacin de todos los componentes de una mezcla queda
reducido siempre a la separacin de las dos bandas ms difciles de separar.
La resolucin (Rs)se define como el cociente de la distancia entre los centros de las dos
bandas y el valor medio de sus ensanchamientos.

Rs = 2 t / w1 + w 2

Para valores altos

de y bajos de Rs,
la separacin
mejora con el
aumento de la
eficacia; para
valores bajos de
solo se puede lograr
una mejora
cambiando el
sistema (fase mvil
o columna)

CROMATOGRAFA GASEOSA
Se utiliza un cromatgrafo de gases.
La fase mvil es un gas inerte (N2 , Ar) puro.
La fase fija puede ser un slido o un lquido
fijado en un soporte sobre las paredes de la
columna.
Sirve para analizar mezclas voltiles y estables.
Regulador
de flujoManmetro

Inyector

Horno

Cilindro
de gas

Columna

Cromatograma

Datos

CROMATOGRAFA GASEOSA - Equipo

Inyector

1- Septum

2- Alimentacin de gas carrier

3- Bloque calefactor metlico

4- Punta de la columna cromatogrfica.

Columnas
Empacadas o
rellenas

Capilares

Largo: 0,5 a 5m
Dimetro externo: 2 a 4 mm
Relleno: 0,5 a 25% de fase
estacionaria lquida sobre soporte

Largo: 12 a 60 m
Dimetro externo: 0,1 a 0,5 mm
Relleno: slido o pelcula lquida

CROMATOGRAFA GASEOSA - Equipo

Columnas

Tipo

Ventajas

Desventajas

Rellenas

Menos costo
Ms capacidad de carga

Menor eficiencia
Anlisis ms lento

Capilares

Mayor eficiencia
Anlisis rpido
Mejor separacin

Satura rpidamente
(pequeos
volmenes de
muestra)

CROMATOGRAFA GASEOSA - Equipo

Temperatura
Anlisis Isotrmico
-Primeros picos agudos y
poco resueltos
-ltimos pcos bajos, anchos,
muy resueltos.
-Cpmponentes con elevada
masa molecular no eluyen

Anlisis con programacin de temperatura (optimizacin)

-Menor tiempo de anlisis
-Minimizacin de
transformaciones qumicas de los
componentes ms inestables
-Mejor resolucin de todos los
picos.

CROMATOGRAFA GASEOSA - Equipo

Detectores
de conductividad trmica (TCD)
Seal basada en la diferencia en la
conductividad trmica de un filamento
de W cuando pasa gas carrier y
cuando pasa alguna otra sustancia.
Es universal, todas las sustancias
generan alguna seal.

Muestra
Referencia

de ionizacin en llama (FID)

Seal basada en la variacin de la
corriente debido a la influencia de
iones y electrones formados en una
llama de H2
No detecta sustancias inorgnicas.

Electrodos

Bobina de
ignicin

de captura electrnica (ECD)

Solo para compuestos orgnicos halogenados (pesticidas).

Aire
Columna

CROMATOGRAFA GASEOSA
Eficiencia y resolucin
Curva de AEPT
Es la representacin de la AEPT en funcin de la velocidad de la fase mvil.

H mnimo

u ptimo

El valor de H puede
ser minimizado
regulando el flujo
del gas carrier, para
lo que se realiza
este grfico
experimental.

CROMATOGRAFA GASEOSA
Eficiencia y resolucin
Ecuacin de Van Deemter
Es la ecuacin que describe la curva de
AEPT en funcin del flujo es poco usada
en la prctica.

Resistencia a la transferencia de materia

Difusin molecular

Irregularidad de la fase estacionaria

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PRESIN

RESOLUCIN (HPLC)
Todas las tcnicas de
cromatografa lquida tienen la
posibilidad de realizarse con estos
sistemas.
Emplean pequeas columnas
rellenas de materiales
especialmente preparados y una
fase mvil que es eluida a alta
presin. Esto conlleva una mayor
selectividad, una mejor
resolucin de los cromatogramas
y menor tiempo de anlisis.
Los sistemas ms complicados
son los de particin, segn sea
fase normal o inversa, pues
utilizan ms de un solvente y
necesitan un sistema de bombas
algo ms complejo.

F.M
Columna

Cromatograma
Inyector

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PRESIN

RESOLUCIN (HPLC)
Columnas
Son de acero inoxidable,
cerradas y reutilizables
cientos de veces.
Largo: 10- 30cm
Cortas y de paredes
espesas para soportar
altas presiones.

Bombas de Alta Presin

Proporcionan flujo reproducible y constante
de la F.M a lo largo de la columna.
Hasta 700 atm
Flujos de 0,1 a 10mL/min

Pre-columna (protectora)
Columna analtica

Columna semipreparativa

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PRESIN

RESOLUCIN (HPLC)
Sistema de inyeccin
Se emplean vlvulas de inyeccin
de volumen constante (con loop,
bucle o lazo) manuales o
automticas, generalmente de seis
bocas.
Los lazos se pueden cambiar para
inyectar distintos volmenes de
muestra.

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PRESIN

RESOLUCIN (HPLC)
Detectores
Basados en la absorcin UV-Vis (ms
utilizados, ms econmicos, amplia
variedad)
Basados en tcnicas de dispersin de
luz (para macromolculas)
Basados en mediciones de ndice de
refraccin (universal)
Electroqumicos (conductancia, etc.)
Espectrmetros de masa acoplados
(alta sensibilidad, selectividad, costo)

Celda de vidrio del detector por ndice

de refraccin, dividida en dos
cmaras. Al circular muestra, se desva
el haz de luz y el detector recibe la
seal