Guía de Laboratorio Código FLA-23 v.

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INMUNOLOGÍA
Práctica 4 Página 1 de 1

1. Titulo:
PRECIPITACION SALINA DE PROTEINAS CON SULFATO DE AMONIO (NH4)SO4

2. Objetivo
- Obtener por la precipitación del suero con (NH4)SO4, una fracción cruda de inmunoglobulinas.

3. Marco Teórico
Brieger y Erlich (1893) fueron los primeros en describir la precipitación de una inmunoglobulina por (NH4)SO4.
Los autores fueron capaces de precipitar anticuerpos de leche de cabra inmunizada contra tétano usando una
concentración de 27-30% de sal.
La extracción de proteínas es un proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la
concentración diferencial de la proteína o péptidos de interés. Los factores a tener en cuenta en cada etapa
del fraccionamiento son solubilidad, pH, grado de oxidación, presencia de metales pesados, polaridad y fuerza
iónica de la solución, presencia de proteasas, temperatura y actividad de la molécula. (Paxton 1991).

En cuanto a la precipitación de proteínas con sulfato de amonio, las proteínas son solubles gracias a su
interacción con el agua, al añadir el sulfato de amonio se unen al agua formando puentes de hidrogeno, la
proteína se deshidrata y las biomoléculas interactúan hidrofóbicamente entre ellas y forman el precipitado, la
proteína menos soluble en solución se une a las sales presentes (sulfato de amonio). (Allen 2004).

El objetivo principal es remover una cantidad importante de remanentes que pueden ser ácidos nucleicos,
toxinas y otros compuestos. Existen varias estrategias para precipitar las proteínas, como el cambio de pH, el
incremento en la temperatura, la adición de solventes, las moléculas cargadas, etc., pero, el método más
comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH4)2SO4. (Allen 2004.).

Pero, con (NH4)SO4 no se logra una inmunoglobulina pura, por lo tanto, la sal se usa generalmente con otras
etapas de fraccionamiento; para la remoción de las proteínas acompañantes. Una fracción cruda que contiene
todas las inmunoglobulinas (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) se obtiene por la precipitación del suero a una saturación
del 45% de sulfato de amonio a pH 7.

Inmunoglobulina M

Sinónimos: γM globulina, 19 S inmunoglobulina, macroglobulina. Es la más pesada de las globulinas del

sistema gamma. Su concentración en el suero normal es escasa, tiene un peso molecular de 970 kDa y el
componente mas importante tiene una constante de sedimentación de 19 unidades Svedberg.
Esta proteína se puede obtener pura por ultracentrifugación preparativa o cromatografía en columnas de
DEAE-celulosa. Cantidades apreciables se pueden conseguir a partir de sueros de pacientes con
macroglobulinemia de Waldenström, sobre todo si se utiliza la filtración a través de geles como método de
separación. Fija el complemento y su capacidad de combinación es mayor con antígenos particulados que con
los solubles.
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Hasta el momento no se ha podido demostrar que la IgM atraviese la placenta. La cadena polipeptídica
designada cadena J se encuentra asociada con las formas poliméricas de IgA y con el pentámero de
IgM (19 S). Es un producto de síntesis de las células plasmáticas, tiene un peso molecular de 15 kDa,
es rica en restos –SH y se une a las mencionadas inmunoglobulinas mediante uniones disulfuro.

La función exacta de las cadenas J no está bien determinada, pero parece que desempeña un papel
muy importante en el proceso de polimerización. hay formación de uniones covalentes de una
cadena J a dos unidades monomèricas vecinas, independientemente de los monómeros que
compongan el polímero.

Figura 1: *Estructura esquemática de IgM polimérica. Tomada de Abbas AK y AH Lichtman. Inmunología Celular y Molecular. Quinta
edición. 2004:48,53.

Desalinización:

En la mayoría de los casos, especialmente cuando son necesarios posteriormente pasos de

fraccionamiento, es suficiente remover la sal por diálisis. Antes de usar las bolsas, deben ser lavadas
con agua destilada para remover los plastificadores (glicerina); luego se les hace un nudo en un
extremo asegurado con un hilo, la prueba de impermeabilidad de lleva a cabo llenando la bolsa con
agua. La solución proteica a ser desalinisada se pone en la bolsa con la ayuda de una pipeta o embudo.
La bolsa debe tener suficiente espacio muerto entre la solución y el nudo para permitir el flujo del
solvente hacia la bolsa. Después del llenado se ata el otro extremo y el saco se pone en un recipiente
grande con agua o solución salina. La diálisis se lleva a cabo por varios cambios en el solvente. La
agitación acelera el proceso.
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4. Materiales, Equipos e Insumos

-Centrifuga
-Tubos de centrifuga
-Tubos de ensayo
-Pipetas de 1mL
-Pipetas de 5mL
-Gradillas
-Bolsas de diálisis
-Vasos de precipitado de 1000mL
-Hilo
-Pipetas pasteur
-Tubos Ependorf
-Portaobjetos
-Nevera.
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5. Reactivos

-(NH4)SO4 al 50%
-NaCl 0.15M
-Agar 1.5%
-Solución salina 0.85%.
-Suero humano
-Anti-Inmunoglobulinas humanas comerciales

6. Procedimiento

A un volumen de suero añadir volumen a volumen (NH4)SO4 saturado

(gota a gota con agitación constante).

Reposo 10 minutos (temperatura ambiente).

Descartar sobrenadante.

Luego adicionar un volumen igual a la mitad del inicial de agua destilada más un
Volumen igual al final de solución saturada de (NH4)SO4
(gota a gota con agitación constante).

Centrifugar 15 minutos a 4000 r.p.m

Descartar sobrenadante
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Dializar precipitado contra NaCl 0.15M por 24 h a 4ºC

Pasar el dializado a tubos ependorf (guardar a 4ºC)

Realizar Inmunodifusión radial (IDR) o Inmunodifusión doble (IDD)

Fotografía 1: *Precipitación de IgG con sulfato de amonio al 50% por IDD. Wlda Becerra.
Profesora Asociada. Universidad de Pamplona. Colombia

Fotografía 2: Precipitación de IgM con sulfato de amonio al 50% por IDD

Wlda Becerra. Profesora Asociada. Universidad de Pamplona. Colombia
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7. Cuestionario
1. Por qué se recomienda agregar gota a gota el (NH4)SO4 durante todo el proceso?
2. Consulte las propiedades biológicas de las siguientes Inmunoglobulinas: M, D, E.
3. Mencione otros reactivos que puedan cumplir la misma función que el NaCl 0.15M durante la diálisis

8. Bibliografía

ALLEN T, MARK W. 2004. Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis and ultrafiltration.
Current protocols in protein science 4.4.1-4.4.15. John Wiley & Sons Inc, New York,USA.

-HARRIS James. Trinity College Dublin, Irlanda Traducción: Eduardo Arranz, Universidad de Valladolid e
Instituto de Biología y Genética Molecular, Valladolid, España. Revisión: Jesús Gil, Instituto de Biología
Molecular, Mainz, Alemania. En línea: https://www.immunology.org/es/public-information/bitesized-
immunology/systems-and-processes/fagocitosis

-NAVARRETE M. Guías de laboratorio de Inmunología. Departamento de Ciencias Biológicas. Universidad

de los Andes. 1988: 8-9.

-BECERRA W; WILCHES A. Texto Guía de Inmunología. Departamento de Microbiología. Facultad de

Ciencias Naturales y Tecnológicas. Universidad de Pamplona. 1997: 17-21.
-ABBAS A.K; LICHTMAN A.H. Inmunología Celular y Molecular. Quinta edición. Elsevier. España. S.A.
2004: 285-288.