PRACTICAS 1 y 2

ESPERMATOGENESIS Y OVOGENESIS

INTRODUCCIÓN
El sistema reproductor masculino consta de los órganos sexuales primarios y de
estructuras sexuales secundarias. Los primeros son los testículos y las segundas
incluyen a los conductos genitales y excretores, a las glándulas anexas y en algunos
grupos de animales órganos especializados en la transmisión de los gametos
masculinos hacia la hembra. El testículo se encuentra compuesto por muchos
compartimentos internos densamente empaquetados llamados túbulos seminíferos que
es el lugar donde se producen los espermatozoides. Los túbulos seminíferos se
encuentran rodeados de tejido conectivo en el cual encontramos las células mioides.
Estas células sintetizan colágeno y su contracción rítmica genera ondas peristálticas
que contribuyen a movilizar los espermatozoides y los líquidos testiculares a través de
de los túbulos seminíferos hacia el sistema de las vías espermáticas.

La transición de las células germinales primordiales mitóticamente activas a

espermatozoides maduros recibe el nombre de espermatogénesis y es un proceso que
implica varias transformaciones estructurales a nivel celular. El proceso general de la
espermatogénesis puede dividirse en tres etapas principales: a. Multiplicación mitótica,
b. Meiosis y c. Espermiogénesis.

Las células mitóticamente activas al interior de los túbulos seminíferos se conocen

como espermatogonias y se encuentran cerca de la pared interna del túbulo. Algunas
de estas células después de varios ciclos están listas para iniciar la primera división
meiótica y en éste momento son denominadas Espermatocitos primarios. Durante la
primera división meiótica los espermatocitos primarios se dividen en dos células hijas,
las cuales reciben el nombre de Espermatocitos secundarios. Después de la segunda
división meiótica, la espermatogénesis da origen a cuatro células haploides llamadas
Espermátides. Estas últimas sufren una transformación profunda denominada
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Espermiogénesis y se llegan a convertir en células especializadas en extremo como

los espermatozoides. Algunos de los cambios que ocurren durante este proceso son:
pérdida de líquido y disminución de tamaño, concentración de la cromatina, formación
del acrosoma y flagelo, reubicación de mitocondrias (hacia la parte proximal del flagelo)
y desplazamiento y desintegración de parte del citoplasma.

Los espermatozoides están constituidos por: cabeza que posee el núcleo y la vesícula
acrosómica, cuello, pieza media, cola y pieza terminal. Es normal encontrar en todos
los varones humanos espermatozoides normales y con anomalías morfológicas que
pueden ocurrir a lo largo de su estructura. Con respecto a la cabeza podemos encontrar
espermatozoides: sin cabeza, con cabeza alargada ó con dos cabezas. En el cuello
puede existir una implantación de éste al eje longitudinal de la cabeza con un ángulo de
45 a 90º, engrosamiento anormal, restos citoplasmáticos o también llamados gotas
citoplasmáticas. En la cola podemos encontrar espermatozoides sin cola, con dos colas,
cola extremadamente corta, con angulaciones de diferentes grados (45º, 90º, 180º) y
con curvaturas totales o parciales.

Estas características y otras más del semen y su contenido son de interés para su
análisis, ya que con ellas se puede determinar la capacidad reproductiva del varón. Así
pues en los laboratorios Andrológicos o de Biología reproductiva y Fecundación asistida
es una herramienta de uso indispensable para el inicio del análisis de la fertilidad de un
paciente. En el semen humano podemos encontrar además de espermatozoides,
leucocitos (macrófagos y neutrófilos), células germinales inmaduras, células epiteliales,
bacterias y hongos. El examen minucioso del semen es llamado espermograma e
involucra los siguientes aspectos dentro del análisis:

Nivel macroscópico ó aspectos físicos del semen

Volumen del semen: > de 2.0 ml (2.0 a 6.0 ml)
pH: > 7.2 (7.2 a 8.0 ml) puede ser mayor y no significar anormalidad
Licuefacción: entre 15 a 60 minutos a 37º C.
Color: Blanco opalescente a gris amarillento
Olor: característico. Un olor muy fuete fecal puede indicar la presencia de E. coli.
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Nivel microscópico ó aspectos celulares

Viscosidad: se mide como fluye la muestra desde una pipeta y debe caer en pequeñas
gotas. Recuento: > de 20.000.000 de espermatozoides/ml. 40.000.000 espermatozoides
por eyaculado.
Movilidad: > del 25% con movilidad progresiva; > del 50% de espermatozoides móviles
(Tipo A más Tipo B).

Categorías del grado de movilidad:

Tipo A: progresivo rápido, su desplazamiento es en línea recta
Tipo B: progresivo lento, su desplazamiento no necesariamente describe un recta
Tipo C: no progresivo, hay movimiento flagelar pero no se desplaza
Tipo D: inmóvil,

Vitalidad: > de 50% de espermatozoides vivo

Morfología: > del 15% de formas normales. Se cuentan al menos 200 espermatozoides.
Vitalidad: > 50% de espermatozoides vivos (no coloreados). Recuento de 200
espermatozoides.
Células redondas: < de 5.000.000 células/ml
Leucocitos: < 1.000.000 leucocitos/ml
Células germinales inmaduras: 1 a 3% con respecto a 100 espermatozoides.

Terminología usada en el espermograma

Oligozoospermia: Concentración de espermatozoides menor al valor de referencia

Astenozoospermia: Menos al valor de referencia en movilidad
Teratozoospermia: Menos del 30% con morfología normal
Oligoastenoteratozoospermia: Perturbación de las tres variables
Azoospermia: Ausencia de espermatozoides en el eyaculado
Aspermia: No hay eyaculado

OBJETIVOS

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1. Conocer cómo se realiza la disección y extracción del aparato reproductor de

grillos (machos)

2. Identificar las partes del aparato reproductor en grillos

3. Conocer la estructura interna de testículos en grillos y en cuys

4. Preparar placas de túbulos seminíferos de testículos de grillos por medio de la

técnica de dispersión de tejido.

5. Identificar las fases de diferenciación por las cuales pasan las células testiculares
durante el proceso de la espermatogénesis en extendidos de túbulos seminíferos
de grillos y en un corte transversal del testículo de cuy.

6. Realizar algunas de las pruebas empleadas dentro del examen de semen

denominado espermograma.

REACTIVOS Y MATERIALES

Primera sesión
Acetato de etilo
Agua destilada
Alfileres
Bata de laboratorio manga larga*
Bayetilla*
Bisturí con hoja nueva*
Caja de petri para disección (parafina en su interior)
Cuchilla nueva
Estereoscopio
Frasco de vidrio con tapa con mota de algodón
Goteros
Guardián para desechos de riesgo biológico

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Microtubo de centrífuga eppendorf (1.5ml)

Microscopio
Papel milimetrado y calcante*
Pinzas*
Placas con corte transversal de testículo de cuy
Regla transparente*
Solución fijadora (Etanol y ácido acético, 3:1)
Solución salina al 0.1%
Tijeras delgadas para disección de punta fina*
Toalla de papel

Segunda sesión

Aceite de inmersión y papel de limpieza (microscopio)

Ácido acético 50%(C2H4O2)
Ácido clorhídrico (HCl 5N)
Agua destilada
Agua sulfurosa
Bandeja y rejilla de tinción
Bata de laboratorio*
Bayetilla*
Caja Petri
Compartimento para oscuridad
Cuchilla nueva
Eosina al 0.5% en PBS a pH 7.2
Etanol al 96 %
Estereoscopio

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Goteros
Gradilla para eppendorfs
Guantes de laboratorio
Guardianes: desechos biológicos y químicos.
Micropipetas y sus puntas (capacidad 10 ul)
Microscopio
Microtubo de centrífuga eppendorf (1.5ml)
Muestra de semen equino.
Nigrosina
Palillos delgados
Pinzas*
Portaobjetos y cubreobjetos cortos y largos*
Punzón para muestra sanguinea
Reactivo de Schiff
Reactivo Giemsa
Solución fijadora (Etanol y ácido acético, 3:1)
Toallas de papel

Aquellos materiales marcados con asterisco (*) son los que cada grupo de estudiante
debe tener para realizar su práctica.

PROCEDIMIENTO
La práctica se realizará en dos sesiones de laboratorio con una duración de 4 horas
cada una. La primera parte comprende los literales A y B, mientras que la segunda C y
D.

PRIMERA SESIÓN DE LABORATORIO

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A. DISECCIÓN DEL GRILLO Grillus sp.

1. Introduzca el grillo en un frasco que posea en su interior

una mota de algodón impregnado en Acetato de Etilo y
tape herméticamente. Deje por 15 minutos.

2. Retire el grillo del frasco y colóquelo ventralmente sobre

una caja de Petri para disección (caja petri con una capa
gruesa de parafina). Utilice siempre pinzas para su
manipulación.

4. Retire los dos pares de patas posteriores cerciorándose de cortarlo más cerca al
punto de inserción de estas con el tronco. Si prefiere también puede eliminar las alas
para lograr una mejor manipulación. Adicione solución salina al 0.1% sobre el grillo.
Sujete el grillo a la caja de disección utilizando alfileres dispuestos en forma de X en el
tórax.

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5. Realice un corte en la pleura desde el ano hasta el primer terguito abdominal. Retire
suavemente los terguitos hasta dejar toda la región expuesta. En algunas ocasiones es
necesario retirar simultáneamente tejido adiposo cuando es muy abundante.

6. Identifique el sistema digestivo y retírelo con cuidado utilizando pinzas y tijeras para
romper conexiones existentes. Tenga en cuenta de no asir la glándula accesoria del
sistema reproductor masculino que se encuentra visible cerca del ano.

Glándula accesoria

7. Busque en la parte dorso-lateral del individuo los testículos. Estos se caracterizan por
ser de color blanco un poco translucidos y estar recubiertos por numerosos conductos
transparentes y brillantes llamados traqueolas. Remueva suavemente los testículos e
identifique los dos vasos deferentes que los conectan con la glándula reproductora
accesoria.

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Testículos

Glándula accesoria

Vaso deferente

8. Desprenda todo el aparato reproductor y colóquelo en solución fijadora por lo menos

durante 7 días. Identifique los órganos del sistema reproductor masculino

9. Realice el esquema correspondiente e identifique: testículos, vasos deferentes

glándula accesoria, filamentos de la glándula accesoria, bulbo genital, vesícula seminal.

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CORTE TRANVERSAL DE TESTICULOS DEL CUY, CONEJO Y RANA

1. Realice observación del corte transversal de testículo de Cuy suministrado.

Identifique los diferentes estados celulares de la espermatogénesis en este mamífero.
Realice esquemas de lo observado con los objetivos de 40X.

Espermatocito primario Membrana basal

Tejido intersticial

Luz tubular
Célula mioide

Espermatogonias
Espermátidas Túbulos seminíferos
Espermatocito secundario

Corte transversal del testículo de cuy

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Corte transversal del testículo de conejo

Corte transversal del testículo de rana

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Corte transversal del testículo de rana

2. Calcule el área (superficie) total de un testículo de Cuy empleada para la producción

de espermatozoides.

a. Teniendo en cuenta que el diámetro del campo de observación cuando empleamos

un objetivo de 4X es de 4 mm; calcule el diámetro del campo cuando se usa el objetivo
de 10X.

b. Con base en el diámetro calculado en el punto anterior, realice un círculo que posea
dicho diámetro (a escala) y dibuje lo observado en el testículo del cuy. Realice una
cuadrícula milimétrica de 0.7 mm X 0.7 mm a la misma escala del dibujo. Emplear papel
transparente (por ejemplo: calcante) para mayor facilidad en los pasos siguientes.

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c. Coloque sobre el dibujo del testículo del cuy, la cuadrícula realizada y marque sobre
ella el número de interceptos (I) entre las líneas de la cuadrícula y las paredes del tubo
seminífero.

d. Encuentre la longitud total de la cuadricula así; L = 7 x 0.7=____________

e. Calcule la superficie con la siguiente ecuación:

S = (2 x I) / L

Donde; I= intercepto, L = longitud total de la cuadrícula

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f. Si asumimos que el testículo es aproximadamente esférico, entonces su volumen se

puede calcular así:

V = 4/3 π . r 3

g. Determine el área total de epitelio seminífero dentro del testículo, multiplicando el

volumen hallado por la superficie encontrada (S).

REPORTE DE LA PRIMERA SESIÓN DE LABORATORIO

Cada grupo de estudiantes debe entregar al final de la práctica un reporte con los
esquemas y ejercicios solicitados a través de la guía.

Lorena Cruz Bernate

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PRACTICA 2
ESPEMATOGENESIS Y OVOGENESIS: SEGUNDA SESIÓN DE
LABORATORIO

OVOGENESIS: El aparato genital o reproductor femenino está compuesto por los

ovarios, las vías genitales, los genitales externos y las glándulas mamarias; tiene la
función de propagar la especie y está bajo el control de una interrelación compleja entre
factores hormonales y nerviosos. El ovario es un órgano pequeño de forma ovoide cuya
cápsula gruesa de tejido conjuntivo, la túnica albugínea, está cubierta por un mesotelio
simple plano o cúbico que recibe el nombre de epitelio germinativo. Puede dividirse en
una corteza, una médula, un cuerpo lúteo y un cuerpo albicans.

Corteza
Situada justo por debajo de la túnica albugínea, contiene las células germinales
femeninas, los oogonios, que han sufrido mitosis para formar muchos oocitos. Cada
oocito está rodeado por una capa de células epiteliales y estos dos componentes en
conjunto forman un folículo ovárico. En los mamíferos es muy común hablar de
foliculogénesis, para indicar las diferentes fases que atraviesa el folículo en su
desarrollo. La foliculogénesis es un proceso dinámico y complejo, a través del cual el
folículo pasa por varios estadios de desarrollo:

• Folículo primordial: consiste en un oocito primario rodeado por una capa simple de
células foliculares (de la granulosa) aplanadas.
• Folículo primario: consiste en un oocito primario rodeado por una capa simple
(unilaminares) o varias capas (multilaminares) de células foliculares cúbicas. En
estos últimos, se ve la zona pelúcida interpuesta y la teca interna está comenzando a
organizarse.
• Folículo secundario (vesicular): se distingue por ser más grandes que los folículos
primarios multilaminares, por su teca interna y su teca externa bien formadas y, en
especial, por la presencia de líquido folicular entre las células foliculares.
• Folículo de De Graaf (maduro): es muy grande; a esta altura se ha formado una
cavidad central denominada antro, que está llena de líquido folicular. Las tecas
interna y externa están bien desarrolladas, en la primera hay muchas células y
capilares, mientras que la segunda es menos celular y más fibrosa.
• Folículo atrésico: se halla en un estado de degeneración. En etapas más
avanzadas las características destacables son la aparición de fibroblastos en los
folículos y la degeneración del oocito.

Médula
Está compuesta por un tejido conjuntivo fibroelástico de tipo más o menos laxo que
contiene muchos vasos sanguíneos, incluidas las arterias helicinas y venas tortuosas.

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Cuerpo lúteo
Una vez que el folículo de De Graaf pierde su oocito se transforma en el denominado
cuerpo hemorrágico. En un par de días el cuerpo hemorrágico se transforma en el
cuerpo lúteo o cuerpo amarillo, una estructura amarillenta que produce estrógenos y
progesterona. Cuando el cuerpo lúteo se degenera se convierte en el cuerpo albicans
fibrótico.

Cuerpo albicans
Es un cuerpo lúteo en proceso de involución y de hialinización. Se torna fibrótico con
unos pocos fibroblastos entre la sustancia intercerlular. Por último, el cuerpo albicans se
convierte en tejido cicatrizal en la superficie ovárica.

C. PROCESAMIENTO DE TESTICULOS DE GRILLOS.

1. Saque los testículos con cuidado de la solución fijadora y colóquelos en una caja
Petri. Realice un enjuague con agua destilada e hidrátelos por 10 minutos con esta
misma sustancia dejándolos completamente cubiertos.

2. Traslade los testículos a un tubo Eppendorf con la menor cantidad de agua posible y
adicione HCl 5N. Deje en reposo durante 30 minutos.

3. Elimine el HCl 5N y enjuague los testículos 3 veces con abundante agua destilada.
Realice este procedimiento preferiblemente en la caja de Petri .

4. Coloque los testículos nuevamente en el tubo Eppendorf y cúbralos con el reactivo

de Schiff. Deje en reposo por 45 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad.

5. Lave los testículos en agua sulfurosa tres veces y lave tres veces más pero ahora
con agua corriente. Después del último enjuague, adicione un poco de agua evitar
desecación.

6. Realice un corte transversal del testículo y con la ayuda de un estereoscopio

identifique y visualizar la disposición de los túbulos seminíferos en su interior. a. Realice
los esquemas correspondientes.

7. Tome por lo menos tres túbulos seminíferos y coloque cada uno de ellos en su
respectivo portaobjetos. Antes de extraer el túbulo del testículo observe detenidamente

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el gradiente de coloración y la forma que presenta este desde el extremo distal hasta el
extremo proximal. Coloque cuidadosamente el túbulo seminífero en el portaobjeto y
extiéndalo teniendo presente cual es el extremo proximal y cual el distal. Se recomienda
hacer este paso con la ayuda de un estereoscopio.

8. Adicionar una gota de ácido acético al 50% y dejar actuar por 2 minutos.

9. Colocar el cubreobjetos sobre el túbulo seminífero y realizar ligera presión mientras

se observa a través del estereoscopio para no perder de vista la disposición espacial de
los extremos del túbulo. Usar toalla de papel para retirar el exceso de ácido acético de
los bordes del cubreobjetos. Después de esto, disperse un poco más las células
ejerciendo fuerte presión sobre la placa, pero asegúrese de NO mover el cubreobjetos y
de estar apoyado sobre una superficie plana.

10. Lleve al microscopio, observe y describa por medio de esquemas las diferentes
etapas por las cuales pasan las células durante espermatogénesis. Identifique
espermatogonia, espermatocito primario, espermatocito secundario, espermátides en
diferentes estados de maduración y espermatozoides.

zona III zona II zona I

transformación maduración y crecimiento germarium
reducción

vasos célula apical

deferentes

espermatozoide espermátida meiosis espermatocitos espermatogonia

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D. ESPERMOGRAMA EN MAMIFEROS

La muestra de semen de equino se le suministrará en el laboratorio y se

realizarán las siguientes cuatro pruebas de un espermograma: movilidad,
vitalidad, morfología espermática y diferenciación de leucocitos de otras células
redondas.

1. Movilidad

a. Tome sólo un volumen de 8 ul y colóquelo sobre un portaobjetos, cubra con

un cubreobjetos y observe al microscopio. No usar mayor volumen para lograr

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una capa delgada de la muestra y poder así tener uniformidad en el

movimiento de los espermatozoides.

b. Identifique las diferentes categorías de movilidad observadas y determine los

porcentajes de cada una de ellas. Recuerde que se debe hacer con un conteo
de 200 espermatozoides. Para mayor facilidad se recomienda iniciar contando
los espermatozoides de mayor movilidad.

2. Vitalidad

a. Coloque sobre un portaobjetos 6 ul de semen y adicione 6 ul de eosina al

0.5%, mezcle con un palillo y antes de colocarlo sobre cualquier superficie
deseche de inmediato en el recipiente de desechos contaminantes.

b. Cubra la mezcla con el cubreobjetos y observe al microscopio. Calcule la

vitalidad al medir la proporción de espermatozoides vivos (aquellos que
permanecen transparentes) en medio de una muestra de 200 espermatozoides.
Los espermatozoides muertos se reconocerán por la coloración que toman
después de la tinción. Investigue el fundamento de este resultado.

3. Morfología espermática

a. Limpie con agua y jabón muy bien por lo menos dos portaobjetos para realizar
extendidos de la muestra. Ya limpias enjuague con alcohol al 96% y deje secar al
aire libre.

b. Haga tinción con nigrosina: mezcle con u palillo 10 ul del reactivo con 10 ul de
semen en uno de los extremos del portaobjetos, realice un extendido no tan
delgado y deje secar. Busque anomalías y dibújelas.

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acrosoma núcleo cuello

cabeza

Pieza media cola Pieza terminal

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Dos colas y una cabeza

De arriba a abajo: Cuello engrosado con Inserción menor a 45º y cabeza

cola corta, ángulo de inserción, cola alargada.
muy corta.

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Angulación de 90º en la zona media Angulación de 90º en la zona

anterior de la cola de la cola

Cola corta y curvatura completa Cola curva: 1 vuelta

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Cola curva: 1 ½ vuelta Con restos citoplasmáticos en cuello

Diferenciación de leucocitos

Debido a que el propósito es identificar leucocitos en el semen, se preparan placas de

dos tipos de muestras: a. tejido sanguíneo y semen. El objetivo de esta preparación es
que después de identificar con propiedad los leucocitos en el tejido sanguíneo la
búsqueda de estas células en el semen sea más fácil.

Se puede utilizar cualquiera de las dos tinciones que se tienen a continuación, pero en
esta oportunidad aplicaremos sólo la primera de ellas:

Realice tinción con Wright:

a. Prepare tres placas portaobjetos para realizar extendidos como se explicó en el
punto anterior. Dos de estas placas se utilizarán para la tinción de la muestra de semen
y una para la muestra sanguínea de alguno de los integrantes del grupo.
b. Tome 8 ul de muestra de semen y realice un extendido no muy delgado. Deje secar a
temperatura ambiente.
c. Adicione reactivo de Wright que cubra toda la placa y adicione buffer fosfato, mezcle
suavemente al soplar. Deje actuar por siete minutos.

d. Lavar con agua destilada y dejar secar al ambiente

Realice tinción con Giemsa:

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a. Prepare dos placas portaobjetos para realizar extendidos como se explicó

anteriormente.
b. Tome 8 ul de muestra de semen o tejido sanguíneo, según la que esté preparando y
realice un extendido no muy delgado. Deje secar a temperatura ambiente.
c. Adicione alcohol metílico por tres minutos y deseche por inversión.
d. adicione el colorante Giemsa por 20 minutos
e. Lavar con agua destilada y dejar secar al ambiente. Interpretación:

Estructura celular Color

Hematíes rosado

Plaquetas lila

Citoplasma Azul claro

Granulosito eosinófilo anaranjado

Granulosito basófilo púrpura ó azul oscuro

E. OVOGENESIS

En placas de cortes transversales de ovario, suministradas en el laboratorio, identificar

las diferentes estructuras que se encuentran en él como: los 4 estadios de maduración
del folículo ovárico: folículo primordial, folículo primario, secundario, terciario o de Graaf
al igual que cada una de las estructuras que lo componen.

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Folículos primordiales

Folículo primario
temprano:

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REPORTE DE LA SEGUNDA SESIÓN DE LABORATORIO: cada grupo de

estudiantes debe entregar un reporte de laboratorio con lo realizado en la práctica.

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