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Chromobacterium subtsugae sp nov., Una betaproteobacterium tóxica para Colorado

escarabajo de la patata y otras plagas de insectos

Artículo en Revista Internacional de Microbiología Sistemática y Evolutiva · Junio de 2007

DOI: 10.1099 / ijs.0.64611-0 · Fuente: PubMed

CITACIONES LEE

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4 autores, incluso:

Amanecer E Gundersen-Rindal Michael B. Blackburn

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Revista Internacional de Microbiología Sistemática y Evolutiva (2007), 57, 993–999 DOI 10.1099 / ijs.0.64611-0

Chromobacterium subtsugae sp. nov., a

betaproteobacterium tóxico para el escarabajo de la patata de
Colorado y otras plagas de insectos

Phyllis AW Martin,1 Amanecer Gundersen-Rindal,1 Michael Blackburn1

y Jeffrey Buyer2
1Laboratorio de Biocontrol de Insectos, Departamento de Agricultura de EE. UU., Servicio de Investigación
Correspondencia
Phyllis AW Martin Agrícola, 10300 Baltimore Ave, Beltsville, MD, EE. UU.

Phyllis.Martin@ars.usda.gov 2Laboratorio de Sistemas Agrícolas Sostenibles, Departamento de Agricultura de EE. UU., Servicio de

Investigación Agrícola, 10300 Baltimore Ave, Beltsville, MD, EE. UU.

Cepa PRAA4-1T, Se aisló una bacteria móvil, Gram-negativa, pigmentada con violeta, del suelo del bosque
de Maryland y se encontró que era tóxica por vía oral para las larvas del escarabajo de la patata de
Colorado y otros insectos. La caracterización morfológica, biológica, bioquímica y molecular reveló que
esta cepa era muy similar aChromobacterium violaceum, la especie tipo y el único miembro actualmente
reconocido del género Chromobacterium. Hibridación ADN-ADN con C. violaceum ATCC 12472T fue del
27%. El análisis filogenético de las secuencias del gen ARNr 16S reveló que la cepa PRAA4-1T y
Chromobacterium violaceum forman un clado monofilético, con el taxón ancestral más cercano
Vogesella indigofera dentro de Betaproteobacteria. Sobre la base de análisis fenotípicos, genotípicos y
filogenéticos, la cepa PRAA4-1T (=NRRL B-30655T =DSM 17043T) se propone como la cepa tipo de una nueva
especie del género Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae
sp. nov.

Las cepas de algunas especies bacterianas tienen propiedades
insecticidas. Por ejemplo,Paenibacillus popilliae (antes Bacillus
popilliae), que mata a los escarabajos japoneses (Dutky, 1940),
Bacilo turingiensico, que mata orugas, escarabajos,
mosquitos, etc. (Schnepf et al., 1998), Serratia entomophila
y Serratia proteamaculans, que matan las larvas de la hierba (Jackson
et al., 1993), y Photorhabdus luminescens, que mata a las orugas
(Forst & Nealson, 1996), se ha demostrado que son patógenas o
tóxicas para los insectos. Las bacterias violetas se han aislado con
poca frecuencia de los insectos y no se consideran patógenos de
insectos (Bucher, 1981). Hemos descubierto una cepa de bacterias
violetas que es tóxica por vía oral para las larvas del escarabajo de
la patata de Colorado y varias otras especies de insectos plaga
(Martinet al., 2004).
La caracterización preliminar, incluida la actividad positiva
de proteasa y lecitinasa y colonias violetas profundas en
agar nutritivo, sugirió que era un miembro del género
Cromobacteria (Gillis y Logan, 2005) en lugar de
El número de acceso de GenBank / EMBL / DDBJ para la secuencia del gen de
ARNr 16S de la cepa PRAA4-1T es AY344056.
Una micrografía electrónica de células de la cepa PRAA4-1T, fotografías de
colonias de la cepa PRAA4-1T y C. violaceum ATCC 12472T, resultados de la
hibridación Southern del ADN genómico de la cepa PRAA4-1T y
C. violaceum ATCC 12472T y perfiles de ácidos grasos de la cepa PRAA4-1T
y organismos relacionados están disponibles como material complementario en IJSEM
Online.
Janthinobacterium, otro género que contiene especies que
producen pigmento violeta. Chromobacterium violaceum,
la especie tipo del género, produce un pigmento violeta, violaceína
(Hoshino et al., 1987), cuya síntesis está controlada por la detección
de quórum (McClean et al., 1997). La violaceína se ha descrito como
un tripanocida y tiene propiedades antibióticas (Duránet al., 1994).
C. violaceum también produce una variedad de antibióticos (Durán
& Menck, 2001). Además, la secuencia del genoma completo deC.
violaceum ATCC 12472T sugiere que pueden estar presentes genes
insecticidas (Consorcio del Proyecto Nacional del Genoma de Brasil,
2003). Cromobacteria Las cepas son generalmente organismos
asociados al suelo y al agua (Hungría et al., 2005).
Aislamiento de cepas
Cepa PRAA4-1T se aisló suspendiendo suelo forestal, rico en hojas
de cicuta, de la región montañosa de Catoctin en el centro de
Maryland, en agua y sembrando directamente en agar Luria (agar
L) sin glucosa (Atlas, 2004). El pH del suelo fue de 4,7 y el contenido
de humedad fue del 46,6%. La muestra original tenía un recuento
total de células microbianas aeróbicas de
1,756106 ufc (g suelo)21. De esto, se recuperaron aproximadamente
80 colonias violetas, una de las cuales (PRAA4-1T)
fue seleccionado para un estudio adicional debido a su color inusual.
Dado que algunas bacterias pigmentadas, comoSerratia marcescens,
son tóxicos para los insectos (Grimont & Grimont, 1978), probamos
estas bacterias para determinar su toxicidad alimentándolas a Colorado

64611 Impreso en Gran Bretaña. 993

PAW Martin y otros
larvas de escarabajo de la patata con dieta liofilizada (Martin, 2004a). En el primer
bioensayo, más del 78% de las larvas de escarabajo del segundo estadio se
alimentaron con una dieta que contenía PRAA4-1T murió dentro de los 3 días; esta
toxicidad para las larvas del escarabajo de la patata de Colorado nos llevó a
caracterizar más el aislado.
Morfología celular y colonial
Cepa PRAA4-1T resultó ser una betaproteobacteria gramnegativa,
móvil, facultativamente aeróbica. Se tiñó con un kit de tinción de
Gram (Difco). También se demostró que las células se lisan en KOH
al 30%. a diferencia de otrosCromobacteria cepas, las células tenían
fl agela polar. Las células eran varillas cónicas, promediando
0,7±0,1 metrom de ancho y 2,4±0,2 metrom de largo según lo
determinado por microscopía electrónica. Las celdas ocasionales se
curvaron (Fig. Complementaria S1 disponible en IJSEM Online). Las
colonias eran de color violeta oscuro, lisas, regulares y elevadas a los
2-3 días (Fig. Complementaria S2b). Las colonias se formaron
inicialmente a las 24 h como pequeñas y de color crema, y
gradualmente se volvieron violeta claro a oscuro desde el centro hacia
afuera durante las siguientes 24 h. En presencia de oxígeno limitante
como en un recipiente sellado, no se formó el pigmento violeta.
Caracterización fenotípica
Para la caracterización fenotípica, PRAA4-1T y C. violaceum ATCC 12472T
se cultivaron o probaron al mismo tiempo en condiciones idénticas.
Todas las pruebas, excepto las de temperatura, se realizaron a 25ºC.tuC.
Usamos una variedad de medios basados en peptonas. Se utilizó TBAB
(Difco) con 5% de sangre de oveja (Waltz Farms) para la prueba de
hemólisis; una zona clara o semitransparente alrededor de la colonia
indicó una prueba positiva.
Bacillus cereus Se utilizó agar base (sin polimixina B; Oxoid) con yema
de huevo (menos de 24 h de edad) para la prueba de lecitinasa y lipasa.
Un precipitado alrededor de una colonia era una prueba positiva para
una lecitinasa y una zona clara era una prueba positiva para una lipasa.
Se utilizó TSA + Blood (Biolog) para las pruebas de oxidación del
carbono y M-9 (Atlas, 2004) para la evaluación del crecimiento en
medios mínimos. El crecimiento bacteriano fue monitoreado por
midiendo el OD600 de cultivos líquidos. Crecimiento en varias
concentraciones de NaCl (1-3%) a 25tuC fue probado en L-
caldo. El efecto del pH sobre el crecimiento se evaluó en
caldo L ajustado al pH apropiado con NaOH o HCl y
el crecimiento se midió después de 72 ha 25 tuC por OD600. La
temperatura óptima de crecimiento se evaluó en agar L.
El crecimiento se midió cada 24 h durante 6 días. La utilización
del sustrato se evaluó utilizando placas de microvaloración
Gram-negativas Biolog (Biolog versión 3.5) y tiras API 20 NE
(bioMérieux).
El tamaño celular se determinó midiendo, al azar, 50 células en
fase estacionaria (de una colonia cultivada en agar L durante 48 h)
mediante microscopía electrónica (610 000 aumentos) tomados de
10 campos separados. Para preparar células para microscopía
electrónica, células de la cepa PRAA4-1T se fijaron durante 2 ha
temperatura ambiente por inmersión en glutaraldehído al 3% /
Tampón de cacodilato de sodio 0,05 M (pH 7,0) y se almacena durante la
noche a 4ºC. tuC. Esto fue seguido por un lavado en un enjuague con
tampón de cacodilato de sodio, con seis cambios durante 1 h,
994
post fi jación en tetróxido de osmio tamponado al 2% durante 2 h,
deshidratación en una serie de etanol e infiltración con resina de
incrustación de baja viscosidad de Spurr. Se cortaron secciones de oro
(10 nm) del tejido en un micrótomo Reichert / AOUltracut con un
cuchillo de diamante Diatome y se montaron sobre rejillas de níquel de
malla 200. Se tiñeron con acetato de uranilo al 4% y citrato de plomo al
3% y se observaron en un microscopio H-7000 Hitachi a 75 kV.
Alternativamente, las células enteras se midieron con microscopía
electrónica de barrido de congelación-fractura (Wergin & Erbe,
1991).
La motilidad se confirmó mediante el método de gota colgante. La
ubicación de la flagela se determinó mediante la tinción con una tinción
de Leifson modificada (Forbes, 1981).
Las colonias crecieron bien en medios basados en peptona y en
medio mínimo, donde las colonias eran de un violeta muy tenue.
En agar MacConkey, las colonias también eran de color violeta
claro. Cepa PRAA4-1T creció de manera óptima a los 25 tuC, pH 6,5–
8,0 y con 0–1,5% (p / v) de NaCl. El crecimiento fue apenas
detectable a los 10tuC y a los 40 tuC y pH 5,0 y 9,0. No se detectó
crecimiento en medios que contenían 3% de NaCl. Cepa PRAA4-1T
se encontró que hidroliza la caseína y produce una lecitinasa y una
lipasa en agar con yema de huevo. La cepa no fue hemolítica en
sangre de oveja. En presencia de oxígeno, se descubrió que la cepa
produce un pigmento violeta, que coincide con las propiedades
espectrales y de solubilidad de la violaceína (Hoshinoet al., 1987).
FAMA
El análisis de ácidos grasos se realizó con el sistema de
identificación microbiana Sherlock (MIDI, Inc.). Ambos PRAA41T
y C. violaceum ATCC 12472T se cultivaron en TSA en
condiciones idénticas a 25 tuC y el análisis se repitió tres veces.
Los ácidos grasos se identificaron mediante GLC utilizando el
método TSBA40 (MIDI, 2002). Las identi fi caciones de ácidos
grasos se confirmaron mediante GC-MS utilizando un GC
Agilent 5890 con un espectrómetro de masas Agilent 5970. Las
bacterias se identificaron comparando los perfiles de ácidos
grasos con la base de datos de organismos TSBA40
proporcionada con el software Sherlock.
El ácido graso predominante de PRAA4-1T era C16: 1v7C,
que representa el 41,9% del área total de los picos. C. violaceum
ATCC 12472T tenía tres ácidos grasos, ciclo-C17: 0, iC16: 0 y
C12: 1 3-OH, que no se detectaron en PRAA4-1T cuando se
compara en condiciones idénticas. El sistema MIDI
cepa identificada PRAA4-1T como Pseudomonas syringae pv.
coronafaciens con un índice de similitud bajo (0,403-0,650).
Cepa ATCC 12472T fue identificado como C. violaceum con un
índice de similitud de 0,470 (Tabla complementaria S1).
Análisis de ADN
Para la determinación del contenido de G + C, el ADN se degradó en
nucleósidos mediante el método de Mesbah. et al. (1989) usando
Escherichia coli ATCC 11775T como estándar de calibración. El ADN
se liberó de las células utilizando una celda de presión francesa.
Los análisis de HPLC se realizaron en un aparato HP1100 usando
una columna Phenomenex Luna C18 (36250 mm).
Revista Internacional de Microbiología Sistemática y Evolutiva 57

Los cálculos se basaron en la relación de desoxiguanosina a
timidina.
El ADN para la hibridación ADN-ADN se aisló usando una celda
de presión French y se purificó por cromatografía en
hidroxiapatita como lo describe Cashion. et al. (1977). La
reasociación ADN-ADN se realizó en condiciones óptimas (26
SSC más formamida al 10% a 68 tuC) con un espectrofotómetro
Cary 100 Bio UV / VIS (Varian) equipado con un termostato
Peltier 66Cambiador de 6 celdas múltiples y un controlador de
temperatura con en el lugar sonda de temperatura (Huß et al.,
1983).
Se purificó el ADN de la cepa PRAA4-1T y C. violaceum
ATCC 12472T por métodos estándar para la extracción de
ADN genómico de bacterias (Moore, 1995) para su uso en
PCR, secuenciación y análisis de hibridación Southern. El
gen de ARNr 16S se amplificó utilizando cebadores
universales para procariotas, R16F0 y R16R0 (Leeet al.,
1993), y secuenciado usando la química del terminador Big
Dye en un secuenciador ABI Prism modelo 310 (PE Applied
Biosystems) usando estos cebadores y chromo16SF1 (59-
AACGCTGGCGGCATGCTTTACAC-39) y cromo16SF2 (59-
GAGGAAATCCCGCTGGTTA-39), diseñado sobre la base de la
secuencia del gen 16S rRNA de C. violaceum ATCC 12472T
(Nº de acceso de GenBank M22510).
Para el análisis de hibridación, ADN genómico marcado con
digoxigenina (Roche) de C. violaceum ATCC 12472T se utilizó como
sonda de hibridación. Cinco microgramos de ADN genómico de
PRAA4-1T y C. violaceumATCC 12472T fue digerido por separado con
endonucleasas de restricción Edadyo y HindIII (Invitrogen) durante
la noche a 37 tuC, se sometió a electroforesis a bajo voltaje a través
de un gel de agarosa al 1%, se transfirió a membrana de tonilón y
se sondaron. La temperatura para la hibridación fue 48tuC. Los
ADN recocidos se visualizaron usando CSPD (Roche).
Las secuencias del gen de ARNr 16S de PRAA4-1T, otro
Cromobacteria cepas (Hungria et al., 2005) y miembros
representantes de la Betaproteobacterias fueron alineados
por separado por el CLUSTAL V método con el software
Lasergene (DNASTAR). Los análisis filogenéticos se
realizaron utilizandoPAUP versión 4.0b5 (Swofford,
2002). Los caracteres no informativos fueron excluidos del
análisis y el árbol filogenético fue construido por el algoritmo
de rama y límite para encontrar el árbol o árboles óptimos.E.
coli K-12 MG1655 fue designado grupo externo para enraizar el
árbol. Se realizó un análisis Bootstrap (10 000 réplicas) para
estimar la estabilidad y el soporte de los clados inferidos.
El contenido de G + C de la cepa PRAA4-1T fue 64,51% en moles (Dakota del Sur
0,14). El rango de contenido G + C del ADN de los miembros del
género.Cromobacteria es 64-68% en moles (Gillis & Logan,
2005) y el contenido de G + C para C. violaceumATCC 12472T
por secuenciación de ADN fue de 64,83% en moles (Consorcio del
Proyecto Nacional del Genoma de Brasil, 2003).
Hibridación ADN-ADN con C. violaceum ATCC 12472T
reveló una relación media del 27,2%. Por lo tanto, ceda
http://ijs.sgmjournals.org
Chromobacterium subtsugae sp. nov.
PRAA4-1T no pertenece a la misma especie que C.
violaceum ATCC 12472T cuando las recomendaciones de un
valor umbral de 70% de relación ADN-ADN para la
definición de especies bacterianas (Wayne et al., 1987) se
consideran.
El análisis filogenético de las secuencias del gen ARNr 16S reveló
que la cepa PRAA4-1T y Cromobacteria Las cepas forman un clado
monofilético, con el taxón ancestral más cercano Vogesella
indigofera (previamente Pseudomonas indigofera; Grimes et al.,
1997), dentro del Betaproteobacteria (Figura 1). Dentro de
Cromobacteria clade, se identificaron tres subclades
potenciales. Cepa PRAA4-1T y dos no caracterizados
Cromobacteria cepas aisladas de la región amazónica brasileña
de Rio Preto (Hungría et al., 2005) comprendía un subclade y,
sobre la base de este análisis, puede representar especies
similares de áreas geográficamente distintas. Scholzet al. (
2005) también encontró el C. violaceum Las especies podrían
agruparse en tres genotipos distintos mediante análisis
PCRRFLP. Las similitudes de la secuencia del gen del ARNr 16S
entre las cepas PRAA4-1T y los dos miembros caracterizados de
Chromobacterium, C. violaceum ATCC 12472T y Cromobacteria
sp. MBIC3901, fueron respectivamente 97,4 y 98,3%. Sin
embargo, las temperaturas a las que crecen fueron diferentes,
lo que refleja diferencias en las cepas aisladas en los trópicos
en comparación con una aislada en un clima templado. La
similitud de la secuencia del gen de ARNr 16S entre la cepa
PRAA4-1T y V. indigofera ATCC 19706T, el pariente más cercano
fuera Cromobacteria, fue
90,7%.
Similitud genómica entre la cepa PRAA4-1T y C. violaceum ATCC
12472T también fue examinado. Se calculó un coeficiente de
similitud (F) basado en el análisis comparativo de sus patrones
de restricción que era F = 0,64. El coeficiente de similitud se
calculó mediante el método de Nei & Li (1979)
como F = 2Nxy / (nortex +nortey) donde NX y Ny son el número total de
fragmentos hibridados en cepas X y y, respectivamente, y
nortexy es el número de posiciones de bandas de fragmentos hibridados
compartidas por cepas X y y (Fig. Suplementaria S3).
Toxicidad para los insectos
Se realizaron bioensayos para evaluar la toxicidad de la cepa PRAA41.T a
diferentes especies de insectos. Los escarabajos de la patata de Colorado se
criaron a partir de huevos hasta el segundo estadio para bioensayos en la
dieta de hoja de papa del Laboratorio de Biocontrol de Insectos (IBL), una
modi fi cación de la dieta Forester (Gelmanet al., 2001). Para los bioensayos,
se utilizó una versión liofilizada de esta dieta, sin neomicina, según lo descrito
por Martin (2004a). La mortalidad final fue
registrado a las 120 h. El LC50 fue calculado usando el PROBITO
procedimiento (SAS Institute, 2004). C. violaceumATCC 12472T
también se probó contra las larvas del escarabajo de la patata de Colorado para
determinar su toxicidad. Los ensayos de gusanos de la raíz del maíz se realizaron
con escarabajos adultos de sexos mixtos recolectados en el campo, como lo
describió Schroder.et al. (2001). Se añadieron cinco escarabajos adultos a cada placa
de Petri de 100 cm. Los controles (sin las bacterias) y cada tratamiento se repitieron
cinco veces. La mortalidad se registró a los 5 días después del tratamiento. Los
ensayos de larvas del gusano de la raíz del maíz fueron
995
PAW Martin y otros

Figura 1. Árbol filogenético construido por

análisis de parsimonia (PAUP versión 4.0b) de
secuencias genéticas de ARNr 16S de longitud
casi completa de Cromobacteria cepas y otras
betaproteobacterias. Secuencias de genes de
ARNr 16S de no caracterizadosCromobacteria
las cepas 07, 23, 27, 44, 48, 52, 66, 68, 70 y 71,
aisladas de la Amazonía brasileña, fueron
reportadas por Hungria et al.
(2005). Las secuencias se alinearon conCLUSTAL V (
Software DNASTAR Lasergene). Escherichia coli Se
empleó K-12 MG1655 como grupo externo para
enraizar el árbol. Barra, 20 cambios de estado de
carácter inferidos. Las longitudes de las ramas son
proporcionales al número de transformaciones de
estado de carácter inferidas. Los valores de
bootstrap superiores al 50% (medidas de apoyo
para los subclades inferidos) se muestran como
porcentajes en las ramas. Los números de acceso
a GenBank se muestran entre paréntesis.

realizado con la dieta del gusano de la raíz del maíz liofilizado (BioServe). Los
escarabajos de la colmena se probaron combinando PRAA4-1T con polen
recolectado en el campo. Polilla de espalda de diamantePlutella xylostella)
Los ensayos de larvas se realizaron en discos de hojas de frijol rojo (
Phaseolus vulgaris L. 'Roma II') según lo descrito por Farrar et al.
(2001). La mortalidad se registró a los 7 días. Polilla gitana (Lymantria dispar)
Los ensayos fueron los mismos que los del escarabajo de la patata de
Colorado, excepto que se utilizó la dieta de la polilla gitana (Bell et al.,
1981). Se pesaron las larvas de la polilla gitana a los 7 días para determinar
los efectos subletales. Se obtuvieron masas de huevos de polilla gitana de la
Base de la Fuerza Aérea APHIS Otis y se criaron hasta el segundo estadio con
la misma dieta.Culex pipiens Se recolectaron balsas de huevos localmente y
se criaron larvas de mosquitos en bandejas de esmalte blanco con 5 cm de
profundidad de agua desionizada y se alimentaron con comida de pescado
(Purina Mills). Se probaron diez larvas de tercer estadio en
viales de centelleo con 10 ml de agua desionizada a los que
100 metrol PRAA4-1T se añadió cultivo. La mortalidad se
registró a las 48 h.
La toxicidad para una variedad de insectos se resume en la Tabla 1. La
LC50 para PRAA4-1T larvas del escarabajo de la patata de Colorado en el
segundo estadio fue de 2,0±0,86108 células por gránulo de dieta. El primero
un indicio de toxicidad fue el cese de la alimentación de las larvas. Se observó
una mortalidad inferior al 5% en el control de agua o conC. violaceum ATCC
12472T. El ochenta por ciento de los escarabajos adultos del gusano de la raíz
del maíz del sur o del oeste que se alimentaron de PRAA4-1T murió dentro de
los 5 días, en comparación con el 8% de los controles. Para las larvas de
segundo estadio de la polilla del dorso de diamante, la mortalidad fue del
90% en 7 días. No se produjo mortalidad de control. Ninguna de las larvas de
la polilla gitana murió después

Tabla 1. Toxicidad oral de la cepa PRAA4-1T a varias especies de insectos

Insecto Escenario Mortalidad Efectos subletales

Escarabajo de la patata de ColoradoLeptinotarsa decemlineata) Adulto No Inhibición de la alimentación

Escarabajo de la patata de ColoradoLeptinotarsa decemlineata) Larva sí Inhibición de la alimentación

Gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera) Adulto sí Desconocido

Gusano de la raíz del maíz del sur (Diabrotica undecimpunctata) Adulto sí Desconocido

Gusano de la raíz del maíz del sur (Diabrotica undecimpunctata) Larva sí Inhibición de la alimentación

Pequeño escarabajo de la colmena (Aethina tumida) Larva sí Inhibición de la alimentación

Polilla de espalda de diamantePlutella xylostella) Larva sí Desconocido

Polilla gitana (Lymantria dispar) Larva No Inhibición de la alimentación

Gusano cuerno del tabacoManduca sexta) Larva No Inhibición de la alimentación

Mosca blanca de la batataBemisia tabaci) Adulto sí Desconocido

Mosca blanca de la batataBemisia tabaci) Ninfa sí Desconocido

Chinche verde del surNezara viridula) Adulto sí Desconocido

MosquitoCulex pipiens) Larva No Ninguno observado

996 Revista Internacional de Microbiología Sistemática y Evolutiva 57


tratamiento con PRAA4-1T, pero las larvas que consumieron
PRAA4-1T en su dieta pesaron un 40% menos que los controles
después de 6 días (Martin, 2004b). No hubo toxicidad para las
larvas de mosquitos a las 48 h.
Conclusiones
En general, las características morfológicas y biológicas de la cepa
PRAA4-1T, tales como la producción de violaceína, la producción de
lecitinasa y la hidrólisis de caseína, fueron similares a las descritas
por Gillis & Logan (2005) para la bacteria violeta
C. violaceum y como se probó contra la cepa tipo ATCC 12472T.
Otras características en común incluyen la ausencia de producción
de ácido a partir de una variedad de azúcares que incluyen glucosa,
fructosa, trehalosa, sacarosa, arabinosa, manosa, xilosa, salicina,
manitol, celobiosa y lactosa. El ensayo Biolog basado en la
utilización del sustrato identificó PRAA4-1T como C. violaceum, pero
con un índice de similitud bajo (0,604), lo que sugiere que era
distinta de la cepa tipo. Varias diferencias deC. violaceum ATCC
12472T se observaron durante la caracterización comparativa de la
actividad tóxica. En particular, elC. violaceum La cepa de tipo no era
tóxica para las larvas del escarabajo de la patata de Colorado,
aunque codifica un gen para una proteína insecticida, CV1887, con
una secuencia similar a la de Photorhabdus luminescens (
Consorcio Nacional Brasileño del Proyecto Genoma, 2003). Más
lejos,C. violaceum ATCC 12472T creció, aunque pobremente, a
temperaturas más altas (42 tuC) y utilizó sacarosa y citrato como
únicas fuentes de carbono, mientras que PRAA4-1T no lo hizo (Tabla
2).
Tabla 2. Comparación de características biológicas de C. violaceum ATCC 12472T y colar
PRAA4-1T
Los datos se obtuvieron en este estudio a partir de una comparación directa de las dos cepas.
Característica
Crecimiento en / en:
4 tuC
45 tuC
2% de NaCl
Toxicidad oral para insectos
Presencia de ácidos grasos
C12: 1 3-OH, iC16: 0, ciclo-C17: 0
C17: 1v6C
Utilizar como única fuente de carbono:
Sacarosa
Citrato
Acetato
Reducción de nitrato a nitrito
Hidrólisis de esculina
Asimilación de:
L-Manosa
Ácido cáprico
Contenido de ADN G + C (% en moles)
Hibridación ADN-ADN con ATCC 12472T (%)
http://ijs.sgmjournals.org
Chromobacterium subtsugae sp. nov.
Sobre la base de la similitud de la secuencia del gen del ARNr 16S,
el análisis filogenético y la relación genómica, la cepa PRAA4-1T es
claramente un miembro del género Chromobacterium.
Stackebrandt y Goebel (1994) propusieron que los miembros del
mismo género deberían considerarse especies separadas si tienen
menos del 97% de similitud en la secuencia del gen 16S rRNA.
Wayneet al. (1987) también propuso que las cepas con menos del
70% de parentesco ADN-ADN se consideren especies separadas; el
valor observado de 27,2% cae muy por debajo de este umbral y,
por tanto, las cepas son distintas a nivel de especie. La designación
de la cepa PRAA4-1T dentro de una especie separada de la especie
tipo género, C. violaceum, y otra
Cromobacteria cepas está bien soportado. Además, los perfiles de
análisis de ácidos grasos indican una relación potencialmente más
estrecha con los no pigmentados.Pseudomonas syringae pv.
coronafaciens que a la especie tipo del género
Chromobacterium. Sobre la base del análisis polifásico, los criterios
filogenéticos y fenotípicos y la toxicidad de los insectos, proponemos la
cepa PRAA4-1T como la cepa tipo de una nueva especie del género
Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae
sp. nov.
Descripción de Chromobacterium subtsugae
sp. nov.
Chromobacterium subtsugae (sub.tsu9gae. L. pref.sub bajo;
NL n. Tsuga nombre científico de los abetos; NL gen. norte.
subtsugae bajo Tsuga, porque el tipo de cepa se encontró en el suelo
debajo de un árbol de cicuta).
C. violaceum ATCC 12472T Cepa PRAA4-1T
2 +
+ 2
2 +
2 +
+ 2
2 +
+ 2
+ 2
2 +
2 +
+ 2
2 +
2 +
64,83 64,51
100 27,2
997
PAW Martin y otros
Las colonias comienzan a formarse de color crema, pero se vuelven
violetas intensas, comenzando desde el centro, en 24 a 48 h en
presencia de oxígeno en medios basados en peptonas. Esta coloración
se debe a la producción de violaceína, un derivado del di-triptófano
violeta. Las colonias son lisas, regulares y criadas en agar L. Eubacterias
gramnegativas en forma de bastoncillo. Las dimensiones medias de la
celda son 0,762.4 metrometro. El ácido se produce a partir del
metabolismo fermentativo de glucosa, fructosa y trehalosa. Mientras
que el crecimiento se produce en presencia de NaCl al 2% (p / v), no hay
crecimiento en presencia de NaCl al 3% (p / v). El crecimiento óptimo
ocurre a los 25-28tuC, con escaso crecimiento a los 10 y 40 tuC y sin
crecimiento a 42 tuC. El rango de pH óptimo para el crecimiento es de
6,5 a 8,0 y el crecimiento se inhibe por debajo de 4,5 y por encima de
9,0. La caseína se hidroliza y se producen una lecitinasa y una lipasa en
agar yema de huevo. No hemolítico en
sangre de oveja. El ácido graso predominante es C16: 1v7C. El contenido
de G + C es 64,5% en moles (Dakota del Sur 0.1) (determinado por
HPLC). Usando placas Biolog GN, el tipo de cepa oxida
aminoácidos, incluidosD-Alanina L-Alanina L-alanil glicina,
L-asparagina L-ácido aspártico, L-ácido glutamico, L-histidina,
D-serina L-serina y L-treonina. Azúcares utilizados incluidos
D-glucosa, D-fructosa y D-trehalosa. Los ácidos utilizados incluyeron
ácido acético, ácido láctico, ácido bromosuccínico y ácido propiónico.
Otros compuestos que se utilizan como únicas fuentes de carbono son
Tweens 40 y 80,NORTE-acetilglucosamina, succinato de monometilo,
inosina, glucosa 1-fosfato y glucosa 6-fosfato. Tóxico para el escarabajo
de la patata de Colorado, el gusano de la raíz del maíz, el pequeño
escarabajo de la colmena, la mosca blanca de la batata, la chinche verde
del sur y la polilla del lomo de diamante.
El tipo de cepa es PRAA4-1T (=NRRL B-30655T =DSM 17043T),
aislado del suelo en la región montañosa de Catoctin de
Maryland, EE.UU., debajo de un grupo de árboles de cicuta (
Tsuga canadensis).
Agradecimientos
Los autores agradecen a S. Stone, C. Humphries, E. Patt,
K. Moore, E. Soccer y H. Romani por su ayuda con la caracterización de
la cepa PRAA4-1T, M. Athanas y R. Farrar para bioensayos de insectos,
C. Taylor por microscopía electrónica, M. Sasser por el uso de los valores de la base
de datos MIDI en la Tabla complementaria S1, M. Pedroni por la excelente asistencia
técnica y A. Shropshire por la coordinación de estudios y la invaluable asistencia
técnica.
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