GENERALIDADES DE BACILLUS:

1.2.1 El género Bacillus Son bacterias Gram-positivas, buenas secretoras de

proteínas y metabolitos, fáciles de cultivar y altamente eficientes para el
control de plagas y enfermedades (Berg and Hallmann 2006). Poseen una
morfología alargada simulando un bastón, son aerobias estrictas o anaerobias
facultativas, ubicuas en la naturaleza; incluyen especies de vida libre,
patógenas y varias especies que forman parte natural de la flora intestinal
humana (Todar 2006).
Una característica particular de este género es su habilidad para formar
endosporas bajo condiciones de estrés físico o químico, lo que le permite
sobrevivir y permanecer metabólicamente activas por largos períodos de
tiempo (Errington 2010), haciéndolos apropiados para la formulación de
productos viables y estables para el control biológico. Existen otras bacterias
capaces de producir endosporas, entre estas, bacterias pertenecientes a los
géneros Clostridium, Sporosarcina, Sporohalobacter, Sporolactobacillus,
Anaerobacter, Desulfotomaculum, Helicobacterium y Heliophilum (Nicholson
et al. 2000), siendo los más estudiados Bacillus y Clostridium (Nicholson et al.
2000; Moller and Hederstedt 2006). El género Bacillus ha cobrado importancia
por su producción de toxinas, las cuales pueden lisar eritrocitos de diferentes
especies animales (hemolisinas) o tener propiedades patógenas frente a
insectos (Hoult and Tuxford 1991). Las bacterias entomopatógenas
pertenecientes a este género son agentes naturales de control biológico de
plagas de insectos y han sido utilizadas como base de varios insecticidas
biológicos comerciales. Las especies más Introducción 15 relevantes son: B.
thuringiensis que forma un cuerpo paraesporal tóxico para insectos (Smirnova
et al. 1996; Bravo 1997), Lysinibacillus sphaericus (Ahmed et al. 2007; Jones et
al. 2007), B. laterosporus (Shida et al. 1996), Paenibacillus larvae (Evans 2004),
P. lentimorbis, y P. popilliae (El-Borai et al. 2005). Sin embargo, B. thuringiensis
es la especie más usada en programas a gran escala y de la que se tiene más
conocimiento científico. Coincidiendo con la esporulación, estas bacterias son
capaces de formar inclusiones cristalinas paraesporales, que muchas veces son
las que contienen una o más proteínas insecticidas. Estas proteínas son tóxicas
para los insectos por ingestión, cuya acción generalmente es sobre las células
del epitelio del intestino medio (de Maagd et al. 2003). La ubicuidad en la
naturaleza, la formación y resistencia de sus endosporas, la producción de
antibióticos, la toxicidad de sus esporas, y la producción de cristales proteicos
tóxicos para varios ordenes de insectos hacen del género Bacillus importante
en la medicina, la agricultura, la bioquímica y en la empresa farmacéutica
(Todar 2006).

Bacillus pumilus
1.3.1 Biología

Bacillus pumilus fue descrita por primera vez por Meyer y Gottheil en 1901. Es
conocida también por los nombres de Bacillus aminoglucosidicus o Bacillus
mesentericus. Taxonómicamente pertenece al dominio Bacteria, filo
Firmicutes, clase Bacilli, orden Bacillales, familia Bacillaceae, género Bacillus
(Skerman et al. 1989). Se considera como una bacteria ubicua en la naturaleza,
asociada a animales (Shehata et al. 1983; Johnson et al. 2006; Coorevits et al.
2008; Hill et al. 2009; Porwal et al. 2009), a plantas y restos vegetales (Cottyn
et al. 2001; Choudhary and Johri 2009; Asraful Islam et al. 2010),
específicamente documentada como endofítica en cultivos in vitro (Thomas
2004) y plantas como el algodón y maíz (McInroy and Kloepper 1995), cítricos
(Araujo et al. 2002), y epifita en arroz (Cao et al. 2001). Es comúnmente aislada
de una gran variedad de fuentes ambientales: suelo (Meyers et al. 1991;
Garbeva et al. 2003); mar y sedimentos marinos (Siefert et al. 2000; Banerjee
et al. 2007; Inbakandan et al. 2010); alimentos fermentados (Ouoba et al.
2004; From et al. 2007; Meerak et al. 2008); superficies ambientales (Pirttijarvi
et al. 1996; Silva et al. 2006; Porwal et al. 2009); además en sitios poco
comunes para el aislamiento de microorganismos como en el interior de
Introducción 23 basalto del desierto de Sonora (Benardini et al. 2003) o en una
aeronave espacial (Kempf et al. 2005). Es una bacteria Gram-positiva,
esporulante, de forma bacilar, aerobia o anaerobia facultativa, con bajo
contenido en Guaninas y Citocinas en su genoma (aproximadamente 41%). Se
la considera una especie mesófila (Coorevits et al. 2008), aunque también
existen cepas que pueden ser termófilas y alcalófilas (Moallic et al. 2006).
Crece como una colonia lisa que se torna amarilla mientras aumenta el tiempo
de incubación. Es una especie móvil (posee flagelo), β- hemolítica en agar
sangre, catalasa positiva, tolerante a las sales y susceptible a la penicilina (Tena
et al. 2007; Porwal et al. 2009). B. pumilus tiene propiedades tóxicas, efectos
citopáticos en células Vero, actividad hemolítica, producción de lectinasa y
actividad proteolítica en caseína (Hoult and Tuxford 1991). Es considerada una
bacteria no patógena para humanos, pero debido a su producción de
hemolisinas se la considera una bacteria patógena oportunista. La infección
humana por B. pumilus es excepcional (Porwal et al. 2009). From et al. (2007)
la relaciona con incidentes de contaminación alimentaria debido a la
producción de un complejo de lipoproteínas conocidas como pumilacidinas
previamente encontradas en otros Bacillus spp. causantes de contaminación
alimentaria. Ecológicamente, B. pumilus, al igual que otras bacterias de su
género, mantiene relación endofítica con ciertas plantas, favoreciendo el
crecimiento y desarrollo, y dando protección contra otros organismos del
suelos que causan enfermedades, como hogos del género Fusarium
(Benhamou et al. 1996) y Rhizoctonia (Cottyn et al. 2009). B. pumilus al ser una
especie esporulante, puede permanecer en estado de inactividad durante
largos períodos de tiempo cuando las condiciones 24 ambientales son
desfavorables y luego volver a germinan y a formar una célula vegetativa
(Nicholson et al. 2000). Sus esporas son resistentes al calor, desecación,
radiación UV, radiación γ, H2O2 y a la escasez de nutrientes. Son más
resistentes que otras bacterias de su género, pudiendo sobrevivir incluso a las
prácticas de esterilización estándar (Gioia et al. 2007). Actualmente, se conoce
el genoma completo de la cepa B. pumilus SAFR032 (No. de acceso al GenBank:
NC_009848), las secuencias del genoma de B. pumilus ATCC 7061 (No. de
acceso al GenBank: NZ_ABRX00000000), y las secuencias completas de tres
plásmidos: B. pumilus plásmido pPZZ84 (No. de acceso al GenBank: NC_
013534), B. pumilus ATCC 12140 plásmido pPL10 (No. de acceso al GenBank:
NC_001858) y B. pumilus ATCC 7065 plásmido pPL7065 (No. de acceso al
GenBank: NC_004932) . Esta información es una potente herramienta para la
caracterización molecular de otras cepas.

http://repositorio.educacionsuperior.gob.ec/bitstream/28000/291/
1/T-SENESCYT-0061.pdf
Bacillus subtilis
División: Firmicutes Familia: Bacilliaceae Género: Bacillus Especie: Bacillus subtilis Es una bacteria
Gram positiva, produce endospora las que son termorresistentes y también resiste factores físicos
perjudiciales como la desecación la radiación los ácidos y los desinfectantes químicos, produce
enzimas hidrofilicas extracelulares que descomponen polisacáridos, ácidos nucleicos permitiendo
que el organismo emplee estos productos como fuente de carbono y electrones, producen
antibióticos como la bacitricina,polimixina,gramicidina y circulina,fermentan la caseína y el almidón,
vive dentro de los limites de 55 a 70ºC. Es un gran controlador biológico, Bacillus subtilis promueve
el desarrollo de las plantas y previene las enfermedades del suelo causadas por Sclerotium rolfsii,
Fusarium spp., Verticillium spp, Sclerotinia sclerotiorum, Phytophthora capsici, Pythium spp, y el
nematodo nodulador de raíces (Meloidogyne spp) y Rhizoctonia solani, agente causal de la
enfermedad denominada “mal del tallito” del algodonero. (Calderón et al, .2002).

MORFOLOGIA
Respecto a su morfologia macroscópica; sus colonias
presentan las siguientes características:
Tamaño:
pequeñas
–
medianas
Superficie:
secas
Cromogenesis:
marrón o verde
Transparencia:
opaca
Forma:
irregular
Borde:
onduladoCuando se cultivan en caldo tienen una película
cohrente.

https://www.javeriana.edu.co/biblos/
tesis/ciencias/tesis404.pdf
7.3 Microorganismos biológicos efectivos (MBE) Para el biofertilizante MBE en Agar Nutritivo se
observaron dos tipos de colonias de apariencia ramificada características de algunas especies
pertenecientes al género Bacillus. 7.3.1 Macroscópicamente: C2 Colonias de 2 a 4 mm de diámetro,
irregulares de consistencia cremosa. Presentan color beige oscuro y con producción de
pigmentación rosado claro hacia el centro de la colonia (Figura 5). Figura. 5 Fotografía de colonias
de la cepa C 2 7.3.2 Microscópicamente: C 2 Se observan bacilos Gram positivos, de 1 µm de ancho
por 1.5 a 5 µm de largo, se presentaron esporas esféricas que se sitúan en la parte terminal del
esporangio y le dan un aspecto de raqueta. (figura. 6) Figura 6. Microfotografía de la cepa C2. 1000X
7.3.3 Macroscópicamente: C3 En Agar Nutritivo se observan Colonias 2 a 4 mm de diámetro de
bordes irregulares, de consistencia gomosa. (Figura.7) 16 Figura 7. Colonias de la cepa C3 7.3.4
Microscopicamente C3: Se observan bacilos Gram positivos de 0.6 a 0.9 µm de diametro por 1.2 a 4
µm de largo en forma de cadena, esporas elipsoidal en posición central.(Figura.8). Figura 8.
Microfotografía de bacilos de la cepa C3. 1000X. 1

El grupo II, también conocido como grupo de Bacillus subtilis, esta formado por bacterias que
catabolizan un amplio rango de carbohidratos por las vías de EmbdenMeyerhof-Parnas (glicólisis) y
de pentosas fosfato. La mayoría de estas bacterias crecen en condiciones anaeróbicas por
respiración de nitratos a excepción de B. megaterium y B. pumilus, mientras que algunas como B.
cereus, B. licheniformis y B. thuringiensis fermentan azúcares en ausencia de un aceptor final de
electrones (Shariati et al., 1995). En lo que se refiere a B. subtilis, este fue considerado por mucho
tiempo como un microorganismo aerobio estricto, sin embargo fue hasta 1993 cuanto Priest dio a
conocer la habilidad de B. subtilis para crecer en condiciones anaeróbicas. Esta reportado que en
ausencia de oxígeno, B. subtilis puede crecer bajo respiración de nitratos o, en contados reportes,
por fermentación en medios ricos con glucosa y piruvato (Hoffmann et al 1995; Nakano et al., 1997;
Nakano y Zuber, 1998; Espinosa de los Monteros et al., 2001).

ampliamente utilizado en la industria alimenticia por ser considerado (por la FDA), como un
organismo seguro para su uso en alimentos (GRAS, generally regarded as safe; Zukowski, 1992,
Devine, 2000). Sin embargo, un factor limitante para su uso en la producción de proteínas
heterologas, es la síntesis y excreción de proteasa extracelulares en el medio de cultivo (Ye et al.,
1996; Stephenson et al., 1999). Hasta la fecha son ocho las proteasas que se han identificado en B.
subtilis, las cuales están clasificadas en dos grandes grupos: serinoproteasas y metaloproteasas
(Stephenson et al., 1999). La síntesis de estas proteasas extracelulares esta fuertemente regulada y
la inducción usualmente ocurre durante la etapa de transición de la fase de crecimiento exponencial
a la fase estacionaria (Stephenson et al., 1999). No obstante el desarrollo tecnológico en la biología
molecular ha permitido que varios grupos de investigación se dediquen al diseño y construcción de
nuevas cepas de B. subtilis deficientes en la producción de proteasas, las cuales se pueden utilizar
para su aplicación en nuevos procesos biotecnológicos (Ye et al., 1996)

http://www.ibt.unam.mx/alfredo/Clau
diaIbethHernandez.pdf
CONDICIONES NUTRICIONALES
Requerimientos nutritivos esenciales macroelementos (macronutrientes) -C, O, H, N, S, P, K, Ca, Mg,

y Fe -son requeridos en cantidades relativamente altas micronutrientes (elementos traza o

oligoelementos) -Mn, Zn, Co, Mo, Ni, y Cu -son requeridos en cantidades traza frecuentemente

suministrado entre las impurezas del agua o los componentes del medio de cultivo •Requerimientos de

carbono, hidrógeno y oxígeno -Normalmente se satisfacen simultáneamente -Autótrofos (emplean

dióxido de carbono como única o principal fuente de carbono) Heterótrofos (emplean moléculas

orgánicas como fuente de carbono)

4.Requerimientos Tipos nutricionales de microorganismos

5.Requerimientos mixotrofos: combinan diferentes procesos metabólicos, por ej. quimiolitoautotróficos

y heterotróficos •fuente de energía química inorgánica •fuente de H/e- inorgánica •fuente orgánica de

carbono

6.Requerimientos Requerimientos de nitrógeno, fósforo y azufre • necesario para la síntesis de

importantes moléculas (ej., aminoácidos, ácidos nucleicos) • el nitrógeno se puede suministrar de

muchas formas • el fósforo se suministra en general en forma de fósforo inorgánico • el azufre se

suministra en general en forma de sulfato y se adquiere a través de la vía asimilatoria de reducción de

sulfato Fuentes de nitrógeno • moléculas orgánicas • amonio • nitrato y nitrito a través de sus vías de

asimilación • nitrógeno gas a través de la fijación de nitrógeno

7.Requerimientos Factores de crecimiento • compuestos orgánicos • componentes esenciales (o sus

precursores) que la célula no puede sintetizar • deben ser suministrados por el ambiente en el que

crece la célula para que la célula sobreviva y se reproduzca Importancia práctica de los factores de

crecimiento • desarrollo de ensayos cuantitativos crecimiento-respuesta para determinar la

concentración de factores de crecimiento en preparaciones • producción industrial de factores de

crecimiento por microorganismos

8.Requerimientos Clases de factores de crecimiento • aminoácidos, necesarios para la síntesis de

proteínas • purinas y pirimidinas, necesarios para la síntesis de ácidos nucleicos • vitaminas,

funcionan como cofactores enzimáticos.

publicado por leidy marcela en 16:53 6 comentarios:

viernes, 16 de abril de 2010

imagen
publicado por leidy marcela en 19:05 no hay comentarios:

domingo, 11 de abril de 2010

CRECIMIENTO
Puede crecer anaeróbicamente por la respiración con el nitrato como aceptor terminal de electrones.

En ausencia de receptores de electrones externos, que crece por la fermentación. Identificación de los

productos de la fermentación mediante el uso in vivo las exploraciones de resonancia magnética

nuclear de culturas enteras indicó que B. subtilis crece por la fermentación ácido-mixta butanodiol,

pero que no se produce formiato. Un as mutante que carece de la enzima piruvato deshidrogenasa

(PDH) La actividad fue incapaz de crecer en condiciones anaerobias y producidas casi ningún producto

de la fermentación. Estos resultados sugieren que la PDH está involucrado en la mayoría o todos los

acetil coenzima A en la producción de B. subtilis en condiciones anaeróbicas, a diferencia de

Escherichia coli, que utiliza liasa formiato de piruvato. la respiración de nitrato se mostró previamente

que obligue al sistema de transducción de señal ResDE de dos componentes y un gen regulador

anaeróbica, FNR. También se requiere la nitrato reductasa respiratoria, codificada por el operón

narGHJI y MOAA, implicadas en la biosíntesis del cofactor molibdopterina de la nitrato reductasa. Las

mutaciones Resd resDE y se demostró que los afectan moderadamente fermentación, pero la actividad

de nitrato reductasa y FNR son prescindibles para el crecimiento fermentativo. La búsqueda de genes

implicados en la fermentación indicó que ftsH se requiere, y también se necesita en menor medida

para la respiración de nitrato. Estos resultados muestran que la respiración de nitratos y fermentación

de B. subtilis se rigen por sistemas de regulación divergentes.

PRODUCCION DE ENZIMAS PROTEOLITICAS DE ORIGEN BACTERIANO

Se diseño un medio de cultivo utilizando lactosuero como fuente carbonada y nitrogenada, y KCI,

MgCl2, MgSO4, CaCl2 y FeSO4 como base mineral (medio W). Se crecieron células de B. subtilis sobre

el medio W y se chequeo la produccion de biomasa, enzimas proteolíticas y amilo líticas.

Extracción de enzimas proteolíticas de origen vegetal

Se extrajeron proteasas de Actinida chinensis (Kiwi) por abrasion del mesocarpo.

Hidrolisis de lactosueros

Se hidrolizo lactosuero con proteasas de B. subtilis y A. chinensis. Se calculo el grado de hidrolisis

(DH) como el porcentaje de uniones peptidicas rotas.

Resultados y Discusion

B. subtilis fue capaz de crecer en el medio disenado en base a lactosuero y produjo enzimas

proteolíticas con muy baja concentración de enzimas amilo líticas.

Las exoproteasas producidas por B. subtilis hidrolizaron las proteínas lácteas. Se optimizo las

condiciones de hidrolisis a 30 C y al pH del suero para obtener un DH de 12 %. Estos hidrolizados

proteicos podrian ser utilizados para enriquecer alimentos, pero como la hidrolisis de proteínas

produce péptidos hidrofobicos que tienen sabor amargo, se recomienda detener la hidrolisis antes de

la formación de estos péptidos. Estudios sensoriales realizados con un panel de 10 integrantes

sugieren que el DH máximo permitido antes de la produccion de péptidos es de 12 %.

Las proteasas de A. chinensis también hidrolizaron las proteínas lácteas.

El lactosuero tiene una composición proteica que le permite, por su rico valor nutricional, ser utilizado

como material para enriquecer alimentos. La hidrolisis de sus proteínas nos permitiría obtener

hidrolizados proteicos de mayor digestibilidad y propiedades reologicas modificadas. Además, estas

proteínas son las responsables de las reacciones alérgicas desarrolladas por muchos niños, por lo
tanto la utilización de estos sueros hidrolizados podrian constituir la base para el diseño de alimentos

hipoalergenicos.

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USO COMO ORGANISMO MODELO

Es uno de los procariotas entiende mejor, en términos de biología molecular y biología celular. Su

receptividad excelente genética y el tamaño relativamente grande han proporcionado las poderosas

herramientas necesarias para investigar una bacteria de todos los aspectos posibles. Las recientes

mejoras en las técnicas de microscopía de fluorescencia han proporcionado nuevos e ideas

sorprendentes en la estructura dinámica de un organismo unicelular. La investigación sobre Bacillus

subtilis ha estado a la vanguardia de la biología molecular de bacterias y la citología, y el organismo

es un modelo de diferenciación de genes / regulación de proteínas, y el ciclo de eventos de células de

las bacterias.

publicado por leidy marcela en 19:37 no hay comentarios:

sábado, 10 de abril de 2010

A través del tiempo Bacillus Subtilis se ha convertido en un microorganismo muy importante para

diferentes usos en el medio ambiente ya que este ayuda a la descomposición de residuos vegetales,

produciendo enzimas para la elaboración de productos químicos y a la vez deteriorando las plantas y

la salud del ser humano.

Para usos agrícolas es excelente en la fabricación de fertilizantes, evita enfermedades y además ayuda
al crecimiento de los cultivos evitando el control de plagas que puedan afectar a estas.

Bacillus subtilis

Clasificación científica

Reino:

Bacteria

Filo:

Firmicutes

Clase:

Bacilli

Orden:

Bacillales
Familia:

Bacillaceae

Género:

Bacillus

Especie:

B. subtilis

Bacillus subtilis es una bacteria Gram positiva, Catalasa-positiva, aerobio facultativo1 comúnmente

encontrada en el suelo. Miembro del Género Bacillus, B. subtilis tiene la habilidad para formar una

resistente endospora protectora, permitendo al organismo tolerar condiciones ambientalmente.

Patogénesis

B. subtilis no es considerado patógeno humano; sin embargo puede contaminar los alimentos, pero

raramente causa intoxicación alimenticia. Sus esporas pueden sobrevivir la calefacción extrema que a

menudo es usada para cocinar el alimento, y es responsable de causar la fibrosidad en el pan

estropeado.

Utilidad de B. subtilis

Algunas variedades de B. subtilis también tienen aplicaciones comerciales:

• Una variedad de B. subtilis antes conocido como Bacillus natto es usada en la producción comercial

del manjar japonés Nattō.

• B. subtilis QST 713 (comercializado como QST 713 o Serenata) tiene una actividad fungicida natural,

y es empleado como un agente de control biológico.

• Las enzimas producidas por B. subtilis y B. licheniformis son usadas extensamente como aditivos en

detergentes de lavandería.

• B. subtilis pBE2C1 and B. subtilis pBE2C1AB Son usados en la producción de polihidroxialcanoatos

(PHA) a partir de desechos de malta como fuente de bajo costo para la producción de PHA.

B. subtilis como un organismo modelo

B. subtilis se ha mostrado muy manejable para la manipulación genética, y se ha hecho, por lo tanto,

extensamente adoptado como un organismo modelo para estudios de laboratorio, sobre todo de

esporulación, que es un ejemplo simplificado de la diferenciación celular. En términos de popularidad

como un organismo modelo de laboratorio B. subtilis a menudo es usado como el equivalente Gram

positivo de Escherichia coli, un bacilo Gram negativo estudiado extensivamente.

CARACTERISTICAS

• Son bacterias Gram positivas, familia bacillaceae .

• Aerobio y anaerobio facultativo .

• Esporulado: las esporas son centrales, forma elipsoide y al formarse en el interior de la célula dan

lugar al hinchamiento de esta.

• Crecen entre los 10 - 48º, la temperatura óptima es entre 28 - 35º.

• Generalmente son móviles con flagelos perítricos.

• Poseen antígenos somáticos y flagelares y de esporas.

• Las reacciones serológicas no se usan en su identificación, ya que dan reacciones cruzadas con otros

géneros.

• Los antígenos de las esporas son termo resistentes al igual que las propias esporas.

• pH = 4,9 - 9,3; Aw = 0,93 - 0,95

bacillus subtilis provee un control efectivo de enfermedades causadas por hongos y bacterias. El

compuesto bioquímico presente en este producto combate los agentes patógenos por su modo de

acción. Posee alto espectro de acción. Aplicación foliar y radicular.

CULTIVO A PROTEGER

Brócoli, cebolla, ajo, especias, flores, fresas cucurbitáceas, lechuga, manzana, pera, papa, tomate,

jitomates, chiles, uvas, zanahoria, caña de azúcar, palma aceitera, plátano entre otras.
ENFERMEDADES A CONTROLAR

Pudrición sureña, Sclerotium rolfsii, Mildew, Mancha purpúra, Roya de la hoja, Puccinia Porri,

Alternaria porri, Pudrición coranaria de la raíz, Peronospora destructor, Tizón bacteriano,, Antracnosis,

Colletotrichum spp, Erwinia, Cenicillas, Oidium, Erisyphe, Sphaerotheca macularis, Alternaria

solanii,Phytopthora, Moho blanco entre otros.

BENEFICIOS

• Prevención de enfermedades causadas por hongos y bacterias

• Producto no toxico para insectos benéficos

• Este producto es usado como tratamiento en el control de un amplio espectro de patógenos de la

plántulas que causan el mal de la pudrición de la raíz

• los organismos antagónicos crecen y se multiplican alrededor del área de la raíz de los cultivos, ellos

compiten con los patógenos que atacan las nuevas raíces emergentes y en consecuencia reducen el

riesgos de infestación

Patogénesis: B. subtilis no es considerado patógeno humano; sin embargo puede contaminar los

alimentos, pero raramente causa intoxicación alimenticia. Sus esporas pueden sobrevivir la calefacción

extrema que a menudo es usada para cocinar el alimento, y es responsable de causar la fibrosidad en

el pan estropeado.

7.4 Condiciones de cultivos. 7.4.1 Cultivos aeróbicos Los cultivos aeróbicos se

realizaron en fermentadores Applikon (Capitulo 8.1) con un volumen de trabajo de 500 ml,
equipados con turbina tipo Rushton de 6 paletas planas. La temperatura fue controlada a 37°C. El
pH se mantuvo a 7.0 mediante adiciones automáticas de KOH 1N y 2N, y cuando fue necesario se
llevaron acabo adiciones automáticas de ácido fosfórico 0.5 M. La espuma fue controlada mediante
adiciones manuales de Silicón grado alimenticio al 10% (Droguería Cosmopolita). El oxígeno disuelto
fue controlado por arriba del 20% (con respecto al valor de saturación en aire) mediante un control
Proporcional-Integral-Derivativo (PID), por incrementos automáticos en la velocidad de agitación.
Los parámetros de control fueron determinados empíricamente y se ajustaron a valores de 3, 1500
y 0 para el proporcional, integral y derivativo, respectivamente. La velocidad de agitación inicial fue
de 600 rpm con un flujo constante de aire, 1 vvm. Los cultivos fueron monitoreados y controlados
mediante el Biocontrolador ADI 1010, la adquisición de datos se llevó a cabo con la ayuda de una
computadora personal mediante el software Bioexpert 1.20x de Applikon.

7.4.2 Cultivos anaeróbicos Los cultivos anaeróbicos se realizaron en sistemas de mini-

fermentadores o minifleakers (Beall et al., 1991; Anexo 12.3), con un volumen de trabajo de 200 ml.
La temperatura fue controlada a 37°C y el pH se mantuvo a 7.0 mediante la adición automática de
KOH 2N. Los cultivos se mantuvieron a una velocidad de agitación de 100 rpm para garantizar el
mezclado de los nutrientes.

GENERAL
Caracterizar a nivel fermentador parámetros cinéticos de crecimiento y de formación de productos
con Bacillus subtilis en condiciones aerobias y anaerobias utilizando como fuentes de carbono
glucosa, xilosa y celobiosa.

Bacillius sp;
Nombre científico de la bacteria:
Bacillus spp
Nombre(s) común(es):
Bacilos
Características microbiológicas:
Morfología microscópica y características de tinción
El genero Bacillus comprende grandes bacilos aerobios Gram positivos
que se organizan en cadenas. Son Bacilos de gran tamaño (4-10um),
son formadores de esporas, la mayoría no causa enfermedad y son
resistentes a condiciones desfavorables, en total existen 60 especies de
bacilos. La mayor parte de los miembros de este género es saprofita y
vive en la tierra, en el agua y aire, y en la vegetación. Algunos son
patógenos para los insectos. Estos microorganismos algunas veces
producen enfermedades en las personas inmunodeprimidas. La
presencia de esporas en los bacilos hace que este no tome mucho algún
colorante.
Se realizó la descripción de la morfología de las colonias de 43 cepas de Bacillus spp. (Tabla 2). Se
observa que una característica común en todas las colonias de Bacillus es su forma irregular y color
crema, la apariencia de los bordes de las colonias varía entre aserrada, lobulada, digitiforme y
ondulada; las elevaciones de la colonias suelen ser planas o acuminadas, en este último caso
presentan el centro más elevado en forma de anillo, la consistencia suele ser seca pero también se
presentan colonias cremosas y ligosas (Figura1). La gran mayoría presenta una superficie opaca, y
la consistencia y tamaño es variable. Wakita et al. (2007) reportan que las colonias de Bacillus
 presentan la característica de formar un anillo concéntrico y borde irregular en el centro. Esto es lo
que se observó en muchas de las cepas aisladas. Los resultados de las pruebas bioquímicas se
muestran en la Tabla 3; el 84% de las cepas aisladas muestran un comportamiento que las

Caracterización fisiológica. Crecimiento a temperaturas bajas.

Se colocaron 5 µl de cada una de las cepas seleccionadas (a una concentración de 108 cel/ml) en
placas conteniendo agar TGE por duplicado, y se incubaron a 4ºC, 10ºC, 15ºC y 20ºC; se evaluó el
crecimiento de las cepas durante 15 días para determinar su capacidad adaptativa y se comparó con
el crecimiento de la bacteria en una placa control incubada a 28ºC. Se consideró como escala
máxima el logrado en la placa control. A partir de esto se clasificó el crecimiento de las cepas del 0
al 4. Crecimiento a pH bajo. Se colocaron 5 µl de cada una de las cepas seleccionadas (a una
concentración de 108 cel/ml) en placas conteniendo agar TGE con pH regulado a 4, 5.5 y 7.0. Las
pruebas se hicieron por duplicado. El pH 7 se utilizó como control. Las placas se incubaron a 28ºC
por 7 días, al cabo de ese tiempo se evaluó el crecimiento de las cepas para determinar la capacidad
adaptativa a suelos de pH bajo que se presentan en algunas zonas altoandinas. Se utilizó el mismo
sistema de evaluación que para la temperatura, basado en una escala del 0 al 4, siendo este último
el máximo crecimiento de colonia alcanzado por la placa control.

Existen dos tipos de amilasas:

 Alfa amilasa: es la presente en el tubo digestivo de los animales. Esta enzima hidroliza los enlaces
1-4 carbohidratos de forma aleatoria dando lugar a una mezcla de dextrinas, maltosa y glucosa.
Actúa tanto sobre la amilosa como sobre la amilopectina, aunque en la amilopectina los puntos
próximos al enlace 1-6 no pueden ser hidrolizados.
 Beta amilasa: se encuentra principalmente en las plantas y también ataca los enlaces en posición 1-
4. Sin embargo en lugar de realizar la hidrólisis al azar, comienza su acción a partir de los extremos
no reductores del carbohidrato, y continúa a lo largo de la cadena rompiendo los enlaces y dando
lugar a unidades de maltosa (glucosa-glucosa). Las beta amilasas atacan el carbohidrato solo desde
los extremos por lo que son menos efectivas que las α-amilasas.
Las enzimas amilasas comerciales suelen obtenerse de microorganismos como
bacterias y hongos.

¿Para qué sirve?

Las amilasas pueden ser añadidas a productos alimenticios o complementos
alimenticios para mejorar la digestión de los carbohidratos. Pueden encontrarse
fácilmente en productos ricos en hidratos de carbono o complejos enzimáticos
dirigidos a mejorar la digestión.

Aplicaciones
Las amilasas son utilizadas para multitud de aplicaciones como por ejemplo para
la producción de jarabes de distintos oligosacáridos (maltosa y glucosa).
 La utilización de amilasas en la harina también facilita la acción de la levadura. La
adición de amilasas reduce los tiempos de fermentación y mejora los procesos de
fabricación del pan.

Otra aplicación de las amilasas es la aceleración de la maduración de las frutas.

Durante la maduración de frutas sintetizan amilasas, que degradan el almidón de
las frutas en azúcar, volviéndolas más dulces.

Dosis
Las dosis de amilasa que pueden encontrarse en los productos alimenticos con
muy variables, y en general depende del contenido de carbohidratos que contenga
el producto. Pueden encontrarse productos enriquecidos con amilasa desde 5 mg
por dosis, hasta suplementos enzimáticos en los que se suministran 720 mg por
dosis.

Existen dos tipos de amilasas:

 Alfa amilasa: es la presente en el tubo digestivo de los animales. Esta enzima hidroliza los enlaces
1-4 carbohidratos de forma aleatoria dando lugar a una mezcla de dextrinas, maltosa y glucosa.
Actúa tanto sobre la amilosa como sobre la amilopectina, aunque en la amilopectina los puntos
próximos al enlace 1-6 no pueden ser hidrolizados.
 Beta amilasa: se encuentra principalmente en las plantas y también ataca los enlaces en posición 1-
4. Sin embargo en lugar de realizar la hidrólisis al azar, comienza su acción a partir de los extremos
no reductores del carbohidrato, y continúa a lo largo de la cadena rompiendo los enlaces y dando
lugar a unidades de maltosa (glucosa-glucosa). Las beta amilasas atacan el carbohidrato solo desde
los extremos por lo que son menos efectivas que las α-amilasas.
Las enzimas amilasas comerciales suelen obtenerse de microorganismos como
bacterias y hongos.

¿Para qué sirve?

Las amilasas pueden ser añadidas a productos alimenticios o complementos
alimenticios para mejorar la digestión de los carbohidratos. Pueden encontrarse
fácilmente en productos ricos en hidratos de carbono o complejos enzimáticos
dirigidos a mejorar la digestión.

Aplicaciones
Las amilasas son utilizadas para multitud de aplicaciones como por ejemplo para
la producción de jarabes de distintos oligosacáridos (maltosa y glucosa).
La utilización de amilasas en la harina también facilita la acción de la levadura. La
adición de amilasas reduce los tiempos de fermentación y mejora los procesos de
fabricación del pan.

Otra aplicación de las amilasas es la aceleración de la maduración de las frutas.

Durante la maduración de frutas sintetizan amilasas, que degradan el almidón de
las frutas en azúcar, volviéndolas más dulces.

Dosis
Las dosis de amilasa que pueden encontrarse en los productos alimenticos con
muy variables, y en general depende del contenido de carbohidratos que contenga
el producto. Pueden encontrarse productos enriquecidos con amilasa desde 5 mg
por dosis, hasta suplementos enzimáticos en los que se suministran 720 mg por
dosis.

CONSIDERACIONES METABÓLICAS DE
B. SUBTILIS
Durante el crecimiento de
B. Subtilis
en glucosa, sin limitación de oxígeno, seproduce ácido acético como subproducto. Esto
sucede como respuesta a unexceso en el flujo de entrada de glucosa y por tanto a un
incremento en el flujoglicolítico a ácido pirúvico, el cual la célula es incapaz de utilizar en
su totalidadpara biosíntesis en el ciclo de Krebs. Este fenómeno ocurre cuando existe
glucosa

BACILLUS SUBTILIS2
en el medio en concentraciones suficientes para controlar, por medio de laproteína CcpA
(proteína de control catabólica), regiones reguladoras CRE(elementos de respuesta
catabólicos) en los promotores de algunos genes entrelos cuales están
ackA
y
pta
(acetato cinasa y fosfotransacetilasa) de la vía deproducción de ácido acético e
incluyendo también algunos genes de las rutas delcatabolismo de la glucosa. [1]
CONSUMO DE SUSTRATO
Estos incluyen fuentes de carbono orgánico, nitrógeno, fósforo, azufre e ionesmetálicos incluyendo
el hierro. Las bacterias secretan moléculas pequeñas
queunen el hierro (sideróforos, por ejemplo; enterobactina, micobactina). Lossideróforos (con el
hierro unido) son entonces internalizados vía receptores demebrana por la célula bacteriana. El
huésped humano también tiene proteínastransportadoras de hierro (por ejemplo: la transferrina). Por
lo tanto las bacteriasque compiten con el huésped por el hierro de forma ineficiente no son
patógenosexitosos.El desarrollo de nuevas tecnologías para obtener productos químicos de
granvolumen están basadas en el uso de sustratos abundantes y económicos, talescomo los
residuos agroindustriales, los cuales contienen principalmente mezclasde xilosa, glucosa y
celobiosa. Bacillus subtilis puede utilizarse para estos finespor su capacidad de metabolizar una
amplia variedad de azúcares. Sin embargosus características metabólicas para usar xilosa y
celobiosa en aerobiosis y parafermentar glucosa, xilosa y celobiosa no han sido estudiadas.Teniendo
en cuenta que La aplicación de la estequiometría requiere conocer losrendimientos. Estos se definen
como la relación entre el producto obtenido y elsustrato consumido (usualmente la fuente de carbono
y energía). Por ejemplo elrendimiento celular se define como:
¨
xs
dX Y dS

X y S representan la concentración de biomasa y sustrato respectivamente.Por lo que al reordenar

esta ecuación y derivando con respecto al tiempotenemos:
¨
1
xs
d S d X d t Y d t

Ó tambien

CONSUMO DE SUSTRATO PARAMANTENIMIENTO

Los microorganismos requieren energía para su mantenimiento y para procesos tales comola
motalidad
Los microorganismos requieren energía para su mantenimiento y para procesos tales como la
motalidad. La ecuación 1 s x x s r r Y   establece que el consumo de sustrato sólo es posible cuando
hay crecimiento, sin embargo cuando el sustrato considerado es la fuente de carbono y energía,
puede darse el caso en que el crecimiento es nulo (r x = 0) y el consumo de sustrato no. A este
consumo de sustrato que no redunda en aumento de biomasa se lo asocia con el mantenimiento de
funciones vitales tales como recambio de material celular, mantenimiento de gradientes de
concentración y movilidad. BACILLUS SUBTILIS 10 La expresión cinetica del mantenimiento es: m m
r k X   Dónde: km es el coeficiente de mantenimiento. El mantenimiento se puede expresar
cuantitativamente como la masa de sustrato oxidado por unidad de masa celular y por unidad de
tiempo necesario para proveer de energía al proceso. Que esta descrita por: , m m m s k X r Y  
Donde: k´m e el coeficiente de mantenimiento especifico (t-1 ) y Ym/s es la producción de energía
de mantenimiento por unidad de sustrato consumido por el proceso.
CINÉTICA DE CRECIMIENTO.

El oxígeno es el aceptor de electrones mas utilizado en la naturaleza, sin embargo y debido a su poca
solubilidad en medios acuosos se agota fácilmente y el ambiente tiende a volverse anaerobio. Una
vez que el oxígeno se ha consumido, BACILLUS SUBTILIS 6 una serie de procesos de oxidación
anaeróbica sigue en secuencia. Dicha secuencia está influenciada por la presencia de diversos
aceptores finales de electrones. Después de la desaparición del oxígeno, sigue la reducción de
nitratos, la reducción de sulfatos y la formación de metano. [2] Se define como fermentación al
proceso que se da cuando el sustrato es catabolizado y algún intermediario de la ruta sirve a su vez
como aceptor del poder reductor producido, dando como producto final una nueva molécula y
energía en forma de ATP producido por fosforilación a nivel de sustrato. Las enterobacterias,
levaduras, bacterias lácticas y muchos otros microorganismos pueden fermentar azúcares como la
glucosa o la lactosa, incluso parcialmente en presencia de oxígeno. Los productos acumulados
durante a fermentación ácido-mixta con enterobacterias son: etanol, ácido acético, ácido láctico,
ácido fórmico, ácido succínico, CO2 e hidrógeno. Estos productos se generan a partir de varias rutas
metabólicas que tienen como precursor al ácido pirúvico (fig. 1.1). La vía del butanodiol se presenta
en microorganismos de los géneros Klesiella, Serratia y Bacillus, entre otros. Se lleva a cabo en tres
reacciones a partir del ácido pirúvico, teniendo como intermediarios al acetolactato y la acetoina.
Los diversos productos de estas vías forzosamente deben lograr un balance redox. Está reportado
que cuando hay limitación de oxígeno, B. subtilis lleva a cabo la fermentación ácido mixta y
formación de butanodiol a partir de ácido pirúvico, el cual es convertido por la piruvato
deshidrogenasa en acetilCoA. El crecimiento de B. subtilis cuando fermenta glucosa es muy poco, y
se ha encontrado que se incrementa la capacidad fermentativa y el crecimiento cuando se adicionan
simultáneamente piruvato y glucosa, obteniéndose etanol, butanodiol, acetoina, lactato y acetato.