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Toxicidad deChromobacterium subtsugae a la chinche verde del sur

(Heteroptera: Pentatomidae) y al gusano de la raíz del maíz
(Coleoptera: Chrysomelidae)
Autor (es): Phyllis AW Martin, Edson Hirose, Jeffrey R. Aldrich
Fuente: Journal of Economic Entomology, 100 (3): 680-684.
Publicado por: Entomological Society of America
DOI: http://dx.doi.org/10.1603/0022-0493(2007)100[680:TOCSTS]2.0.CO;2
URL: http://www.bioone.org/doi/ full / 10.1603 / 0022-0493% 282007% 29100%
5B680% 3ATOCSTS% 5D2.0.CO% 3B2

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crítica.
 BIOLÓGICO Y METROICROBIAL CONTROL

Toxicidad de Chromobacterium subtsugae a la chinche verde del sur

(Heteroptera: Pentatomidae) y gusano de la raíz del maíz
(Coleópteros: Chrysomelidae)

PHYLLIS AW MARTIN,1 EDSON HIROSE,2,3 Y JEFFREY R. ALDRICH2

USDAÐARS, Laboratorio de Biocontrol de Insectos y Laboratorio de Productos Químicos que Afectan el Comportamiento de los Insectos,
Beltsville, MD 20705-2350

J. Econ. Entomol. 100 (3): 680Ð684 (2007)

ABSTRACTO Diabrotica spp. (Coleoptera: Chrysomelidae) escarabajos y chinches apestosas verdes del sur,
Nezara viridula (L.) (Heteroptera: Pentatomidae), son plagas del maíz, Zea mays L., y soja,
Glycine max (L.) Merr., Así como en cucurbitáceas. El control de estos insectos ha dependido de los productos químicos. Una
alternativa al control químico es el uso de biológicos. El uso de bacterias, hongos, virus, feromonas y metabolitos para
controlar estos insectos puede mejorar potencialmente el manejo de la resistencia y reducir el uso de pesticidas. Otro que
bacilo turingiensico Berliner, se han descubierto pocas bacterias que sean letales para cualquiera de estas plagas.
Chromobacterium subtsugae Martin et al., Una bacteria recientemente descrita que se sabe que es tóxica para el escarabajo
de la papa de Colorado, Leptinotarsa decemlineata (Say), larvas, resultó ser tóxico tanto para los escarabajos adultos
diabroticitos como para los adultos de la chinche verde del sur. En ensayos de laboratorio, las toxinas producidas por estas
bacterias matan del 80 al 100% de los adultos de dos especies de escarabajos diabroticitos,
Diabrotica undecimpunctata howardi Peluquero y Diabrotica virgifera virgifera LeConte, y el 100% de
verde del sur adultos de chinches apestosas dentro de los 6 d. Para la chinche apestosa verde, no se necesitaban bacterias vivas para
toxicidad.

PALABRAS CLAVE Diabrotica, Nezara viridula, biocontrol

Los escarabajos del gusano de la raíz del maíz son las principales
plagas del maíz, aunque ciertas especies de escarabajos
diabroticitas también se alimentan de soja, Glycine max (L.) Merr .;
los melonesCucumis spp.), pepinos, Cucumis sativus L., y
cacahuetes, Arachis hypogea L. Además de dañar el cultivo, los
escarabajos adultos transmiten marchitez bacteriana y
enfermedades virales (York 1992). La chinche verde del sur,
Nezara viridula (L.) (Heteroptera: Pentatomidae), es una plaga
de los cultivos de solanáceas, pero también tiene gustos más
generales que se extienden a la soja, otras leguminosas,
algodón (Gossypium spp.) y diversas hortalizas, incluidos los
tomates (Lycopersicum spp.) (McKinlay et al. 1992). Estos
insectos se controlan actualmente mediante el uso de
insecticidas, ya sea de manera profiláctica o en un programa
integrado de manejo de plagas. La propensión de los insectos
a desarrollar resistencia a los insecticidas ha fomentado el
uso de otros medios de control.
Una alternativa al control químico tradicional es el
uso de patógenos. Hongos, comoBeauveria bassiana
La mención de una marca comercial o producto patentado no constituye
una garantía del producto por parte del Departamento de Agricultura de los
Estados Unidos y no implica su aprobación con exclusión de otros productos
que también puedan ser adecuados.
1 Autor para correspondencia: Laboratorio de control biológico de insectos del USDAÐARS,
Beltsville, MD 20705-2350 (correo electrónico: phyllis.martin @ .ars.usda.gov ).
2 Laboratorio de Sustancias Químicas que Afectan el Comportamiento de los Insectos, Beltsville, MD
20705-2350.
3 Dirección actual: Universidade Federal do Paraná, Departamento de
Zoologia, Caixa Postal 19020, Curitiba, PR 81531-990, Brasil.
(Balsamo) Vuillemin y Metarhizium anisopliae
(Metschnikoff), para el control de estas plagas
(Krueger y Roberts 1997, Pereira y Roberts 1991, Sosa-
Gomez y Moscardi 1998). Bacterias, distintas debacilo
turingiensico Cepas de Berliner para el gusano de la
raíz del maíz (Diabrotica spp.) (Baum et al.
2004), no se utilizan para el control de estos insectos.
Otras bacterias como pigmentadasSerratia marcescens
Bizo se ha aislado de insectos muertos e implicado como
el agente causal de la enfermedad (Grimont y Grimont
1978). Los patógenos se han identificado tradicionalmente
utilizando los postulados de Koch (según Black 1996) en los que el
primer paso para identificar el agente causal es el aislamiento de
los insectos enfermos.
Bacterias pigmentadas violetas como Chromobacterium
violaceum Los Bergonzini se han aislado con poca frecuencia
de insectos y no se han considerado previamente dañinos
para los insectos (Bucher 1981). En el barrenador de grano
más grande,Prostephanus truncatus (Horn), estas bacterias
pueden estar involucradas en la digestión de la celulosa
(Vazquez-Artista et al. 1997), formando una asociación
simbiótica más que patógena. El genoma de
C. violaceum ha sido secuenciado. Además del pigmento
violeta violaceína, que tiene actividad antimicrobiana
contra bacterias grampositivas y gramnegativas (Duran
et al. 1983) yTrypanosoma cruzi Chagas (Duran et al.
1994), contiene un gen similar a un gen insecticida que se
encuentra en Photorhabdus luminescens
Junio de 2007 METROARTIN ET AL .: TOXICIDAD DE C. subtsugae PARA PAGest INSECTOS
Thomas y Poinar y en Nematophilia de Xenorhabdus
Poinar y Thomas (Consorcio Nacional Brasileño del
Proyecto Genoma 2003).
Una nueva especie de Chromobacterium, Chromobacterium
subtsugae Martin et al., Resultó ser tóxico para el escarabajo de la
patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata
(Diga) Martin et al. 2004). Aquí, describimos la toxicidad de estas
bacterias en ensayos de laboratorio para otras plagas de insectos:
dos especies de gusanos de la raíz del maíz y la chinche apestosa
verde del sur.
Materiales y métodos
Cepas bacterianas y medios. Las colonias violetas de la cepa
bacteriana PRAA4-1 fueron aisladas en el verano de 2000, de suelo
de bosque de Maryland plantado en agar L, por S. Stone (Martin et
al. 2004). Las bacterias violetas eran Gramrods, identificadas
preliminarmente comoC. violaceum en comparación con las
descripciones del manual de Bergey (Sneath
1984) .Cuando se secuenciaron los primeros 500 pb del ADN
ribosómico 16S, la identificación fue solo para el género
Cromobacteria (Accugenix, Newark, DE). Esta cepa bacteriana
se ha subcultivado semanalmente a temperatura ambiente
en agar L (Atlas 1997). Para los recuentos bacterianos,
usamos agar RM (Martin et al. 1998), que contiene la mitad de
los nutrientes del agar L. Debido a que los recuentos de
bacterias viables no se correlacionaron con la toxicidad,
usamos la densidad óptica como una medida de la densidad
celular. La correlación entre la densidad óptica y la toxicidad
para el escarabajo de la patata de Colorado fue de 0,77
(PAWM, datos no publicados).
Caracterización preliminar de toxinas. Las bacterias se cultivaron
en placas de agar-L a 25 ° C durante 48 h para probar si las bacterias
podían recuperarse de los insectos muertos, cumpliendo así los
postulados de Koch para identificar un patógeno; o durante 120 h para
una mayor estabilidad durante el almacenamiento. Las bacterias se
recogieron en 15 ml de agua destilada estéril. Se esterilizaron en
autoclave volúmenes de diez mililitros a 121 ° C durante 10 min para
probar la estabilidad. Las células se retiraron de la suspensión por
centrifugación y se filtraron a través de un
Filtro Millipore de 0,45 m (Millipore Corporation, Billerica, MA)
para producir un sobrenadante libre de células. La fracción de
sedimento se formó resuspendiendo el sedimento hasta el
volumen original.
Insectos La colonia de chinches apestosas verdes del sur
se originó a partir de especímenes recolectados cerca de
Stoneville, MS, y los insectos se criaron en la ducha del sol,
Helianthus annuus L., semillas y judías verdes, Phaseolus
vulgaris L., a 28 C, 65% de HR y un fotoperíodo de 16: 8 (L: D)
h (Aldrich et al. 1993).
Inicialmente, los gusanos de las raíces del maíz del sur,
Diabrotica undecimpunctata howardi Barber (Coleoptera:
Chrysomelidae), se obtuvieron de French Agricultural Research,
Inc. (Lamberton, MN). Los adultos se mantuvieron durante 3
semanas antes de la prueba a 24 C, 30% de HR y un fotoperíodo
de 16: 8 (L: D) h. Los escarabajos se alimentaron con una dieta
artificial (Branson y Jackson 1988). Más tarde, se estableció una
colonia de gusanos de la raíz del maíz en el sur a partir de insectos
recolectados en el campo de Beltsville, MD, en 2003. La colonia se
ha mantenido en las raíces del maíz para las larvas y en las cuas y
agua para los adultos. Los insectos recolectados en el campo se
introducen anualmente para mantener la di-
681
Versity. Gusanos de la raíz del maíz occidental,Diabrotica
virgifera virgifera LeConte, se obtuvieron de C. Neilson
(USDAÐARSÐNGIRL, Brookings, SD) y se mantuvieron en las
mismas condiciones descritas para los gusanos de la raíz del
maíz del sur.
Bioensayos. Las chinches apestosas verdes del sur se
incubaron 48 h en jaulas de plástico sin agua. Se utilizaron
veinte adultos por tratamiento con cinco chinches por jaula.
Los machos y las hembras se probaron por separado. Las
suspensiones deC. subtsugae se entregaron a los adultos en
1 ml de líquido compuesto por 0,5 ml de agua destilada y 0,5
ml de suspensión bacteriana. Los tubos de microcentrífuga
que contenían el material de prueba o agua como control se
taparon con algodón y se reemplazaron cada 3 días. La
mortalidad se registró diariamente durante 6 días. Los
tiempos de supervivencia se determinaron con el
procedimiento LIFEREG utilizando la distribución de Weibull
con intervalos de confianza del 95% (SAS Institute 2004),
debido a la limitación del número de insectos (Preisler y
Robertson 1989).C. subtsugae a las ninfas, pero las ninfas no
se alimentaron consistentemente en un sistema de
suministro de líquido.
La toxicidad de C. subtsugTambién se ensayó la ae a los adultos
de stickbug verde mediante inyección de cultivos muertos
(esterilizados en autoclave a 121ºC durante 20 min). Se inyectó
ventralmente un microlitro de cultivo sin diluir en el abdomen de
10 machos y 10 hembras. Los controles de 10 machos y 10
hembras también se inyectaron con agua destilada estéril. La
mortalidad se registró diariamente durante 5 días.
Los ensayos del gusano de la raíz del maíz se realizaron con
escarabajos adultos del gusano de la raíz del maíz del sur o del
gusano de la raíz del maíz occidental de sexos mixtos, como
describen Schroder et al. (2001).C. subtsugae se recogió a las 48 h
en 20 ml de jugo de sandía que contenía glicósido de
cucurbitacina-E al 0,08% (Matsuo et al. 1999) mezclado con
almidón Mirasperse al 3% (AE StaleyManufacturer Co., Decatur, IL).
Se añadieron cinco gotitas de 25 l a cada placa de Petri de 100
mm. Se agregaron cinco escarabajos a cada plato y los controles
(sin las bacterias) y los tratamientos se repitieron cinco veces. A las
48 h, se introdujo humedad adicional mediante una mecha dental
previamente humedecida y se añadió alimento adicional (ya sea la
dieta del gusano de la raíz del maíz occidental o la calabaza). La
mortalidad se registró 5 días después de iniciado el tratamiento.
Para los ensayos de larvas del gusano de la raíz del maíz, los
huevos se incubaron y las larvas se alimentaron en raíces de maíz
germinadas en arena a temperatura ambiente. Las raíces se
mantuvieron húmedas mediante riego diario. Las larvas (16) se
extrajeron después de 3 semanas y se transfirieron a gránulos de
dieta liofilizados (Martin 2004a) hechos con una dieta de gusanos
de la raíz del maíz (BioServ, Frenchtown, NJ), que se habían
rehidratado con agua oC. subtsugae suspensión. Las larvas en
bandejas selladas se incubaron a 25 ° C y 50% de HR en la
oscuridad. La mortalidad se registró cada 24 h. Las larvas
supervivientes se pesaron después de 4 d. Las diferencias de peso
se compararon mediante PROC MIXED (SAS Institute 2004).
Recuperación de C. subtsugae de Insectos Muertos. Porque
la viabilidad de C. subtsugae declina después de 72 h de
crecimiento en medio, la recuperación de insectos se realizó
utilizando cultivos que no crecieron en medio sólido durante 48 h.
Insectos que habían muerto después de ingerirC. subtsugae Las
células se trituraron en 0,5 ml de agua estéril utilizando un
682 JNUESTRO DE miCONÓMICO miNTOMOLOGÍA
Figura 1. Tiempos de supervivencia de cultivos de 48 y 120 h de C.
subtsugae contra la chinche verde del sur. Barras oscuras, machos; barras de
luz, hembras. Las barras de error representan 95% CL. La mortalidad de
control para las hembras fue del 0% (0/20) y para los machos fue del 15%
(3/20).
mortero y maja en miniatura. Se dejaron sedimentar las partículas
grandes y el líquido se sembró directamente en agar L y se incubó
durante 48 horas y se puntuó con 25 Cand para las colonias
violetas típicas de las bacterias.
Resultados
Chinche verde del sur. Se sabe que los chinches verdes del sur
machos y hembras difieren en su respuesta a los insecticidas
(Panizzi e Hirose 1995), por lo que se probaron contra C.
subtsugae por separado. Para el tratamiento con cultivos sin
diluir, la mortalidad para ambos sexos generalmente alcanza el
100% a los 6 días, y la principal diferencia entre machos y hembras
es la rapidez con la que mueren. En la mayoría de los ensayos, las
chinches hembras no empezaron a morir hasta el día 4, mientras
que la mortalidad a menudo se produjo en los chinches hembras
machos tratados al segundo día. Esta diferencia se expresa mejor
por diferencias en los tiempos de supervivencia con cultivos que
tenían 48 h de edad.
Para cultivos sin diluir con la misma densidad óptica
(SOBREDOSIS600 2.3), los machos murieron un 29% más rápido que los
hembras para cultivos que se recolectaron a las 48 h, pero solo un
15% más rápido para cultivos recolectados a los 5 d (Fig. 1). La
mortalidad final de las hembras fue del 90% y de los machos del
95%. Sin embargo, los machos murieron más rápido solo cuando
se utilizó la fracción asociada a células. Cuando se usó el
sobrenadante libre de células para el tratamiento, el tiempo de
supervivencia fue esencialmente idéntico tanto para hombres
como para mujeres, aunque hubo más variabilidad para las
mujeres (Fig. 2). En estos ensayos, todos los machos murieron a
los 6 d después del tratamiento con el cultivo completo, el
sobrenadante o el sedimento resuspendido. Sin embargo, la
mortalidad femenina fue del 100% solo en todo el cultivo y los
tratamientos con sobrenadante. La mortalidad final de las
hembras alimentadas con el gránulo resuspendido fue sólo del
70%. Para probar la estabilidad, se probaron los cultivos
completos esterilizados en autoclave. Hubo pequeñas diferencias
en los tiempos de supervivencia entre los cultivos completos y la
suspensión esterilizada en autoclave para machos o hembras (Fig.
3). En los tratamientos con la suspensión esterilizada en autoclave,
la diferencia en los tiempos de supervivencia entre machos y
hembras también estuvo ausente, según se determinó mediante
la superposición de intervalos de confianza del 95%. La mortalidad
final de machos y hembras en los cultivos esterilizados en
autoclave fue del 95%. Una dilución 1: 3 de sobrenadantes mató al
50% de las hembras y una dilución 1: 6 mató al 50% de los machos.
Vol. 100, no. 3
Figura 2. Tiempos de supervivencia para culturas enteras y separadas
culturas de C. subtsugae contra la chinche verde del sur. Barras oscuras,
machos; barras de luz, hembras. Las barras de error representan el 95%
CL. La mortalidad de control para las hembras fue del 5% (1/20) y para los
machos fue del 10% (2/20).
Tras la inyección, solo los machos que recibieron la C.
subtsugae inyección murió. Toda la mortalidad (70%) ocurrió
dentro de los 2 d. No hembras recibiendoC. subtsugae
inyecciones y ningún control murió.
CornRootworm. Aproximadamente el 80% de los adultos del gusano
de la raíz del maíz del sur y del oeste murieron cuando se alimentaron
C. subtsugae en una formulación de cebo (Fig. 4). Los escarabajos
consumieron todas las gotas de cebo de control, mientras que las
gotas violetas que conteníanC. subtsugae todavía eran visibles al
final del ensayo. En ensayos adicionales, el 100% de los adultos del
gusano de la raíz del maíz del sur murieron dentro de las 120 h,
mientras que la mortalidad del control fue del 13,3%.
Para las larvas, la mortalidad alcanzó solo el 40% cuando se alimentaron
cultivos enteros a los 4 d (OD600 2.31). Sin embargo, hay
fue una diferencia signicativa (gl 24, PAG
0,0057) en peso entre los controles supervivientes (15,02
1,24 mg) y los tratados con C. subtsugae (9,81
0,86 mg). Las larvas de control se enterraron en los gránulos
de la dieta y produjeron excrementos. Para elC. subtsugae-
larvas tratadas, no hubo evidencia de alimentación ni
excremento.
Recuperación de C. subtsugae fromDead Insects. Once
adultos de chinche apestosa verde del sur que murieron fueron
molidos después de ser alimentados C. subtsugae. Aunque de
todos ellos se recuperaron bacterias vivas, con títulos que oscilan
entre 103 a 105 células por insecto, no hubo colonias violetas
Fig. 3. Tiempos de supervivencia para autoclave versus no autoclave
culturas claved de C. subtsugae contra la chinche verde del sur. Barras
oscuras, machos; barras de luz, hembras. Las barras de error
representan 95% CL. La mortalidad de control para las hembras fue del
15% (3/20) y para los machos del 20% (4/20).
Junio de 2007 METROARTIN ET AL .: TOXICIDAD DE C. subtsugae PARA PAGest INSECTOS
Figura 4. Porcentaje de mortalidad de adultos del gusano de la raíz del maíz del
sur (barras oscuras) y del oeste (barras claras) cuando se alimentan con cultivos
enteros de C. subtsugae. Las barras de error representan el error estándar. La
mortalidad de control para el gusano de la raíz del maíz occidental se muestra con una
línea gruesa y la mortalidad de control del gusano de la raíz del maíz del sur se
muestra con una línea delgada.
recuperado enRMagar. Se trituraron cinco gusanos de la
raíz del maíz del sur y no se recuperaron colonias violetas
en agar RM.
Discusión
La muerte de los adultos de la chinche apestosa verde del sur y del
gusano de la raíz del maíz después de consumir C. subtsugae en agua o
en una formulación de cebo fueron similares a los resultados con el
escarabajo de la papa de Colorado (Martin et al. 2004). La reducción del
peso o la inhibición de la alimentación con las larvas del gusano de la
raíz del maíz fue similar a la observada conLymantria disparL.) (Martín
2004b). Aunque se utilizaron cultivos bacterianos completos en la
mayoría de los experimentos, las bacterias vivas no parecen ser
necesarias para la letalidad. Varias líneas de evidencia apoyan esta
hipótesis. Primero, las bacterias productoras de pigmento violeta no se
pudieron aislar de las chinches apestosas ni de los gusanos de la raíz
del maíz que habían muerto después de alimentarse deC. subtsugae
células. Por lo tanto, el primer paso para identificar un patógeno no
pudo cumplirse. En segundo lugar, en el caso de las chinches
hediondas, los Þltrados libres de células por sí solos causan la
mortalidad. En tercer lugar, las células matadas por autoclave también
mataron a las chinches hediondas de una manera similar a los cultivos
completos viables. En cuarto lugar, las células muertas en autoclave
mataron al 70% de las chinches hediondas masculinas en 48 h mediante
inyección. Los datos de las inyecciones mostraron la diferencia más
obvia en la susceptibilidad entre machos y hembras (Panizzi y Hirose
1995). Esto sugiere que una toxina termoestable es responsable de la
mortalidad. Se sabe que las toxinas insecticidas orales termoestables,
como la exotoxina, son producidas por cepas deB. thuringiensis (
Šebesta y col. 1981). Los intentos de localizar la toxicidad en las
fracciones solubles (sobrenadante) o en partículas (gránulos) no
tuvieron éxito, porque se observó una toxicidad significativa con ambas
fracciones.
Aunque se utilizaron cultivos bacterianos sin diluir para matar
estos insectos, las formulaciones de cebo con atrayentes para
N. viridula (Aldrich y col. 1993) o estimulantes de la alimentación
para los escarabajos diabroticita (Schroder et al. 2001) podrían
aumentar la concentración efectiva de las toxinas en el campo.
Para los adultos del gusano de la raíz del maíz, la alimentación
compulsiva de formulaciones que contienen cucurbitacina
asegura la ingestión de una dosis letal (Schroder et al.
1998). La mortalidad de las larvas del gusano de la raíz del maíz del sur fue
683
baja (40%), pero la alimentación se inhibió como lo demuestra la
falta de aumento de peso.
Lo que queda es determinar si las combinaciones de
atrayentes o cebos pueden ser efectivas en el campo y si las
ninfas de N. viridula se alimentará y se alegrará porC.
subtsugae. Es inusual que un compuesto oralmente activo
producido por bacterias se descubra por primera vez como
letal para los adultos. La -endotoxina deB. thuringiensis mata
la etapa larvaria de la mayoría de los insectos (Schnepf et al.
1998). Incluso la toxina deC. subtsugae no mató a los
escarabajos adultos de Colorado, pero mató en todos los
estadios de las larvas que se alimentan (Martin et al. 2004).
Expresiones de gratitud
Agradecemos a los siguientes estudiantes de la preparatoria Eleanor
Roosevelt; S. Piedra para el aislamiento de PRAA del suelo, y
H. Romani por algunos bioensayos; y los empleados de los Estados Unidos, L.
Liska, por la cría de insectos, y A. Shropshire, por la coordinación de los
bioensayos y la asistencia técnica general.
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Recibido el 30 de diciembre de 2004; aceptado el 19 de enero de 2007.