UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE

MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

ZARAGOZA

MODULO: DESARROLLO ANALITICO

Cuantificación de Ranitidina, Metotrexato y

Ambroxol en Suero por HPLC.

Asesor:
Dr. Vicente Jesús Hernández Abad

Equipo
Grupo 2801
Semestre 2020-2
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FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA
DESARROLLO ANALITICO
CUANTIFICACION DE RANITIDINA, METOTREXATO Y AMBROXOL EN SUERO POR HPLC

Ranitidina.
Estructura Química:
Formula Condensada: C13 H22 N4 O3 S
Peso molecular: 314.40 g/mol
Punto de Fusión: 69-70°C
Densidad: 1.184 +/- 0.06 g/cm3 a 20°C
Presión 760Torr
pKa: 8.35 a 25°C
Log P: 0.27
Aspecto:
Polvo blanco cristalino blanco o amarillo claro. La Ranitidina presenta el fenómeno de
Polimorfismo. Es sensible a la luz y la humedad.
Solubilidad:
Fácilmente soluble en aguay metanol, muy soluble en etanol, poco soluble en cloruro de
metileno.
Mecanismo de Acción:
Antagoniza los receptores H2 de la histamina de las células parietales del estómago. Inhibe la
secreción estimulada y basal de ácido gástrico y reduce la producción de pepsina.

Metotrexato
Estructura Química:
Formula Condensada: C20 H22 N8
O5
Peso molecular: 454.44 g/mol
Punto de Fusión:
Densidad:
pKa: 3.47
Log P: 4.5

Aspecto:
Polvo Cristalino de color amarillo a naranja
Solubilidad: Fácilmente soluble en soluciones diluidas de hidróxidos alcalinos y carbonatos,
ligeramente soluble en solución 6N de ácido clorhídrico, casi insoluble en agua, alcohol,
cloroformo y éter dietílico.
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CUANTIFICACION DE RANITIDINA, METOTREXATO Y AMBROXOL EN SUERO POR HPLC

Ambroxol
Estructura química:

Formula Condensada: C13 H18 Br2 N2 O

Peso molecular: 378.10 g/mol
Densidad: 1.70+/- 0.1 g/cm3
pKa: 8.69
Log P: 4.5

Mecanismo de Acción:
El ambroxol actúa sobre los neumocitos tipo II estimulando la síntesis y la secreción del
surfactante pulmonar. Además, interviene coadyuvando en la producción y el transporte de la
secreción bronquial. Esto permite disminuir la secreción bronquial y favorecer la permeabilidad
de la luz alveolar y bronquial.

Cuantificación de los Principios Activos por separado en HPLC

Ranitidina Ambroxol Metotrexato Metotrexato

Equipo HPLC ocupado en la Cuantificación.
Sistema de HPLC Sistema de HPLC Sistema de HPLC Sistema de HPLC
(Shimadzu, Japón) (Shimadzu, Japón) (Shimadzu, Japón) (Shimadzu, Japón)
Bomba
Constaba de dos
Bomba: LT 10ATVP
Módulo de suministro bombas modelo
Y Sistema de
de solvente LC-10AT ADVP
Inyección Rheodyne
LC-10
Detector
Detector Un detector SPD-
Detector UV/Visible
Espectrofotométrico 10AVP UV-VIS para
Longitud de Onda:
UV/Visible- spd-10a la detección de AM a
313 nm
con software lc10. 254 nm.
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CUANTIFICACION DE RANITIDINA, METOTREXATO Y AMBROXOL EN SUERO POR HPLC

Ranitidina Ambroxol Metotrexato Metotrexato

Columna

El sistema estaba
equipado con dos
columnas:
Columna
Tracer analytica, una era sílice corta
INERTSIL ODS-3V C-
Nucleosil, C8 m-Bondapak CN
18,
(columna de acero recubierta de Columna analítica
4.6 × 250 mm
inoxidable de 25 cm proteína, (10 mm Zorbax Eclipse
Material Base: 3 series
de longitud y 4.6 mm i.d., 20 mm XDB – C 8
de Silica Gel de alta
diámetro interno de de tamaño de de 2.1 mm × 150.0
pureza
0,4cm empaquetado partícula) mm de diámetro
Tamaño de partícula
con esferas de sílice La otra era una interno, tamaño de
5μm
porosas de 5 mm de columna analítica partícula 3.5 mm
Tamaño del poro
diámetro). ZORBAX Eclipse
(10nm)
XDB-C18 (150 4,6
Rango de pH 2-7.5
mm i.d., 5 mm de
tamaño de partícula
de Agilent
Technologies).
Fase Móvil
Se emplearon dos
Fase móvil que fases móviles
consistía en acetato diferentes en el
de amonio 50 mM procedimiento de
que contenía ensayo. Una era La fase móvil consiste
laurilsulfato de sodio una solución salina La fase móvil en Buffer Tris-Fosfato
25 mM (pH 3,8, tampón de fosfato consistió en una (0.1M
ajustado con ácido (pH 7,4) (MI) mezcla de dihidrogenofosfato y
acético glacial), La segunda fase acetonitrilo al 25% 0.01 M tris; pH
acetonitrilo y mezcla móvil (MII) fue una en agua que 5.7):Metanol:Acetonitrilo
de metanol (40: 40: mezcla de metanol- contenía ácido con la proporción de
20, v / v). velocidad agua desionizada fórmico al 0,1% v / v 70:20:10
de 1,0 ml / min. El destilada (que a una velocidad de respectivamente. la
eluato se controló a contenía 1% de flujo de 0,15 ml min velocidad de flujo fue
330 nm. La trietilamina ajustada de 1mL/min
sensibilidad se a pH 3,5 con ácido
estableció en 0.005 orto-fosfórico) en
AUFS. una proporción de
50:50 (v / v)
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CUANTIFICACION DE RANITIDINA, METOTREXATO Y AMBROXOL EN SUERO POR HPLC

Ranitidina Ambroxol Metotrexato Metotrexato

pKa
pka 8.35- base débil pka 8.69 base débil pka 3.47 ácido débil pka 3.47 ácido débil

Preparación de la muestra
A 500 ml de suero y 10 ml de solución de metoclopramida (1 mg / ml) y se añaden 600 ml de
NaOH 2 M y se mezclan bien durante 2 minutos. A esto se añaden aproximadamente 500 mg
de NaCl y 8 ml de diclorometano y se agita en vórtex durante 5 minutos seguido de
centrifugación a 5000 rpm durante 30 minutos. La fase orgánica se separa y se evapora bajo
nitrógeno gaseoso a 45ºC. El residuo se reconstituye en 100 ml de fase móvil y se añaden 20
ml de esta solución a la columna de HPLC.
Método Propuesto

Factor Valores

Columna
cromatográfica Columna de acero inoxidable C8 de 25 cm de longitud y
diámetro interno de 0,46 mm

Detector UV-Visible simple

Longitud de onda 254 nm

Diámetro interno 0.46 mm

Tamaño de partícula 3-5μm

Longitud de la 25cm
columna

Fase móvil
Mezcla de Buffer de fosfato pH 7,5 : acetonitrilo:metanol

Par iónico Tetrabutilamonio Hidrógeno Fosfato

pH: 7.5
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CUANTIFICACION DE RANITIDINA, METOTREXATO Y AMBROXOL EN SUERO POR HPLC

Justificación:
El valor de longitud de onda elegido fue el de 254 nm ya que es el máximo valor de absortividad
que presenta el ambroxol, ya que los valores máximos de absortividad de la ranitidina y el
metotrexato son 330 y 306 respectivamente tienen la posibilidad de poder revelarse a la longitud
de 254 nm, sin embargo, el ambroxol no se podría diferenciar a la absortividad que presentan
la ranitidina y el metotrexato.
La columna elegida al tener una longitud de fase reversa C8 esto indica que el tiempo de
retención para los fármacos más liposolubles disminuirá.
Se eligió un pH intermedio entre los ácidos y las bases para que se encontraran disociados en
el medio y con ello se pudieran cuantificar de una mejor manera las tres sustancias de interés.
El par iónico se eligió para evitar que los componentes se quedarán retenidos en la fase sólida.
Tiempos de Retención debido a su solubilidad.
Metotrexato presenta un Log P de -0.446 que demuestra su hidrosolubilidad a comparación de
Ranitidina y Ambroxol cuyos Log P son de 0.27 y 4.5, respectivamente; por lo que se puede
concluir que el tiempo de retención de Ambroxol será mayor que los otros dos fármacos por su
liposolubilidad, y Metotrexato tendrá el menor tiempo de retención en la columna por su
hidrosolubilidad.
Referencias Bibliograficas
1. Ranitidina [Internet] SciFinder [Consultado 21May2020] Disponible en https://scifinder-
cas-org.pbidi.unam.mx:2443/scifinder/view/scifinder/scifinderExplore.jsf
2. Metotrexato [Internet] SciFinder [Consultado 21May2020] Disponible en https://scifinder-
cas-org.pbidi.unam.mx:2443/scifinder/view/scifinder/scifinderExplore.jsf
3. Ambroxol [Internet] SciFinder [Consultado 21May2020] Disponible en https://scifinder-
cas-org.pbidi.unam.mx:2443/scifinder/view/scifinder/scifinderExplore.jsf
4. Emara A., Kamal, M., Kawi, M.A., On - Line Sample and Enrichment Chromatographic
Technique for the Determination of Ambroxol in Human Serum. Jornual Of
Chromatographic Science, 2012 50 (91) 91-96
5. Koufopanelis, P, Georgakakou, S., Kazanis, M., Direct injection
chromatography/positive ion electrospray ionization mass spectrometric quantification of
methotrexate, folinic acid, folic acid and ondansetron in human serum. Journal of
Chromatography B, 2009, 887, 3850 -3856
6. Ruiz, A., Tobón, M., Holguin, M. Desarrollo y Validación de un Método analítico para la
cuantificación de Ranitidina en plasma por Cromatografia Liquida de Alta Resolución
(HPLC)
7. Nagulu, M., Kiran V.U., Krishna R., HPLC Method of Determination of Methotrexate in
Human Serum. Asian Journal of Chemistry, 2009, 21(9) 6845-6851