CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA Y DE COLUMNA

ÍNDICE
1. OBJETIVOS…………………………………………….……………………….pág.2

2. FUNDAMENTO TEORICO………………………………………...….……..pág.2-3

3. DATOS Y RESULTADOS…………………………………………….….…pág.4-7

3.1 Datos experimentales:

- Tabla Nº1:Cromatografía de columna

- Tabla Nº2:Cromatografía de capa fina

3.2 Datos teóricos:

- Tabla Nº3:Propiedades fisicoquímicas Oxido de aluminio (Alúmina)

- Tabla Nº4:Propiedades fisicoquímicas del n-Hexano
- Tabla Nº5:Propiedades fisicoquímicas de la Acetona

3.3 Resultados:………….………………………………………………….pag 7

- Tabla Nº6: Cromatografía de columna

- Tabla Nº7: Cromatografía fina -Determinación de Rf

4. DIAGRAMAS DE FLUJO …………………………………………….….…pág.8-9

5. OBSERVACIONES………..………………..………………..…..………...…pág.10

6. DISCUSIONES DE RESULTAD………………………………..……….….pág.11

7. CONCLUSIONES…………………………..…………………….…….……..pág.12

8. APENDICE……………………………………………………………………………
…………………..…….pág.

8.1 Aplicación Industrial

9. BIBLIOGRAFIA………………………………………………………………………
…………………….pág.

Lab N°04: CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA Y DE COLUMNA

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1. OBJETIVOS:

 ACADEMICOS:

- Conocer las distintas técnicascromatografícas, sus características y los

factores que intervienen en ella y entrenar en ellas en la extracción de los
componentes de un pigmento.

 PRACTICOS:
- Extracción por medio de la cromatografía de columna los componentes del
pigmento como el caroteno (amarillo) y la clorofila (verde) e identificarlos.
- Extracción por medio de la cromatografía en capa fina los componentes del
pigmento e identificarlos.

2. FUNDAMENTO TEORICO:

 CROMATOGRAFIA:

Se define como el método usado principalmente para la separación de los

componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos
fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase
estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel
(matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida
en una capa, distribuida como una película, etc.

Tipo Fase estacionaria fase móvil

líquido-sólido sólido inerte como gel de sílice o alúmina disolventes

intercambio soluciones
resina cambiadora
iónico acuosas
Líquido-
líquido adsorbido en un soporte sólido líquido
líquido
película de líquido adsorbida sobre un
gas-líquido gas
soporte sólido

 Cromatografía en columna
En la cromatografía en columna la separación se consigue haciendo fluir la
mezcla a través de una columna de adsorbente. Los compuestos emergen de
la columna a tiempos diferentes, y pueden ser recogidos en fracciones
separadas.

 Cromatografía en capa fina

La técnica de cromatografía en capa fina es una de las más comunes 2
empleadas. La cromatografía en capa fina usa como fase estacionaria un

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sólido como gel de sílice conteniendo algún material que hace que se
mantenga e fase estacionaria sobre un soporte tal como placas de vidrio

Silicagel

Se trata de un adsorbente polar, el gel de sílice o ácido silícico es uno de los

más utilizados, es débilmente ácido, su pH oscila entre 4-5. Generalmente
lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato de cálcico
semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente.

Ventajas de la cromatografía en capa fina

La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros

métodos cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa,...) El
tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la
separación es generalmente mejor. El método es simple y los resultados son
fácilmente reproducibles, lo que hace que sea un método adecuado para
fines analíticos.

Constantes Rf

La constante RF es simplemente una manera de expresar la posición de un

compuesto sobre una placa como una fracción decimal, mide la retención de
un componente. Se define como:

La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el

centro de la mancha. Para que los RFsean reproducibles deben ser fijadas
una serie de condiciones (Espesor de la placa, fase móvil, fase estacionaria,
cantidad de muestra). El máximo valor de RFque se puede alcanzar es de
1, lo ideal es un RF entre 0.65 y 0.7.

Eluyente:
Un eluyente es un disolvente que se usa para transportar los componentes
de una mezcla a través de una fase estacionaria.

La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a

separar y del material en que la separación se lleva a cabo.

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3. DATOS Y RESULTADOS:

3.1 DATOS EXPERIMENTALES:

Muestra : pigmentos de la hoja de espinaca

- Tabla Nº1:Cromatografía de columna

n – Hexano 20 mL
Alúmina 5 gramos
Arena 2 mm (en la columna)
Acetona 5 mL

- Tabla Nº2:Cromatografía de capa fina

Sustancia Cantidad X (cm) Y(cm)

Acetona 8ml 4.5
n-hexano 8ml 0.5 5.5
Mezcla n-hexano 5ml 3.2 5.4
Acetona 3ml

Donde :
X = Distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación
Y= distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente

3.2 DATOS TEORICOS:

- Tabla Nº3:Propiedades fisicoquímicas Oxido de aluminio (Alúmina)

OXIDO DE ALUMINIO
Formula molecular C2H6O
PROPIEDADES FISICAS
Estado de agregación Solido
Apariencia polvo blanco
PROPIEDADES QUIMICAS
Solubilidad Insoluble en agua
PELIGROSIDAD

4
RIESGOS USOS

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La inhalación de altas concentraciones  Es utilizada para el secado del aire

de polvo de ésta sustancia puede
originar irritación de los ojos y tracto comprimido ya que tiene la propiedad de
respiratorio superior. adsorber y desorber el agua.

- Tabla Nº4:Propiedades fisicoquímicas del n-Hexano

n-Hexano
Formula molecular C6H14

Formula desarrollada

PROPIEDADES FISICAS
Estado de Agregación Liquido
Apariencia Incoloro de olor característico
Punto de inflamación -22 ºC
PROPIEDADES Q UIMICAS
Solubilidad En solventes orgánicos
PELIGROSIDAD

INFLAMABLE NOCIVO MEDIO AMBIENTE

RIESGOS
PELIGROS PARA LA SALUD
La sustancia irrita los ojos y la piel. La
ingestión puede originar neumonitis
química. La sustancia puede causar
efectos en el sistema nervioso central.
PELIGROS QUIMICOS
Reacciona con oxidantes fuertes,
originando peligro de incendio y
explosión.
PELIGROS AL MEDIO AMBIENTE:
Puede ser peligrosa para el ambiente;
debería prestarse atención especial a los
organismos acuáticos.
PRECAUCIONES
4 Mantener en lugar fresco y bien
cerrado. Separado de oxidantes
fuertes.
5 Evitar las llamas, NO producir
chispas y NO fumar.
USOS
 El hexano es utilizado como disolvente
para algunas pinturas y procesos
químicos aunque su uso en industrias
controladas está más restringido.

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- Tabla Nº5:Propiedades fisicoquímicas de la Acetona

ACETONA
Formula molecular C3H6O

Formula desarrollada

PROPIEDADES FISICAS
Estado de agregación Liquido
Apariencia Incoloro
Punto de inflamabilidad -20 ºC
PROPIEDADES QUIMICAS
Solubilidad en H2O Soluble. También puede disolverse en etanol,
isopropanol y tolueno
PELIGROSIDAD

NOCIVO INFLAMABLE

RIESGOS
PELIGROS PARA LA SALUD
Puede ser nocivo si es absorbido por la
piel. Irrita los ojos y las vías
respiratorias. Provoca dolor de cabeza.
Puede irritar la piel. El producto puede
ser absorbido a través de la piel.
PELIGROS QUIMICOS
Extremadamente inflamable. Al usarlo
pueden formarse mezclas aire-vapor
explosivas/inflamables.
PRECAUCIONES
 Manéjese con cuidado.
 Llevar equipo de protección individual.
 Úsese únicamente en lugares bien
ventilados.
 Manténgase el recipiente bien cerrado
USOS
 La aplicación más importante de la
acetona se encuentra en la fabricación de
Metil metacrilato

3.3 RESULTADOS 6

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- Tabla Nº6: Cromatografía de capa fina.

Componente amarillo Caroteno

Componente verde Clorofila

Tabla Nº7:Cromatografía de capa fina.

Solventes Rf
Acetona 0.82
n-hexano 0.59
Mezcla n-hexano 0.09
Acetona

4. DIAGRAMAS DE FLUJO: 7

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4.1. CROMATOGRAFIA EN PLACAS

Op: Preparación
de papilla Op.: preparación
T: 25°C de placas

Op.: Activación de
Op.: Aplicación de la muestra placas
T=105°C, t=70min

Op.: Determinación
Op.: Desarrollo de la del Rf.
cromatografía
T= 25°C

8
4.1. CROMATOGRAFIA EN COLUMNAS

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Op: Armado de
equipo para llenado
de columna Op: Relleno de la columna

Op: Cromatografía de
columna
T=25°C

5. OBSERVACIONES: 9

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Cromatografía de columna:
- Al echar el n-hexano a la columna cromatografía teníamos que procurar
que no queden burbujas en la parte inferior, también nos aseguramos que
el orificio inferior de esta columna este bien tapado con la pinza de
Hoffman
- Al echar rápido la alúmina a la columna se noto que quedaba atascada en
la parte superior del solvente (n-hexano) para que no suceda esto tuvimos
que darle golpecitos en la columna con los dedos para que bajara por
completo.
- El solvente siempre estuvo por encima de la arena si llegaba al mismo nivel
se tenía que agregar más de este.
- El equipo de vacio era deficiente puesto que no ayudaba a que la
separación de los componentes sea rápida.
- Cada cierto tiempo se tenía que cambiar el tubo de ensayo hasta obtener
el producto deseado.
- Para que el proceso de extracción fuera más rápido se agrego acetona
esto hizo la primera fracción de componente del pigmento empezara a
desplazarse más rápido pudiéndose obtener un producto de color amarillo
que sería el caroteno y otro de color verde que sería la clorofila.

Cromatografía de capa fina

- Al poner el portaobjeto se tuvo que tener cuidado de que el punto de

aplicación de la muestra no quede inmerso en el solvente.
- En el primer vaso se observó que la acetona arrastro con mayor rapidez y
facilidad a la muestra, la muestra recorrió mayor distancia y se notó una
mancha de color amarillo, y verde en la parte superior
- En el Vaso 2, se observó que el n- hexano ascendió con mayor dificultad,
arrastro una pequeña distancia a la muestra que se aplicó, el color cambio a
un verde amarillento.
- En el vaso 3, donde se tuvo como solvente móvil a la mezcla de n-hexano y
acetona, arrastro también con rapidez (menos que el primer caso de la
acetona), a la muestra aplicada. En la placa se observa los pigmentos en
forman de una banda coloreada.
*Los colores que se observaron fueron verde de diferentes tonalidades (
verde azulado, verde claro y oscuro) , amarillo oscuro y amarillo claro.
Estos colores corresponden a los siguientes pigmentos:

o Clorofila A: Verde azulado

o Clorofila B: Verde amarillento
o Carotenos: Naranja
o Xantofilas: Amarillo

10
6. DISCUSIONES DE RESULTADOS:

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Cromatografía en columna

- ¿Por qué se demoró tanto en obtener los componentes del pigmento?

Esto pudo ser debido a la absorción de humedad ya sea por n-hexano o por la
columna de alúmina que habría cuarteado la columna y ofrecido resistencia al
paso del solvente o tal vez porque el corcho utilizado para tapar el kitasato
estaba en malas condiciones y no era el adecuado dejando escapar vacio.

Cromatografía en placas:

- ¿De acuerdo a las observaciones cual es el disolvente más polar y el

menos polar?
El más polar es la acetona pues se observó que este arrastro más rápidamente
a la muestra.
Y el menos polar es el n-hexano, pues la muestra alcanzó menor distancia.

- ¿A qué se debe las diferentes tonalidades en la banda que se formó en

la placa colocada en el eluyente (mezcla)?

Esto se debe a la solubilidad de los pigmentos en la disolución de hexano-

acetona, al ser una mezcla no polar. Los pigmentos con mayor afinidad llegan
más lejos que los polares en nuestro caso.
Los de mayor afinidad con el disolvente utilizado fueron los carotenos de color
amarillo fuerte que encontramos en una pequeña cantidad, alejadas del punto
de siembra debido a la polaridad.

Y de menor afinidad fueron las xantofilas de color amarillo claro, por tal razón
las encontramos mascercanas del punto de siembra.

- ¿De qué depende la intensidad de la mancha?

De la concentración de las clorofilas y la polaridad lo cual se ve reflejado en el

momento en que comienzan a subir los compuestos a través de la alúmina o
silica gel.

- ¿Como se pudo identificar las sustancias separadas en la cromatografía

de placa y de columna?

En placa: El eluyente arrastra los componentes a lo largo de la placa con silicagel

produciendo manchas que representan a los componentes, la separación se da en la
fase móvil arrastra a las substancias apolares y aquellas más polares son retenidas
por la fase estacionaria dando lugar a la separación.

En columna: por la invasión del compuesto en el eluyente el cual ocasionará que el

resultado sea líquido depositado en un vaso de precipitado, en nuestra experiencia el
color al inicio fue poco intenso pero luego fue de mayor intensidad. 11

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7. CONCLUSIONES:

- La cromatografía de capa fina nos indica que existe una diferencia de

movilidad entre el caroteno y la clorofila, con una mezcla de n-hexano y
acetona, los componentes se separan en bandas, o zonas discretas que
pueden ser analizados cuantitativamente midiendo la altura de
desplazamiento y nos indica el grado de avance de un soluto respecto del
solvente.

- La técnica de cromatografía de capa fina nos permite determinar que el n-

hexano es un disolvente que favorece al desplazamiento del caroteno siendo
este polar, mientras que la acetona ayuda al avance de la clorofila que es
apolar.

- Los colores de identificación de los pigmentos son: caroteno: amarilo-

anaranjado, Clorofila A: Verde azulado, Clorofila B: Verde amarillento,
Xantofilas: Amarillo.

- Las propiedades de solubilidad y de adsorción del caroteno y la clorofila son

las que permiten la diferente distribución entre las 2 fases, En la
cromatografía de columna el caroteno es el el componente débilmente
retenido y por tanto se mueve rápidamente , la clorofila por consiguiente
debido a sus propiedades es retenido fuertemente y es separado
lentamente al final.

- La alúmina es un buen absorbente en la cromatografía en columna asi como

la sílice de gel en la cromatografía en placas.

8. APENDICE:

8.1 Calculos

8.1.1. cromatografía de placas

El Rf lo determinamos según la siguiente ecuación:

𝑋
𝑅𝑓 =
𝑌
Donde: X: distancia recorrida por un compuesto
Y : distancia recorrida por el solvente

Caso I: solvente (acetona)

4,5
𝑅𝑓 = Rf= 0.82
5.5

12

Caso II: solvente (n- hexano)

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3.2
𝑅𝑓 = Rf= 0.59
5.4

Caso III: solvente (mezcla)

0.5
𝑅𝑓 = Rf= 0.09
5.4

8.2 Aplicación Industrial de la Cromatografía

La técnica más usada es la cromatografía líquida de alta resolución,

HPLC por su sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones
cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no
volátiles o termolábiles y su aplicación a sustancias de
primordial interés en la industria, como son:

1. Los aminoácidos,
2. Las proteínas,
3. Ácidos nucleicos,
4. Hidrocarburos,
5. Carbohidratos,

EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS

1. Detección y cuantificación de sacarina, benzoato, cafeína y aspartame en

refrescos.
2. Detección de ciclomato en jugos de fruta.
3. Separación de triglicéridos por la longitud de la cadena y el grado de
instauración por la fase inversa y detector de dispersión luminosa, para el
estudio de aceites y grasas insaturadas.
4. Determinación del contenido de vitamina A y sus precursores
(betacaroteno) en margarina y aceite de hígado por fase inversa.
5. Determinación de vitamina D en leche en polvo y cereales por fase normal.

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EN LA INDUSTRIA FARMACEUTICA

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1. Separaciones de componentes de plantas medicinales.

2. Separación de componentes de una síntesisorgánica.
3. Separación de colorantes.
4. Separación e identificación de hioscina y de morfina.
5. Separación de acidoacético,alcohol cetilico y metil-etil cetona.
6. Separación e identificación de los compuestos intermedios de una
síntesisorgánica, por ejemplo en la síntesis del naftaleno, identificación de
acidoftalico, anhídridoftalico, benceno.
7. En la producciónsintética de acetaminofen, identificación de la amina de la
N-acetilbenzoquinona.
8. Identificación de levo-alfa-acidoaminoadipico, durante la biosíntesis de
penicilina.
9. Identificación de 8-nitroisoquinolina, durante la síntesis de Ciprofloxacina,
un antibiótico.

6. BIBLIOGRAFIA

- Manual del Ingeniero Quimico. Autor: Perry. (3ª edición) Editorial Mc Graw
Hill. Tomo II
- http://organica1.org/1345/1345pdf8.pdf.Consultado el 26 de setiembre
- http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina
- http://es.scribd.com/doc/14172689/5-Cromatografia-en-Capa-Fina.
Consultado el 26 de setiembre
- www.ugr.es/~quiored/lab/oper_bas/crom.Consultado el 26 de setiembre
- ocw.uc3m.es/...e.../Apuntes_Tecnicas_de_separacion_cromatografica…
Consultado el 29 de setiembre

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