Test de

Anticuerpos IgM
antiglobulina
Anticuerpos que tienen
la capacidad de realizar
una aglutinación directa
de los hematíes, esto por sus características
de valencia, lo que le da la posibilidad de
interaccionar con varios eritrocitos a la vez
pudiendo generar un aglutinado visible que
se da, ya sea mediante una centrifugación o
también en aglutinación en lámina
Hasta el año 1945 no existía una forma a
través del laboratorio, en que se pudiera
evidenciar la presencia de anticuerpos de
tipo IgG, esto dificultaba la posibilidad de
estudiar incompatibilidad, la EHRN, se
desconocía una gran cantidad de GS que
desarrollan Ac de tipo IgG, la
inmunohematología estaba muy limitada
producto de la imposibilidad de revelar estos
anticuerpos.
El año 1945, Robert Coombs describe un
test que permite detectar los anticuerpos de
tipo IgG.

Anticuerpos IgG
Se denominan también incompletos o
sensibilizantes, esto debido a que tienen la
posibilidad de unirse a los antígenos
eritrocitarios, fijarse a ellos, pero no son
capaces de aglutinar directamente. Entonces
recubren los hematíes, sensibilizándolos,
pero no son capaces de aglutinarlos como
son capaces los Ac de tipo IgM.

Método convencional para producción de

antiglobulina humana policlonal, para ello se
puede utilizar fracciones de complemento o IgG e
inyectarlas a un conejo, posteriormente ese conejo
producirá anticuerpos policlonales anti-IgG o anti-
fracciones del complemento y eventualmente
reactivos monoespecíficos para IgG o complemento
o bien, lo que se encuentra más comúnmente a
disposición en el comercio, reactivos
poliespecíficos policlonales de antiglobulina
humana.
Esto ha cambiado con el tiempo con el fin
de desarrollar mejores técnicas de
producción de anticuerpos.
Hoy en día lo que se emplea es la producción de
antiglobulina humana monoclonal, utilizando la
tecnología del hibridoma. Se hace lo mismo, pero
esta vez se inyecta complemento e IgG, se espera la
producción de estos anticuerpos monoclonales y
posteriormente van a ser fusionados en una célula
tumoral con la cual se tendrá la producción de un
solo clon de anticuerpos.
Acá está representado donde se inmuniza a un ratón,
luego sus células B se fusionan con células de
mieloma formando un hibridoma y posteriormente
se hace una selección y a continuación el hibridoma
son separadas para la producción de los clones de
Ac monoclonales. Lo que ha favorecido el
desarrollo de reactivos mucho más específicos de
manera más fácil.
Tipos de reactivo
Existen distintos tipos de reactivos
antiglobulina humana.
 Anti-globulina humana poliespecíficos:
mezcla de anticuerpos anti-IgG y anti-
C3b, anti-C3d (fracciones de
complemento).
 Reactivos monoespecíficos: Anti-IgG
sola o anti-C3b, anti-C3d sola.
Test de Coombs directo
Como su nombre lo indica, es un test que se
realiza directamente. No requiere incubación
previa y lo que busca es detectar la
sensibilización de GR in vivo (mientras
están circulando en la sangre del paciente).
Lo que se hace en este test es tomar GR del
paciente, generalmente con anticoagulante
EDTA, se lavan los eritrocitos y se
suspenden al 5%, se toma una gota y se
enfrenta al reactivo antiglobulina humana.
Esta antiglobulina humana va a reconocer
los Ac IgG o también fracciones de
complemento que estén unidas in vivo al
eritrocito y lo van a aglutinar.

El test de antiglobulina directa (DAT)
detecta células rojas sensibilizadas in vivo
con IgG y/o con componentes del
complemento C3b y C3d.
El recubrimiento in vivo de glóbulos rojos
con IgG y/o complemento puede ocurrir en
cualquier mecanismo inmune que esté
atacando a los propios eritrocitos del
paciente. Por lo tanto, van a haber diversas
patologías que cursen con un DAT +.
Estos mecanismos pueden ser:
 Autoinmunes: LES, artritis reumatoide,
por ejemplo.
 Aloinmunes: por ejemplo, reacción
hemolítica por transfusiones.
 Mecanismo inducido por drogas.
Hemólisis aloinmune
 Reacción hemolítica transfusional
 Enfermedad hemolítica del recién
nacido:
o Rhesus D EHRN
o ABO EHRN (el test de Coombs
puede ser solo débilmente positivo).
o Anti-Kell EHRN
o Rhesus c EHRN
o Incompatibilidad por otros grupos
sanguíneos (RhC, Rhe, Kidd, Duffy,
MN, P y otros).
Hemólisis autoinmune
 Anemia hemolítica autoinmune por
anticuerpos calientes:
o Idiopática
o Secundaria a lupus eritematoso
sistémico
o Síndrome de Evans (Anticuerpos
antiplaquetarios y hemolíticos).
 Anemia hemolítica autoinmune por
anticuerpos fríos:
o Idiopática, síndrome de aglutininas
frías
o Mononucleosis infecciosa
o Hemoglobinuria paroxística por frío
Test de Coombs indirecto
Este test nos permite realizar una serie de
determinaciones muy importantes en el
ámbito de la inmunohematología. Estas son,
por ejemplo, detectar anticuerpos IgG en el
suero o plasma de un paciente antes de
efectuar una transfusión. Por otro lado, nos
permite, empleando anticuerpos conocidos
IgG, fenotipar antígenos en los GR, es decir,
detectar un antígeno que nos interese
demostrar que está presente empleando un
Ac de tipo IgG.
A este se le denomina indirecto, ya que se le
incluye un paso adicional de incubación. Se
debe dejar que los anticuerpos que se están
buscando en el suero problema reaccionen a
una temperatura adecuada en un medio
adecuado, que favorezca la reacción Ag-Ac
y luego de ese tiempo de incubación se
prueban con el reactivo de antiglobulina
humana para ver si están presentes o no en
la muestra en estudio.

Por ejemplo, si quisiéramos detectar en el
suero de un paciente un anticuerpo dirigido
contra algún antígeno de los eritrocitos, lo
primero que tenemos que hacer es incubar el
suero con GR que porten el antígeno (se
usan GR comerciales que expresan serie de
Ag conocidos), luego de la incubación de
realizan lavados para remover anticuerpos
que no se unieron (rojos y amarillos) y luego
se adiciona el reactivo antiglobulina humana
que reconocerá las IgG unidas a eritrocitos
que no son capaces de aglutinar
(sensibilizantes).
Indicaciones
El test de antiglobulina humana indirecto
(IAT) se realiza para determinar la presencia
de sensibilización de GR con IgG y/o
complemento in vitro en las siguientes
condiciones
 Test de compatibilidad (al efectuar una
transfusión).
 Screening y detección de Ac inesperados
en suero
 Determinación del fenotipo de los GR K,
Lea, Fya Fyb, Jka, Jkb, y subgrupo de Rh
usando un suero conocido.
IAT: tubo con muestra de suero o plasma con Ac, 2
gotas son incubadas con GR screening a t° que
favorezca la reacción (37°C). Si hay Ac dirigidos
contra algún Ag presente en las células screening en
el plasma o suero del individuo esos Ac se unan
durante la incubación, esto será revelado mediante
el reactivo de antiglobulina humana. Es necesario
lavar los Ac no unido (3 veces). Por último, se
agrega el reactivo, se centrifuga y se lee.
Fuentes de error en los test de AGH
Resultados falsos negativos: DAT general
e IAT
1. No lavar adecuadamente los GR, ya que
las globulinas no unidas a los GR
neutralizarán el reactivo AGH.
2. El proceso de lavado y la adición de
reactivo AGH deben realizarse lo más
rápido posible para minimizar la
pérdida de anticuerpos unidos por
elución (la reacción Ag-Ac es
reversible, pueden despegarse).
3. El almacenamiento inadecuado, la
contaminación bacteriana y la
contaminación con suero humano
afectarán la actividad del reactivo AGH.
 4. No agregar el reactivo AGH.
5. Centrifugación inadecuada.
6. Número de células presentes en la
prueba:
 Demasiadas células dan reacciones
débiles.
 Muy pocas células afectarán la
lectura de la aglutinación.
Razón antígeno-anticuerpo
La proporción óptima es 80 partes de
anticuerpo por 1 parte de antígeno. Hay
términos específicos para variaciones en esta
relación.
Prozona: exceso de anticuerpos, Ac que
saturan todos los sitios de antígeno, no hay
anticuerpos que formen enlaces cruzados
entre células, sin aglutinación.
Zona de equivalencia: Ac y Ag presentes
en proporción óptima, aglutinación formada.
Zona de exceso de antígeno: postzona,
demasiados antígenos, cualquier
aglutinación está oculta por masas de
antígenos no aglutinados.
Resultados falsos negativos
DAT
Todas las muestras negativas en la fase
AGH deben incubarse a temperatura
ambiente durante 5 minutos para lograr la
máxima sensibilidad necesaria para la
detección del complemento (tiempo de
incubación y leer).
IAT
 El suero y/o GR pierden reactividad si se
almacenan incorrectamente.
 El plasma utilizado en lugar del suero
puede conducir a la falla en la detección
de anticuerpos dependiendo de la
presencia de complemento activo (anti-
Jka, anti-Jkb). Existen anticuerpos que son
capaces de fijar complemento, en ese
caso se prefiere el uso de suero.
 La temperatura y el tiempo de incubación
afectan la unión el anticuerpo o
complemento a las células.
 Se debe lograr una proporción óptima de
suero a las células: generalmente 2-3
gotas de suero a una gota de suspensión
celular al 5% (en tubo).
Resultados falso positivo
DAT e IAT
 En muestras que contienen potentes Ac
reactivos al frío, puede ocurrir
aglutinación antes de agregar el reactivo
AGH.
 Tubos sucios pueden causar
aglomeración de células.
 Sobre centrifugación.
DAT
 Una DAR positiva de una muestra
coagulada debe repetirse en una muestra
de EDTA.
 Las muestras recogidas de las líneas de
infusión pueden tener complemento
presente en las células.
IAT
Las células con un DAT positivo darán un
resultado positivo en cualquier
procedimiento de antiglobulina indirecta.
Células Coombs o células control Coombs
Para mostrar que las células de prueba se
lavaron adecuadamente y que no se ha
producido neutralización o deterioro de los
reactivos. Las células recubiertas con
anticuerpos se usan como un indicador
positivo. Las células control Coombs se
deben utilizar entonces en pruebas que
resulten ser negativas.
En una prueba de antiglobulina negativa, la
globulina antihumana debe permanecer
activa y esto se puede demostrar mediante la
adición de células sensibilizadas con IgG.
La aglutinación de las células sensibilizadas
con IgG después de mezclar y centrifugar
confirma que se añadió la globulina
antihumana a la prueba, que las células de
prueba se lavaron adecuadamente y se
eliminaron todas las moléculas de globulina
libre y que la globulina antihumana estaba
activa.
La falta de aglutinación de las células
sensibilizadas con IgG indica que el
resultado negativo original de la prueba de
antiglobulina no es válido y la prueba debe
repetirse.

Se tiene GR que no presentan AC IgG unidos a su

superficie, al adicionar a la prueba GR con Ag
fijados (células control Coombs) reaccionarán si el
reactivo AGH está en buenas condiciones y arrojará
un resultado positivo. Esto permite comprobar que
el resultado negativo es válido.