Estructura ADN parte II
Espectros de absorción de los nucleóti dos más
comunes y sus coefi cientes de absorción molar a
260 nm y pH 7,0 (ε260)
Las bases nitrogenadas tienen la capacidad de absorber
luz en el rango del ultravioleta, normalmente las
moléculas que son capaces de absorber luz en el rango
del UV son los anillos bencénicos y, los anillos de
benceno que son parte de las bases nitrogenadas son
los que les permiten absorber en el rango de la luz UV.
A una longitud de onda de 260 nm se puede observar
que cada base nitrogenada tiene una absorbancia
distinta. Con esta absorbancia se pueden determinar
distintas propiedades, entre ellas:
Determinando la absorbancia a 260 nm y variando la
temperatura se puede observar cómo se comporta una
doble o mono hebra.
Por ejemplo, si se hace un gráfico y se observa la
absorbancia a 260 nm a distintas temperaturas de una
molécula de doble hebra de ADN, se puede ver el
comportamiento de la hebra, primero se encuentra
como plato por lo que aumenta lentamente la
absorbancia, luego aumenta de forma logarítmica para
llegar a otro plato y continuar en forma lineal. La subida
logarítmica de la absorbancia al subir la temperatura se
debe a que se entrega energía cinética a las moléculas,
estas aumentan su movimiento y con ello se rompen los
enlaces de hidrogeno que estabilizan a la doble hebra,
por lo que al romperse los enlaces de hidrogeno la
doble hebra se abre y se exponen las bases
nitrogenadas, las cuales absorben más rápido en
comparación a cuando estaban escondidas dentro de la
doble hebra.
En una simple hebra de ADN (der.) el aumento de la
absorbancia es lineal (no hay un aumento logarítmico),
porque las bases nitrogenadas ya se encuentran
expuestas.
El punto de inflexión que se genera en la gráfica de la
absorbancia versus la temperatura para la doble hebra
de ADN corresponde a Tm, esto se refiere a la
temperatura media y corresponde a la temperatura a la
cual la mitad de la molécula se encuentra abierta y la
otra mitad hibridada. Este concepto es muy
importante, porque se utiliza en la técnica de PCR.
En el segundo grafico se puede observar que, si
aumenta la Tm o que, si se observan la Tm de diferentes
hebras de ADN, en la medida que aumenta Tm se puede
ver que aumenta el porcentaje de citosinas y guaninas o
viceversa, es decir, a medida que aumenta el porcentaje
de citosinas y guaninas, la Tm va aumentando. Esto se
debe a que estas BN tienen un triple enlace de
hidrogeno, por lo que se necesita de más energía
cinética (calor) para poder romper dichos enlaces, por
esto la Tm es mayor.
La absorción en el UV (260 nm) de los ácidos nucleicos
permite su cuantificación:
- ADN doble hebra: 1 OD260 = 50 μg/mL
- ADN mono hebra: 1 OD260 = 33 μg/mL
- ARN mono hebra: 1 OD260 = 40 μg/mL
Cuando la absorbancia corresponde a 1 (a 260 nm),
significa que hay 50 μg/mL de ácido nucleico en una
solución. Sabiendo la absorbancia y el coeficiente de
extinción se puede determinar la concentración en
molaridad. OD =Absorbancia.
La razón entre la OD260 / OD280 refleja el índice de pureza
del ADN o ARN. Una razón entre 1.8 y 2.0 indica una
preparación de ARN o ADN con alta pureza. Se utiliza la
absorbancia a 260 y 280 nm, esta última se utiliza
porque pueden absorber otras moléculas que también
tengan anillos bencénicos, entonces la base nitrogenada
que tiene estos anillos absorbe a 260 y a 280 absorben
otros anillos como los que tienen algunas proteínas.
Entonces, la razón entre la OD260 / OD280 permite
observar la pureza, esto significa que, si se tiene una
mayor absorbancia a 280, habrá mayor contenido de
proteínas en la solución de ácidos nucleicos, por lo
tanto, la razón será menor, lo que indica que la solución
está contaminada con proteínas, ya que lo que se busca
es tener una solución rica solamente de ADN o ARN.
Siempre que se purifica ADN o ARN se debe medir la
absorbancia a 260 y 280 nm para calcular la razón y esta
razón indica la pureza de la solución, si es muy baja
(menor a 1.8) entonces se debe volver a purificar,
porque indicaría que está contaminada con proteínas.
mezclada, la gris con la azul y la celeste con la negra.
Esto se produce, porque al bajar la temperatura
lentamente, las moléculas buscan su
complementariedad y en donde exista dicha
complementariedad van a hibridar buscando el mejor
match. Siempre el mejor match es con la hebra original
(la propia), pero también existen regiones que hibridan
entre sí y las regiones en donde no hay
complementariedad quedan abiertas.

Si la temperatura baja rápidamente la búsqueda de

complementariedad no ocurre con tanta precisión, se
encuentras las molec e hibridan como pueden, todas las
regiones donde hay complementación, hibridación,
incluso las molec propias entre sí podrían no
encontrarse porque baja tan rápido la T y no
hibridarían, por lo tanto la baja rápida de T forman
agregados, las molec se agregan.

Efecto de denaturación (por calor) y rápido

enfriamiento: agregación

Si ocurre un rápido
enfriamiento la
búsqueda de moléculas
complementarias no
La hibridación de ácidos nucleicos (ADN o ARN) es un ocurre con precisión,
proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos por lo que las
nucleicos antiparalelas y con secuencias de bases moléculas apenas se
complementarias en una única molécula de doble encuentran hibridan
cadena, que toma la estructura de doble hélice, donde como pueden y se
las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior. produce el proceso de
El ADN puede hibridar entre si moléculas agregación.
complementarias, entonces dos moléculas Técnica Southern Blot
complementarias tienen nucleótidos que pueden
complementarse entre sí, es decir, en donde hay una La técnica de Southern Blot permite reconocer regiones
citosina se puede complementar con una guanina y de ADN, esta se utiliza, por ejemplo, cuando se está
donde hay una timina se puede complementar con una generando un organismo transgénico y se quiere saber
adenina. si se introdujo el transgén a este genoma, también se
utiliza para visualizar si existe o no un gen determinado
En el esquema de arriba se tienen cuatro hebras de en el genoma.
ADN, la gris hibrida con la negra y la celeste con la azul,
porque estas son las hebras que se complementan Aplicaciones: detección de una secuencia particular de
entre sí y generan dos moléculas de doble hebra de ADN en una mezcla compleja.
ADN. Sin embargo, si se mezclan las soluciones de ADN
en un solo lugar y se sube rápidamente la temperatura,
las dos dobles hebras se van a separar (denaturar), si a
continuación se comienza a bajar lentamente la
temperatura ocurrirá que se hibridaran las moléculas
originales, es decir la negra con la gris y la azul con la
celeste, pero también se produce una hibridación
 es una molécula de ADN de una hebra que contiene una
hebra complementaria al gen que se quiere identificar,
la hebra complementaria busca donde está el gen que
se introdujo.

Cuarta imagen: la sonda puede ser marcada con un

isotopo radioactivo o puede ser una sonda marcada fría
que es a través de una molécula que se puede detectar
por medio de un anticuerpo, cualquiera sea la marca
esta se puede visualizar en una membrana. En la
membran se puede observar que en el genoma de la
frutilla el gen si está presente, y por lo tanto es
transgénico.

Northern Blot es una técnica similar que sirve para el

análisis de muestras de ARN.

Síntesis de sondas anti -senti do para hibridación

in situ en X. tropicalis

Síntesis de sondas ARN-digoxigenina

Primera imagen: para hacer un Southern Blot, se toma
el genoma, se purifica, por ejemplo el de una frutilla
que se le agrego un gen específico para que la frutilla
pueda crecer a temperaturas bajas, se toma el ADN de
la frutilla transgénica y se purifica el ADN genómico,
luego se corta este ADN con una enzima de restricción,
es decir, con una endonucleasa que corta regiones
internas del genoma, pero no que la degrade
completamente, sino que los sitios que corta se
encuentran poco representados y generan fragmentos
de ADN de distinto tamaño, este ADN digerido se corre
en un gel de agarosa (malla de agar) y se coloca un
potencial eléctrico negativo a positivo y como las
moléculas de ADN están cargadas negativamente
producto de los enlaces fosfatos, a través del potencial
eléctrico el ADN migra hacia el cátodo positivo y las Esta técnica consiste en lo mismo que la anterior, pero
moléculas que son más pequeñas pueden atravesar la se hace en el sitio, en un corte de tejido (cultivo celular
malla de agar más rápido que las moléculas más grande, o placa) o en un embrión (organismo completo).
generándose una especie de escalera de diferentes
Este ejemplo consiste en detectar la presencia de ARNm
tamaños de moléculas de ADN.
en el tejido, ya que, la búsqueda del ARNm da cuenta de
Segunda imagen: luego el ADN que está en la agarosa si el gen se está expresando o no.
se transfiere a una membrana de nitrocelulosa que
Hibridación in situ en embriones de Xenopus tropicalis
también tiene una carga y se genera una campo
eléctrico. Entonces, todas las moléculas de ADN que Se busca la presencia y en
están positivas migran hacia la membrana. que parte del embrión o
tejido se encuentra el
Tercera imagen: el fragmento de ADN que se introdujo
ARNm, esto se hace con
puede quedar en cualquier región de la membrana que
una sonda que es una
va a tener todo el ADN. Después la membrana se coloca
molécula de nucleótidos
en una bolsa o contendor para agregarle una sonda que
complementarios al
mensajero, como es mensajero no se necesita
denaturar nada porque el ARN es de una sola hebra. La
sonda que también es de ARN de una hebra se marca
con una marca fría (digoxigenina) que puede ser
visualizada por un anticuerpo que se une a la
digoxigenina, el anticuerpo a su vez esta conjugado a
La complementariedad permite formar estructuras en el
una enzima a la cual al agregarse su sustrato se rompe
ADN o en el ARN. Existen secuencias palindrómicas que
generando un compuesto coloreado azul (indica que el
muchas endonucleasas (enzimas de corte) reconocen.
mensajero está presente).
Una secuencia palindrómica es una secuencia que se
Por ejemplo, si se quiere puede leer de un lado a otro, de 5’ a 3’ y de la otra
identificar la presencia de la N- hebra de 3’ a 5’ de la misma forma.
tubulina (tubulina presente en
Por ejemplo, la secuencia TTAGCACGTGCTAA, es la
el tejido neural) se debe
misma en la hebra complementaria. Este tipo de
agregar una sonda marcada
secuencias que se leen de un lado al otro igual son
para N-tubulina y se podrá observar una marca en todo
bastantes repetitivas en el ADN, ya que normalmente
el cerebro del embrión y de la medula espinal.
son sitios que permiten ser reconocidos por
Por otro lado, si se quiere endonucleasas de restricción que cortan estos sitios.
detectar la placoda ótica y
riñón pronéfrico se utiliza el
marcador Pax 8, el cual marca
el riñón y donde estará el
oído.

Por último, EphA4 es un También, pueden haber mirror repeat que son
receptor que se encuentra en repeticiones de espejo. En una hebra con secuencia
un tejido especifico que TTAGCAC, desde el otro lado (secuencia azul, pero de
corresponde a las crestas derecha a izquierda) se tiene TTAGCAC.
neurales (tejido transitorio Se pueden generar
que se encuentra solamente presente en el embrión y estructuras producto de la
permite posteriormente la formación de una serie de complementariedad entre
otros tejidos como el esqueleto craneofacial, parte del sí. En una sola hebra se
corazón, etc.) y se puede visualizar en donde estaría pueden formar horquillas
presente el mensajero en color verde. debido a que la región
marcada en azul
complementa con la otra
región marcada en azul y
se forma un loop.

También se puede
producir una horquilla en
El ADN puede adoptar diferentes estructuras la doble hebra y se genera
una estructura cruciforme.
La presencia de secuencias auto complementarias
(llamada palíndromos) en una hebra polinucleotídica Esto puede ocurrir en
puede generar que esta forme puentes cualquier región del ADN o
intramoleculares entre las bases ARNt y ARNr adoptan del ARN.
frecuentemente este tipo de estructura. También en el
Estructura compleja del ARN
ADN, pero con menor frecuencia.
El ARNt tiene una estructura muy compleja y es por esto
por lo que es muy resistente porque existen regiones
complementarias entre si formándose uniones
intermoleculares.

Esta estructura corresponde a la estructura secundaria

del componente ARN M1 de la enzima ARNasa P
(procesamiento de los ARN de transferencia) de E. coli.
Esta ARNasa tiene el componente el cual es una
molécula de ARN con una estructura compleja como la
que muestra en la imagen, se forma una horquilla, luego
un loop, otra horquilla y otro loop hasta formar la
estructura, y es esto mismo lo que sucede con el ARNt,
el cual adopta una conformación tan estable debido a la
presencia de regiones que pueden hibridar entre sí.

Las regiones que hibridan son ricas en citocinas y

guaninas que generan uniones estables, lo que a su vez
produce regiones estables.