Enzimología II: influencia del pH, temperatura

e inhibidores sobre la actividad enzimática

 subsaturación saturación
4000

Vmax
3500

3000

v 2500
Actividad

2000
Vmax/2
1500

1000

500
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Km1
[S]

v=
[S] * Vmax
Km + [S]
Condiciones iniciales y linealidad
Influencia del pH sobre la actividad enzimática
Influencia del pH sobre la actividad enzimática
Curva de estabilidad según pH de incubación
Curva de estabilidad según pH de incubación
 AH A- + H+

pH = pKa + log [A-]/[AH]

Si el pH = pKa ⇒ AH = A-

Si el pH = pKa + 1 ⇒ AH = A-/10

Si el pH = pKa + 2 ⇒ AH = A-/100
0.94
Influencia de la T sobre la actividad enzimática

70
60 50
40

80

25
Activ.

app T
Topt
Curva de estabilidad según T de incubación
Inhibición de la actividad
enzimática
Inhibición competitiva

k+1 kp
E+S ES  E + P
k-1

k+2
E+I EI
k-2

k − 2 [E][I]
Ki = =
k +2 [EI]
S

X
I
 S

X
I

I
S
X
I
 COOH
FAD FADH
2
H2N H2N
Succinato
deshidrogenasa COOH

succinato fumarato PABA

HOOC H2NO 2S

malonato PABA Sulfanilamida

El oxalato es un inhibidor Las sulfanilamidas son antibióticos

competitivo de la succinato
deshidrogenasa, una enzima
del ciclo de los ácidos
tricarboxílicos
sintéticos. Son inhibidores
competitivos de la síntesis de
folato en bacterias (inhiben a la
dihidrofolato sintetasa), uno de
cuyos precursores es el ác. p-
aminobenzoico.
 DHF

metotrexato
GMP

AMP
 Sulfametoxazol

H2N

HOOC

PABA

Trimetoprima (más liposoluble)

Determinación de la ecuación de velocidad

Ks kp
E+S ES  E + P
+
I
Ki Ki =
[E][]
I k−2
=
EI [EI] k + 2
v = kp [ES]

[E]t está distribuido en 3 especies: [E], [ES] y [EI].

Por lo tanto
[E]t = [E] + [ES] + [EI]
dividiendo la ecuación anterior por [E]t

v k p [ES]
=
[E]t [E] + [ES] + [EI]
como

[S]
[ES] = [E] I
[EI] = [E]
Ks KI
Entonces, pasando kp al primer miembro y reemplazando
[ES] y [EI] queda:

[S] [E]
v Ks
=
k p [E]t [E] + [S] [E] + []
I
[E]
Ks Ki
Al simplificar [E] y reordenar, queda:

v=
[S] * Vmax
Ks 
 []
I 
1 +  + [S]
 K i 
 Vmax = 100
Km = 7
100

[I] = 0
80
[I] = 5, Ki = 5

60

[I] = 5, Ki = 2
40

20

0
0 10 20 30 40

[S]
 1/v
[I1]
1
=
1
+
Km []
I 1
(1 + )
v Vmax Vmax K I [S]

-1/Km 1/[S]

)
) [I1]
-1/Km 1 + K
i
Parcialmente competitiva

Ks kp
E+S ES  E + P
+ +
I I
Ki Ki´ kp
EI + S  EIS  E + P v
K´s

parcial

total

[I]
Inhibición no competitiva

k+1 kp
E ES  E+P
k-1
k-3 k+3 k-5 k+5
k+4
EI  ESI
k-4

k -1 k − 4 k -3 k −5
KS = = KI = =
k +1 k + 4 k +3 k +5
 v = kp [ES]

v k p [ES]
=
[E]t [E] + [ES] + [ESI] + [EI]
considerando que la concentración de los complejos es

[S]
[ES] = [E] I [S]
[ESI] = [EI] = [S][]
I
[E]
Ks
[EI] = [E] KS K IK S
KI
 [S] * [E]
v Ks
=
k p [E]t [E] + [S] [E] + []
I [S][]
[E] + [E]I
Ks Ki K SK i

[S]
v
= K s
=
[S]
Vmax 1 + [S] + [I] + [S][]
I []I []I
Ks(1 + ) + [S](1 + )
K s K i K SK i Ki Ki
 [S] * Vmax []
I
/(1 + )
v= Ki
Ks + [S]
 (1 +
[]I )
1
=
KI
+
Km []
I 1
(1 + )
v Vmax Vmax KI [S]

1/v
[I1]

)V
app )
1/Vmax = 1 +
[I1]
Ki max

-1/Km 1/[S]
Inhibición parcialmente no competitiva

Se da cuando ESI se descompone en EI + P, siendo la

velocidad

v = k [ES] + k´ [ESI]

k+1 kp
E ES  E+P
k-1

k-3 k+3 k-5 k+5

k+4 k´p
EI ESI  EI + P
k-4
Inhibición mixta

Ks kp
E+S ES  E+P
+I k-1 +I
Ki K´i
K´s
EI + S ESI

v = k [ES]
 Vmax
v=
KS []
I []
I
(1 + ) + (1 + ´ )
[S] Ki KI

Vmax
[]
I
(1 + )
K ´I
v=
[]
I
(1 + )
KS Ki
1+ *
[S] (1 + []I )
K ´I
 1/v
[I3] > [I2] > [I1]
[I3] Ki< Ki´
)V
app ) [I3]
1/Vmax = 1 + K´ [I2]
i max [I1]

1/[S]
1/v

Ki> Ki´

1/[S]
Inhibición acompetitiva

k+1 kp
E ES  E+P
k-1
Ki

ESI
([E]t - [ES] - [ESI])*[S] = Ks [ES]

[ES][I] = Ki [ESI]

v = k+2 [ES]

Vmax
(1 +
[]I )
KI
v=
Km 1
1+ *
[S] (1 + []I )
KI
 Vmax
v=
Km []
I
+ (1 + )
[S] KI

1
=
1 []
I
(1 + ) +
Km 1
v Vmax KI Vmax [S]
1/v [I3] > [I2] > [I1]
[I3]
[I2]

[I1]

1/[S]

1/v

1/[S]
Inhibición por sustrato

k+1 kp
E+S ES  E + P
k-1 +S
Ki

ESS

Vmax [S]
v=
K m + [S](1 +
[S])
KS
L-malato + NAD+  oxaloacetato + NADH + H+

Otras: invertasa (Glc), piruvato kinasa (ADP)

 35

30

25

20
v

15

10

0
0 10 20 30 40

[S]
 60

50

Ks = 25
40

Ks = 15
v

30

20 Ks = 7
10

0
0 10 20 30 40

[S]
Gráficos de Dixon

[I]1

[I]2

[I]3

[I]4
 1/v
S1

No Competitivo S2 > S1

S2

-Ki [I]

S2 > S1 > S0
1/v
Acompetitivo S0
S1
S2
Soo

-Ki [I]
 pendiente

1/[S]
1/v S1
-Ki Competitivo

S2

S2 > S1
Soo

-Ki [I]
 1/v S1 1/v S1
S2 Mixto
Mixto
S2

S2 > S1
S2 > S1

-Ki
[I] -Ki [I]

pendiente

1/[S]
 1/v S2 1/v S2
S1
Mixto
Mixto
S1

S2 > S1
S2 > S1

-Ki
[I] -Ki [I]
 1/v S2
Acompetitivo

S1

S2 > S1

-Ki [I]
 [S]/v
S1

No Competitivo S2 > S1

S2

-Ki [I]

S2 > S1
[S]/v
Competitivo
S2

S1

-Ki [I]
Activadores

4000

Vmax
3500

3000

v 2500
Actividad

2000

1500

1000

500
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

[A]
 4000

3500

3000

100
% activación

2500
Actividad

2000

1500

1000

500
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

A0.5
[A]