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Bioquímica / Grado en Química

Cuestionario de Resultados
P2. Actividad enzimática fosfatasa alcalina

Escribe solo en los espacios reservados para tu respuesta

Apellidos Nombre Grupo

Peiró Monzó Santiago AL2
: : :
Compañero/a en esta práctica: Miguel Muñoz Bartual
Profesor/a: Antonio

1. Describe las condiciones del ensayo de actividad enzimática, detallando las concentraciones de los componentes de
la mezcla de reacción:
Por una parte, en el primer ensayo (sin inhibidor), se va aumentando la cantidad de volumen de disolución de sustrato que se
añade en cada serie, de forma que al mantener constante el volumen que se añade de tampón, se va aumentando la
concentración de sustrato en cada serie.

Al aumentar la concentración de sustrato (la concentración de enzima y de tampón es la misma en las 5 series) se puede
observar como aumenta la v0, pendiente de la recta en la representación hecha para obtener los datos del ejercicio número 2.

Por otra parte, en el segundo ensayo (con inhibidor), la concentración de sustrato se aumenta de la misma forma que en el
ensayo anterior. También, en este ensayo, la concentración de enzima y tampón se mantiene constantes, al igual que la
concentración de inhibidor entre series.

2. Cinéticas de la reacción catalizada por la fosfatasa en ausencia (Tabla 1) o en presencia (Tabla 2) de fosfato
inorgánico.
a. Completa las tablas siguientes teniendo en cuenta el valor del coeficiente de extinción molar del producto de la
reacción.

Tabla 1: Actividad fosfatasa alcalina en ausencia de fosfato

Cubeta ΔA400/s v0 (M s-1) v0-1 (M-1 s) [S] (M) [S]-1 (M-1)

1 0,000865 5,08824*10-8 19,65318*106 4,6667*10-5 21428,5714

2 0,000940 5,52941*10-8 18,08511*106 7,3333*10-5 13636,3636

3 0,001060 6,23530*10-8 16,03774*106 0,0001 10000

4 0,001120 6,58820*10-8 15,17857*106 0,0002 5000

5 0,001260 7,41180*10-8 13,49206*106 0,0004 2500

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Tabla 2: Actividad fosfatasa alcalina en presencia de fosfato

Cubeta ΔA400/s v0 (M s-1) v0-1 (M-1 s) [S] (M) [S]-1 (M-1)

1 0,000285 1,67647*10-8 59,64912*106 4,6667*10-5 21428,5714

2 0,000385 2,26471*10-8 44,15584*106 7,3333*10-5 13636,3636

3 0,000540 3,17647*10-8 31,48148*106 0,0001 10000

4 0,000655 3,86294*10-8 25,95420*106 0,0002 5000

5 0,000840 4,94118*10-8 20,23810*106 0,0004 2500

Los datos para confeccionar la “Tabla 2: Actividad fosfatasa alcalina en presencia de fosfato” han sido proporcionados por la
pareja de Fran López y Neil Peña.

b. Utilizando los valores de las tablas, lleva a cabo representaciones directas (v 0 frente a [S]) y de Lineweaver-
Burk (dobles inversos, 1/v0 frente a 1/[S]). En cada gráfica debes representar los dos casos analizados (ausencia
y presencia de fosfato).
NOTA: Crea tus representaciones gráficas en una hoja de cálculo Excel. Edita tu representación de manera que los ejes
aparezcan claramente y correctamente nombrados. En el caso de la representación de Lineweaver-Burk debes incluir la recta
teórica a través de una regresión lineal. Finalmente exporta tu gráfica como fichero de imagen e insértala en el cuadro
correspondiente: Sobre la imagen del cuadro, y con el botón derecho del ratón, selecciona Change Picture…… inserta
tu fichero de imagen).
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Reperesentación de Lineweaver-Burk
7.00E+07
6.00E+07
f(x) = 2089.72982701562 x + 14326445.8990774
5.00E+07 R² = 0.981973368026965
1/v0 (M-1 ∙S)

4.00E+07
3.00E+07
2.00E+07
f(x) = 317.265552886033 x + 13153922.6315253
1.00E+07 R² = 0.960020502240028
Con
0.00E+00
in-
hibi...0 5000 10000 15000 20000 25000
1/[S] (M-1)

3. Parámetros cinéticos y tipo de inhibición:

a. A partir de las representaciones de Lineweaver-Burk, determina los valores de KM y Vmáx tanto en ausencia
como en presencia de inhibidor.
NOTA: Debes explicar brevemente en tu respuesta cómo obtienes los valores de KM y Vmax a partir de la representación gráfica.
Si a partir de valores extraídos de la gráfica necesitas llevar a cabo algún cálculo para obtener el resultado final, escribe dichos
cálculos utilizando el editor de ecuaciones (Insert  Equation, o escribe directamente en el espacio de edición de
ecuaciones, al lado de “Cálculos”).

Explicación: A partir de la representación de Lineweaver-Burk tanto en presencia de inhibidor como en ausencia de este,
podemos obtener la Vmax y la KM mediante la forma de la ecuación de la recta y los valores de la pendiente y la ordenada en el
origen obtenidos mediante Excel. La Vmax se obtiene a partir de la inversa de la ordenada en el origen y la KM es la pendiente
multiplicada por la Vmax

Datos: Ecuación de la recta sin inhibidor: y = 317,27x + 13.153.922,63

Ecuación de la recta con inhibidor: y = 2.089,73x + 14.326.445,90

Cálculos:

1 1
=13153922,63 →V max= =7,60229∙ 10−8
V max 13153922,63

KM −8 −5
=317,27 → K M =317,27∙ 7,60229 ∙10 =2,41195 ∙10
V max

1 ap 1
=14.326 .445,90 →V max = =6,9801∙ 10−8
V
ap
max
14.326 .445,90
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ap
KM ap −8
ap
=2089,73 → K M =2089,73 ∙6,9801 ∙10 =0,0001 5
V max

b. Teniendo en cuenta los resultados, razona y discute el tipo de inhibición ejercida por el fosfato sobre la
actividad de la enzima.
Se trata de inhibición competitiva ya que los valores de V max en presencia de fosfato (inhibidor) y en ausencia de este son
similares (Vmax (ap) ~ Vmax) y el valor de KM en presencia de inhibidor es mayor que el valor en ausencia de inhibidor (K M
(ap)> KM).

c. Determina el valor de la constante de disociación del complejo Enzima-Inhibidor (Ki)

NOTA: Explicar brevemente en tu respuesta cómo obtienes los valores de Ki (qué valores tomas de partida y qué cálculos
llevas a cabo con ellos). Escribe tus cálculos utilizando el editor de ecuaciones (Insert  Equation, o escribe
directamente en el espacio de edición de ecuaciones, al lado de “Cálculos”).

Explicación: Conociendo los valores de KM y KMap, podemos calcular el valor de la constante de disociación del complejo
Enzima-Inhibidor (Ki). Utilizamos la siguiente fórmula:

Datos:

KMap: 0,00015

KM: 2,41195∙10-5

[I]: 0,0001 M

Cálculos:

( )
ap ap
[I ] KM [I ] [ I ] K [I ] 0,0001
K ap
M =K M 1+ → =1+ → = M −1 → K i= ap → K i= =1,98114 ∙ 10−5
Ki KM K i Ki KM KM 0,00015
−1 −1
KM 2,41195∙ 10−5