00 Manual Practicas Lab Micro 07 Pag71

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA “Comprometida
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA con el

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS ACUÍCOLAS desarrollo
“VIGILADA
Programa de Acuicultura Regional”
MINIEDUCACIÓN”
MICROBIOLOGÍA
ACUÁTICA
Manual de laboratorio
Programa de Acuicultura
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD

avallejo@correo.unicodoba.edu.co
“VIGILADA
MINIEDUCACIÓN”
7 RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS

MICROSCÓPICOS
7.1 INTRODUCCIÓN
Los hongos constituyen un reino de la naturaleza el cual comparte características con el
resto de los reinos Monera, Protista, Plantae y Animalia. Presentan similitud con el reino
Monera al poseer pared celular a base de peptidoglucano, entre otros y el hecho de que
alguna especies son unicelulares; sin embargo, en los hongos la condición de ser
organismos eucarioticos, los acercan más al reino de las plantas por su forma de
reproducirse y a los animales por su particular metabolismo que almacena glicógeno, un
elemento característico que se encuentra en cantidades importantes en el hígado de los
animales, y por contener quitina en sus tejidos, un polímero lineal que se encuentra en el
caparazón de los insectos.
Los hongos se categorizan en hongos inferiores y hongos superiores. Los inferiores son
los que no se pueden ver a simple vista, teniendo que utilizar un microscopio para su
observación, de aquí que se llamen también hongos microscópicos. Los superiores o
macroscópicos, son las populares setas que se recolectan en bosques, y que en realidad se
trata de la parte fructífera del hongo.
Para la acuicultura, los hongos constituyen organismos de una importancia significativa,
porque además de ser descomponedores de la materia orgánica y ser cosmopolita,
interactúan en los ecosistemas acuáticos como parásitos, comensales y simbiontes de otras
especies. Además, constituyen parte del biofloc, ricos en componentes nutricionales, que
contribuyen al crecimiento de las especies en cautiverio. Eventualmente pueden resultar
una amenaza para los alimentos almacenados, como es el caso del concentrado que se
emplea para peces, que pueden secretar micotoxinas causantes de alteraciones hepáticas
y consecuentemente producir altas mortalidades en las poblaciones cultivadas. Con todo
esto, los hongos son considerados indicadores de la calidad del agua y de los alimentos.
De ahí la importancia que el estudiante de Acuicultura se familiarice con este grupo de
organismos, para poder entender los procesos de descomposición y alteración de la calidad
del agua, la potencialidad que tienen como nutrientes y su importancia en la sanidad
animal.
7.2 OBJETIVOS
7.2.1 Objetivo educativo.
Al finalizar esta práctica, el estudiante estará familiarizado con los conceptos básicos
sobre los hongos microscópicos acuáticos y terrestres y adquirir las habilidades necesarias
para el aislamiento, reconocimiento e identificación
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7.2.2 Objetivos instructivos.

- Aislar mohos y levaduras de ambientes acuáticos y terrestres relacionados con la
acuicultura
- Identificar las estructuras morfológicas de las cepas aisladas y sus características
macroscópicas en cultivo artificial.
- Determinar hasta el nivel taxonómico máximo posible los diferentes grupos de
hongos aislados.
7.3 MARCO TEÓRICO

Los hongos pertenecen al dominio Eucarya o Eucariota, Reino Fungi. Su importancia se
deduce fácilmente de la amplitud y diversidad de este tipo de seres vivos que cuentan con
aproximadamente 100.000 especies, entre las cuales hay tanto benéficas como
perjudiciales para el entorno humano en el área de la salud y la producción.
Presentan diferentes formas desde microorganismos unicelulares de forma redonda u
ovalada como las levaduras hasta pluricelulares como los hongos filamentosos o mohos
que pueden formar largas cadenas de células. Su tamaño y complejidad son superiores al
de las bacterias. Habitan en ambientes húmedos y oscuros, sobre el suelo, las frutas el pan,
el queso, las plantas, el cuerpo del hombre y de los animales, en el agua dulce y salada.
Se desarrollan mejor en ambientes ligeramente ácidos (pH 5, siendo 7 neutral).
La mayoría de los hongos son aeróbicos, aunque hay algunas especies facultativas. Su
nutrición es heterótrofa, carecen de clorofila y adquieren su energía de compuestos
orgánicos del suelo y del agua. Se considera que los hongos saprófitos juegan un papel
importante en la degradación de la materia orgánica muerta, y en el aumento de la
fertilidad del suelo.
El reino Fungi (Hongos) incluye cuatro phyla: Chytridiomycota, Zygomycota,
Ascomycota, Basidiomycota y Deuteromycota o Fungi Imperfecti (Hongos Imperfectos);
a este grupo se les coloca principalmente dentro del phylum Ascomycota, que agrupa a
todos los hongos que no tienen ciclo sexual conocido.
7.3.1 Hongos Pluricelulares o Mohos

Los hongos presentan pared celular compuesta de varias capas constituidas de estructuras
amorfas como los mananos (polímeros ramificados de la manosa, los glucanos (polímeros
de la glucosa) y por quitina que es un polisacárido estructural que también se encuentra
en el exoesqueleto de los artrópodos. La pared celular da la rigidez al hongo y le permite
la nutrición absortiva
Los hongos pluricelulares o mohos forman una serie de filamentos o tubos rígidos
denominados hifas; dentro de las hifas se encuentra el citoplasma que contiene varios
núcleos, y demás organelos: mitocondrias, ribosomas, vacuolas, aparato de Golgi, retículo
endoplasmático y lisosomas.
72 Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD.

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Las hifas dan al moho un aspecto algodonoso o de pelusa y pueden ser septadas, es decir,
presentar tabiques transversales que separan las células; o aseptadas o cenocíticas con
células multinucleadas. El conjunto de hifas forma un micelio. Existen dos tipos de
micelio: vegetativo que crece por toda la superficie del sustrato (suelo, alimento, tejido
vegetal) y tiene como función absorber nutrientes del sustrato al penetrar en él y fijar el
hongo al sustrato y micelio aéreo o reproductor que produce esporas sexuales y asexuales.
Pueden reproducir por procesos asexuales, sexuales o parasexuales. La forma de
reproducción se constituye en un criterio para su clasificación. Los patógenos
generalmente se reproducen de forma asexual, aunque algunas especies pueden tener
reproducción sexual y asexual, dependiendo de las condiciones ambientales
7.3.2 Reproducción asexual

Los hongos imperfectos se reproducen asexualmente de tres formas: por fragmentación o
fisión, por gemación y por la formación de esporas. En la reproducción asexual no hay
conjugación nuclear ni reducción cromática.
La reproducción asexual por fragmentación del micelio es una de las formas más sencillas
y consiste en la fragmentación, crecimiento y ramificación de las hifas para dar origen una
nueva colonia. Este mecanismo se usa en los subcultivos de laboratorio.
La Gemación consiste en la formación de una yema en un punto de la célula madre; a
medida que la nueva célula hija aumenta de tamaño, se separa de la madre y da lugar
posteriormente a nuevas hijas por el mismo mecanismo.
Esporas asexuales:
Por formación de esporas se presenta con dos opciones: por doble fisión de las hifas que
forman células unicelulares de forma cilíndrica denominadas artrosporas las cuales se
liberan cuando las hifas se separan para germinar en el medio adecuado; la segunda opción
consiste en la fragmentación de las hifas que desarrollan esporas redondas cubiertas por
paredes gruesas llamadas clamidosporas resistentes a condiciones adversas como el calor
y la desecación.
Las esporas presentan diferente forma, tamaño, color y número de células. Son las
responsables de dispersar los nuevos individuos. Algunas esporas están diseñadas para
resistir condiciones adversas de crecimiento o para proporcionar un periodo de latencia.
Algunos hongos producen sólo un tipo de esporas asexuales, mientras otros pueden
producir diferentes tipos de esporas:
Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD. 73

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Figura 7.1. Tipos de hifas y estructuras celulares (Carrillo, 2003).
Figura 7.2 Estructura y tipos de conidióforos en Aspergillus (Carrillo, 2003)

Esporangiosporas: Son esporas que se producen dentro de una envoltura denominada
esporangio, al romperse el esporangio las esporas salen y al caer en el sustrato adecuado
dan origen a nuevas hifas. En este tipo de reproducción el núcleo de la célula madre se
divide en varios núcleos, cada uno toma una parte del citoplasma de la célula madre que
luego se rodea de una membrana celular, la célula madre se rompe y se liberan varias
células hijas. Ejemplo: en Mucor o en Rhizopus nigricans
Conidias: Son esporas desnudas que se forman en los extremos de las hifas mediante
gemación. Ejemplo: en el hongo Aspergillus flavus

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Reproducción Sexual
La reproducción sexual es otra forma de reproducción de los hongos, e implica la unión
de 2 núcleos uno donante y otro receptor para formar un núcleo cigótico diploide, que por
meiosis origina 4 núcleos haploides. A los hongos con reproducción sexual se los
denomina perfectos.
Figura 7.3. Estructura de los Aspergillus y ciclo de vida mediante reproducción asexual (Carrillo, 2003)
La reproducción sexual comprende 3 fases:
Plasmogamia: en ella se unen los dos protoplastos de las hifas y los dos núcleos se reúnen
en una sola célula.
Cariogamia: fusión de los dos núcleos que se habían reunido en la plasmogamia
Meiosis: Se reduce el número de cromososmas, se forman gametos haploides.
Después de la fusión de los núcleos de las dos células: hifas o levaduras que comparten el
ADN y de ocurrida la meiosis se forman las esporas con características heredadas de cada
uno de sus progenitores. Cada espora tiene capacidad para desarrollar una nueva colonia.
Tipos de esporas sexuales
La reproducción sexual constituye una estrategia evolutiva de importancia bajo
condiciones adversas, ya que es un factor determinante en la adaptación a nuevas
condiciones ambientales.
Para los taxónomos, la morfología de las esporas sexuales constituye un carácter
diagnóstico para la determinación de las especies
Dependiendo del grupo taxonómico, las esporas sexuales reciben los siguientes nombres:
Ascosporas: Son unicelulares, generalmente se desarrollan 4 a 8 dentro una célula
denominada asca.
Basidiosporas: Unicelulares, se forman en células llamadas basidios en número de 4

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Zigosporas: Son de mayor tamaño con pared celular gruesa se desarrollan al fusionarse
dos hifas sexualmente compatibles.
Oosporas se forman por la unión de dos células gaméticas, oogonio y anteridio En
condiciones óptimas para la germinación, las oosporas dan origen a micelio y esporangios
los cuales infectan las plantas.
Reproducción parasexual:
La reproducción parasexual es un mecanismo raro, en el que las hifas se unen sin fusión
nuclear posterior y da lugar a una célula con más de un núcleo funcional y de diferente
procedencia genética. En algunas ocasiones pueden conjugarse los núcleos y aparece un
núcleo diploide heterocigótico. El hecho comprobado por primera vez en Aspergillus
nidulans demuestra que la recombinación genética puede existir sin utilizar las células
sexuales.
Figura 7.4 Fases de reproducción asexual y sexual de zigomycetes (Carrillo, 2003)
7.3.3 Sistema de clasificación

Los criterios usados para distinguir estos grupos incluyen tanto las características de su
estructura básica (morfología), patrones moleculares (estudios de la secuencia de DNA) y

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ciertos patrones de reproducción, particularmente de reproducción sexual. La tabla 1
presenta las principales características de los grupos.
TABLA 7.1. Características básicas de los grupos reconocidos en el reino Fungi.
DIVISIÓN CARACTERÍSTICAS ENFERMEDADES USOS
Quítridos En su mayoría acuáticos; esporas y gametos Vena grande de la Ninguno
flagelados; las paredes celulares tienen quitina; el lechuga; infección del
cuerpo vegetativo suele ser un talo, raramente maíz
una hifa.
Oomicetes Algunos acuáticos; esporas flageladas; formación Tizones y mildíus de Ninguno
de huevos y espermatozoides en gametangios las plantas;
especiales; las paredes celulares contienen infecciones de los
celulosa. peces
Zigomicetes Formación de zigosporas (esporas fuertes y Pocas Ninguno
resistentes por fusión de gametangios); sin
células flageladas.
Ascomicetes Formación de finas esporas asexuales (conidios); Cáncer del castaño; Alimentos
esporas sexuales en ascos; hifas divididas por enfermedad del olmo; (setas, trufas
tabiques perforados; sin células flageladas. cornezuelo del (elaboración de
centeno vinos, cerveza,
pan (levaduras)
Basidiomicetes Esporas sexuales en basidios; hifas divididas por Royas; tizones Alimentos
tabiques perforados; dicariones; sin células (setas)
flageladas.
Deuteromicetes Hongos sin ciclos sexuales conocidos; sin células Tiña, muguet Queso,
flageladas. antibióticos.
7.3.4 Quitridiomicetes
Los quitridiomicetes (Chytridiomycota) y los mohos abundan en los hábitats acuáticos.
Ciertos ascomicetes y deuteromicetes son también frecuentes, tanto en agua dulce como
salada. En los últimos años se han descubierto numerosos hongos en ríos y arroyos
contaminados. Éstos participan en la purificación natural de las aguas residuales. Algunas
de estas especies son de especial interés puesto que causan enfermedades en los seres
humanos. Son los únicos miembros del reino Fungi que en alguna parte de su ciclo de vida
producen células móviles.
Son hongos terrestres o acuáticos, la mayoría de los cuales son saprobios. Algunos afectan
la producción agrícola y son causantes de enfermedades o parásitos de plantas, insectos e
inclusive de otros hongos
El talo de estos hongos es cenocítico y pueden formar esporas o esporangios de resistencia.
Las paredes celulares de las hifas están principalmente formadas de quitina y celulosa.
7.3.5 Oomycetes
El reino Stramenopila (Chromista) es de reciente adición al sistema convencional de 5
reinos. Se incluye a los Oomycota y están relacionados con las algas. Se les llama mohos
acuáticos, poseen núcleos somáticos diploides, pared celular compuesta por celulosa.

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Zoosporas biflageladas: un flagelo con látigo y otros con plumilla. Poseen micelio
constituido por hifas cenocíticas y la reproducción sexual es por contacto gametangial.
Las estructuras reproductivas: Oogonio (gametangio femenino) y anteridio (gametangio
masculino) se unen para formar la Oospora. La reproducción sexual también es por
contacto entre gamentangios. Las estructuras de conservación son oosporass y en algunas
las clamidosporas
7.3.6 Zigomicetes
Los zigomicetes son hongos terrestres, de distribución cosmopolita (cerca de 867
especies). Producen células no mótiles, que se desarrollan rápidamente. Las hifas son
cenocíticas (coenocitos) y generalmente aceptadas
Se reproducen asexualmente mediante esporas, incluyendo fases de desarrollo:
clamidioconidias, conidias y esporangiosporas, contenidas en el esporangio,
empaquetadas en un único o ramificado esporangióforo.
La mayoría son saprobios, es decir, habitan en el suelo y se alimentan de plantas o de
materia animal muerta. Algunos son parásitos de las plantas, insectos o pequeños animales
del suelo. Los zigomicetes comparten un antecesor común con el linaje que llevó a los
ascomicetes y basidiomicetes.
7.3.7 Ascomycetes
Los ascomicetes son el grupo de mayor número de especies del reino de los hongos. Entre
los ascomicetes están las levaduras y los mildiús pulverulentos, muchos de los mohos
negros y verde-azulados comunes, las colmenillas y las trufas.
Algunos miembros de este grupo de hongos causan muchas enfermedades a las plantas;
otros son productores de micotoxinas, pero también se encuentran algunos que son fuente
de muchos antibióticos.
En los ascomicetes las hifas están divididas por paredes transversales o tabiques
perforados, a los que se denomina septos (septum). La reproducción sexual en los
ascomicetes implica siempre la formación de un asco
Cada compartimiento generalmente contiene un núcleo separado, pero los tabiques tienen
poros a través de los cuales pueden moverse el citoplasma y los núcleos.
El ciclo de vida de los ascomicetes incluye típicamente tanto la reproducción asexual
como la sexual. Las esporas asexuales se forman comúnmente aisladas, o en cadenas, en
el ápice de una hifa especializada. Se caracterizan por ser muy pequeñas y numerosas, y
se las denomina conidios, (del griego konis: "polvo").

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Figura 7.5. Estructura de los Aspergillus y ciclo de vida mediante reproducción asexual (Carrillo, 2003)
Entre las especies más importantes están Aspergillus flavus que tiene una distribución
mundial y se produce normalmente como un saprófito en el suelo y en muchos tipos de
materia orgánica en descomposición, Penicillium notatum de donde se extrajo por primera
vez la penicilina. Estos mohos pueden cultivarse de manera artificial en diferentes medios
de cultivo
Las colonias de Aspergillus suelen ser de crecimiento rápido, blanco, amarillo, amarillo-
marrón, marrón a negro o tonos de verde, y, principalmente, de un denso sentido de
conidióforos rectos.
Para la identificación, los aislados se inocularon por lo general en tres puntos sobre agar
Czapek Dox y agar de dextrosa de patata y se incubaron a 25ºC. La mayoría de las especies
desarrollan esporas en 7 días. Las descripciones se basan principalmente en la
pigmentación de la colonia y la morfología de la cabeza conidial. Montajes microscópicos
se hacen mejor con una cámara húmeda y las preparación placas montadas en azul
lactofenol.

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7.3.8 Levaduras características morfológicas y fisiológicas

Las levaduras son hongos unicelulares de forma esférica, alargada u ovalada, presentan
diferentes colores: blanco, rosado, beige o rojo. Su tamaño oscila entre 2,5 – 10 micras de
ancho y 4,5 - 21 micras de largo. Son microorganismos anaerobios facultativos. La
levadura aeróbica produce dióxido de carbono, agua y una producción relativamente alta
de nueva levadura, mientras que la levadura anaerobia fermenta el azúcar en alcohol y
dióxido de carbono y tiene un crecimiento más lento.
La mayoría de las levaduras se reproducen asexualmente por gemación consistente en que
a la célula madre le sale un botón o gema. Al mismo tiempo que el botón aumenta de
tamaño, el núcleo de la célula madre mediante el proceso de mitosis se divide en dos,
transfiriéndole uno a la célula hija o botón. Poco a poco la gema se va desprendiendo
dando origen a una levadura hija idéntica a la madre. Una levadura puede producir hasta
24 células hijas. Las levaduras también pueden reproducirse por fisión binaria. Algunas
no separan la célula hija o gema y forman pseudomicelio, característica que se usa para
identificar y clasificar la levadura, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Candida
albicans forma pseudomicelio.
Las levaduras pueden habitar en el suelo, sobre las mucosas, en la superficie de vegetales.
La mayoría son mesófilas, con una temperatura máxima de crecimiento entre. 24 y 48ºC.
Se encuentran en un rango amplio de pH el cual está comprendido entre 2,5 y 8 horas.
Figura 7.6 Ultra estructura de la levadura (Brock et al., 2010)

Las levaduras tienen importancia en la obtención de productos y bebidas fermentables
debido a su capacidad de realizar fermentación alcohólica es el caso de Saccharomyces
cervisiae. Tienen un papel importante en la fabricación de pan y productos de pastelería.
También se utilizan en la producción de antibióticos, son fuente de proteína y de vitaminas
del complejo B. Mediante técnicas de ADN recombinante se utilizan como hospederos en
la industria médico farmacéutica, para la producción de vacunas, por ejemplo, Anti-
hepatitis A, Anti-hepatitis B, inmunopotenciadores, la Hirudina indicada en la

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Trombocitopenia y para la prevención de trombosis, proteínas de la sangre, hormonas
como la insulina y el glucagón e interferonesarrastrados a través de corrientes de aire o en
fluidos o por insectos.
Un pequeño porcentaje de levaduras (aproxidamente un 25%) pueden alterar los alimentos
causando su deterioro. La actividad contaminante de las levaduras sobre alimentos puede
inhibirse por dos vías; mediante la aplicación de métodos físicos con actividad bactericida,
entre los que se destacan la esterilización por calor a presión y por filtración y por la
aplicación de condiciones ambientales desfavorables con efecto bacteriostático, tales
como disminución de la aw, bajos valores de pH y temperatura.
Condición del hospedero para acción patógena de levaduras: En el sentido más estricto de
la palabra, no existen levaduras patógenas por naturaleza; las que están relacionadas con
enfermedad en el hombre o animales, son incapaces de producir infección en un individuo
sano. Se deben presentar algunas alteraciones en las defensas celulares del huésped, en la
fisiología, o en la composición de la flora normal para que pueda producirse la
colonización, infección y la enfermedad por levaduras.
7.3.9 Basidiomycetes
Figura 7.7. Estructura de los Basidiomicetes (Carrillo, 2003)

Constituyen el grupo de hongos más familiar, ya que incluyen a los hongos de sombrero,
conocidos en muchos países con el nombre de setas. En los basidiomicetes, las esporas
sexuales se desarrollan sobre un basidio.
La seta -fructificación o basidiocarpo- es el cuerpo fructífero en donde se producen las
esporas. Está compuesto por masas de hifas fuertemente compactas.
El micelio, a partir del cual se producen los basidiocarpos, forma una trama difusa que
puede crecer radialmente varios metros.

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Dentro de este grupo se encuentran los hongos macroscópicos o agaricales, entre los
cuales están las setas que pueden ser alimenticias, venenosas, con propiedades
alucinógenas, entre otras. Ej. Amanita muscaria
7.3.10 Deuteromycetes
Son los llamados hongos imperfectos porque hasta ahora no se les ha reconocido la
reproducción sexual. La mayoría de las especies de Fusarium son los hongos del suelo y
tienen una distribución mundial. Algunos son patógenos de plantas causantes de raíz y
pudrición del tallo, marchitez vascular o pudrición de la fruta. Otras especies causan la
pudrición de almacenamiento y son importantes productores de micotoxinas. Varias
especies, en particular, F. oxysporum, F. solani y F. moniliforme, se reconoce que son
patógenas para el hombre y los animales que causan queratitis micótica onicomicosis, y
Hialohifomicosis, especialmente en víctimas de quemaduras y pacientes de trasplante de
médula ósea. Dentro de este grupo Fusarium solani, es el responsable de mortalidades
masivas en planteles de reproductores de camarón P. vannamei
Estos hongos pueden cultivarse en medios artificiales y se caracterizan por que las
colonias son generalmente crecen rápidamente, pálido o de color brillante (dependiendo
de las especies) y puede o no puede tener un micelio aéreo algodonoso. El color del talo
varía de blanquecino a amarillo, marrón, rosa rojizo, o tonos lila. Microscópicamente, las
especies de Fusarium se caracterizan por producir tanto macro como microconidias de
fiálides delgados. Las macroconidias son hialinas, de dos a varios segmentos, unicelulares,
fusiformes en forma de hoz, en su mayoría con una célula apical alargado y pediceladas
de células basales. Las microconidias presentan 1 a 2 divisiones, son unicelulares, hialinas,
piriformes, fusiformes a ovaladas, rectas o curvas. Las clamidoconidias puede estar
presentes o ausentes.
7.4 MATERIALES Y MÉTODOS

7.4.1 Preparación de medios y el material
De acuerdo con el número de muestras (grupos de estudiantes), deberá calcularse la
cantidad de medios de cultivo y reactivos necesarios, lo mismo que materiales e insumos.
Las cepas de hongos deben estar purificadas y deberán replicarse en agar Saboraud al 4%
el día previo a la práctica e incubarse a 28 -30ºC durante 1 semana para formar una colonia
típica.
Materiales a preparar para todo el grupo
› Dos cajas de Petri con Agar Sabouraud al 4%
› 100 ml de agua esterilizada
› Azul de lactofenol
Para cada grupo de trabajo: Para armar la micro cámara (fig. 7.8):
› Cepas de hongos o material orgánico con moho
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› Papel de filtro estéril (puede reemplazarse por papel de cocina)
› 4 portaobjetos estériles
› 2 portaobjetos estériles
› Cuchilla de bisturí
› Mechero con alcohol, encendedor
› Pinzas esterilizadas
› Trozo del agar Sabouraud
Para la observación al microscopio
› Microscopio
› Portaobjetos y cubreobjetos
› Azul de lactofenol
› Asa de aguja
Nota: Si la cepa no está pura, deberá realizarse la purificación en sucesivas resiembras
hasta verificar el monocultivo mediante la coloración de Azul de lactofenol.
7.4.2 Ensamblaje de la micro cámara
Tapa de la
caja de Petri
Cubreobjetos
Trozo de agar con

inóculo del hongo
Portaobjetos
Soporte del
portaobjetos
Papel de filtro
para humedecer
Base de la
caja de Petri
Figura 7.8 Material y método de ensamblaje de la micro cámara húmeda para observación e identificación
de hongos en el microscopio
Con el propósito de observar las estructuras de los mohos y proceder a la identificación,
es necesario lograr el aislamiento de la cepa pura y el desarrollo de hifas, esporangios y
esporas que son los caracteres de diagnóstico de las especies. Para algunas especies es
requisito lograr la reproducción sexual para visualizar las estructuras típicas. Sin embargo,
en la mayoría de los casos este procedimiento puede conllevar varias semanas o meses.

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7.5 RESULTADOS ESPERADOS

Los estudiantes deberán incluir los resultados en la tabla 7.2 y de acuerdo al porcentaje de
afinidad, establecer la especie o grupo taxonómico con mayor probabilidad o mayor índice
de afinidad.
Las figuras serán elaboradas teniendo en cuenta la observación en fresco y la observación
con azul de lactofenol. En aumento de 40X y 100X si es del caso. Deberán esquematizar
tipos de hifas observadas, tipos de esporas y esporangios. Se recuerda que deben incluir
la fuente bibliográfica
TABLA 7.2. Resultados registrados y tabulados
CARACTERÍSTICA CARACTERÍSTICAS DE CADA CEPA DE HONGOS

MORFOLÓGICAS 1 2 3 4 5 6 7 8
Hifa
Esporangio
Esporangióforo
Esporas
POSIBLE ESPECIE
≥ 80% de afinidad
7.6 BIBLIOGRAFÍA
Alexopoulus, C. J.; C. W. Mims, M. Blackwell. 1996. Introductory Mycology. 4th ed.
John Willey and Sons, INC. New York, Chichester, Brisbane, Toronto,
Singapore
Beg, Q.K., M. Kapoor, L. Mahajan, G.S. Hoondal. 2004. Microbial xylanases and their
industrial applications: a review. Appl. Microbiol. and Biotech. Springer
Berlin/Heidelberg.
Bonifaz A., Micología Médica Básica, 3a edición, México, D.F., McGraw-Hill
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Carrillo L. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 4
Casadesus L, Rojas T, Brizuela A.L., et l, Micología, Ciudad de la habana, MES, 1985,
p 34.
Domsch, K.H., W. Gams, And T.H. Anderson. 1980. Compendium of soil fungi.
Volume 1. Academic Press, London, UK.
Gow N. & Gadd G.M. (Eds) 1995. The Growing Fungus. Chapman Hall, London.
Herrera, T.; M. Ulloa. 1995. El Reino de los Hongos. Universidad Nacional Autónoma
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Largent, D. L. 1980. How to identified Mushroom to Genus III: Microscopic Features.
Largent, D. L. 1980. How to identified Mushrooms to Genus Field identification to
genera.
Largent, D. L. 1980. How to identified Mushrooms to Genus Macroscopie Features.
Largent, D. L. 1988. How to identified Mushroom to Genus IV: Modern Genera.
Madigan M.T, Martinko J.M., Stahl D And Clark D.P., Brock Biology of
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Parra R, García-Gil F, Borrego Le, Lanz-Mendoza H, Del Río Dueñas I, et al. 2006.
Detección de hongos y oomycetos en cultivos de peces dulceacuícolas
empleando el kit BIAADETECT, producto desarrollado a partir del homóptero
Dactylopius coccus. México, D.F. Investigación Universitaria
Multidisciplinaria; 5(5):12-18
Prescott G.W., How to know the freshwater algae, Dubuque, Iowa, Wm. C. Brown,
1978
Prescott L.M., Harley J.P. And Klein G.A., Microbiología, 3a edición, Madrid,
México, Mc
Samson, R.A., E.S. Hoekstra, C.A.N. Van Oorschot. 1984. Introduction to food-borne
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Tovar Castillo, José. 1987. Micología General. Editorial Limusa.
Wainwright M. 1995. An Introduction to Fungal Biotechnology. Wiley, Chichester.

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MINIEDUCACIÓN”
7.7 MANEJO DE RESIDUOS QUÍMICOS Y PELIGROSOS
Agua (150 mL Siembra de los

para cada medio) hongos Microcámara
Preparar Agar
Saboraud ® Esterilizar Servir Utilizar Inocular Incubar
4%
Aceite de Azul de lactofenol

Observar Observar
inmersión (1 gota)
Residuo 2 Cubreobjetos
Residuo 1 biológico
+aceite de inmersión
Ingreso de materiales
Continuidad del proceso
Residuo
Residuo 1: 3 gotas por placa

Residuo 2: 1 gota por placa
TIPO DE CAREACTERISTICAS CLASIFICACIÓN SEGÚN ETIQUETEADO DE CODIGO

RESIDUOS PELIGROSIDAD SGA DECRETO TRANSPORTE UN
Residuo 1 Nocivo NA 2821
Residuo 2 Nocivo N.A 3082
Tipo de tratamiento y disposición final in situ

En esta experiencia se generó un residuo.
Residuo1: Será depositado en bidón R12
Residuo2: Será depositado en bidón R10

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8 RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE PROTOZOOS DE VIDA
LIBRE Y PARÁSITOS
8.1 INTRODUCCIÓN
Los protozoos son organismos unicelulares eucariotas. Son móviles y heterótrofos. Por su
tamaño y debido a la formación de quistes, que les permiten resistir a las condiciones
medioambientales adversas, muchas especies son cosmopolitas, mientras que otras son de
distribución limitada. Hay especies de vida libre y otras son parásitos.
Teniendo en cuenta que la acuicultura es una actividad en donde se interactúa con el
ambiente, los protozoos constituyen una comunidad esencial en el manejo del ecosistema
acuático formando parte de la productividad secundaria, aprovechándolos como alimento
en los sistemas de biofloc o constituyéndose como potenciales agentes patógenos.
De ahí la importancia que el estudiante de Acuicultura se familiarice con este grupo de
organismos, para poder entender los procesos de calidad del agua, la potencialidad que
tienen como nutrientes y su importancia en la sanidad animal.
8.2 OBJETIVOS
8.2.1 O. General
Al finalizar de la práctica, el estudiante estará en capacidad de reconocer la importancia
de los protozoos como parte fundamental de la productividad secundaria en ecosistemas
acuáticos y húmedos, y adquirir habilidades en el aislamiento e identificación de protistas
de interés en su formación profesional.
8.2.2 O. Específicos
- Aislar protozoos de un sistema de producción acuática
- Identificar las estructuras morfológicas de los protozoos aislados.
- Determinar la riqueza de especies de protozoos en un ecosistema acuícola
- Determinar hasta el nivel taxonómico máximo posible los diferentes grupos de
protozoos aislados
8.3 MARCO TEÓRICO

La importancia de los protozoarios se traduce en la abundancia y diversidad de estos seres
vivos que cuentan con cerca de 100.000 especies, diversidad que beneficia los ecosistemas
terrestres, acuáticos y otros. Sin embargo, algunas especies se consideran como un factor
de riesgo negativo en la salud humana y animal por ser parásitos oportunistas u obligados;
muchas infecciones o infestaciones pueden resultar asintomáticas o graves, dependiendo
del parásito y del hospedero (Barnes, 1985; Álvarez, 2006). En la acuicultura constituyen
una fuente de nutrientes en la red trófica, pero un manejo inadecuado del sistema de
producción, pueden traducirse en un problema sanitario. La clasificación taxonómica de
2018
“VIGILADA
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los protozoarios presenta cada día variaciones de acuerdo con los avances de la sistemática
y de la biología molecular.
8.3.1 Sistema de clasificación

El siguiente es un resumen de la clasificación sistemática de los Protozoos (Barnes, 1985;
Villée, 1999), los cuales se clasifican en tres Phyla, en función de su mecanismo de
movilidad:
TABLA 8.1. Características básicas de los grupos reconocidos en el reino Protista.
División Movimiento Relación interespecífica
Phylum Sarcomastigophora
De vida libre y parasitarios
Subphylum Sarcodina-amoebae mediante la emisión de seudópodos).
• Pueden ser
Subphylum Mastigophora - mediante uno o más flagelos (similares
hemoparásitos
Flagelados a látigos).
mediante la flexión del cuerpo.
Usan el complejo apical para invadir el • Todos los integrantes de
Phylum Apicomplexa -
cuerpo del huésped. este phylum son
apicomplexos:
Tienen reproducción sexuada y parásitos.
asexuada
• De vida libre y
mediante cilios (filamentos parecidos a
Phylum Ciliophora - ciliados parasitarios
pelos).
8.3.1.1 Protozoos ameboideos

Filo Rhizopoda: Utilizan para la locomoción y rizopodios, lobopodios o reticulopodios.
Subclase Gymnamoebia: Amebas sin concha, marinas y dulceacuícolas por
ejemplo Amoeba, Chaos, Acanthamoeba, Entamoeba (figs. 8.1 y 8.2).
Figura 8.1. Amebas: A) Trofozoito; B) Quiste unicuclear; C) Quiste multinuclear (Barnes, 1984)

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Figura 8.2. Amoeba proteus sin concha o teca (Barnes, 1984)
Subclase Testacealobosia: Amebas con concha. Marinas o dulceacuícolas. Arcella,
Difflugia, Centropyxis (Fig. 8.3).
Clase Heteroblastea (Schizopyrenida): Amebas desnudas con estados flagelados. Hay
especies marinas, dulciacuícolas y terrestres.
Clase Karyoblastea (Pelobiontea): Amebas multinucleadas desnudas con un
pseudópodo y sin estados flagelados, por ejemplo, Pelomyxa.
Clase Filosea: Amebas con filopodios.
Subclase Aconchulinia: Amebas desnudas. De agua dulce y parasitas de algas, por
ejemplo, Vapyrella
Clase Lobosea: Por lo general pseudópodos de tipo lobopodio. Sin estados flagelados.
Figura 8.3. Amebas tecadas o con testa A y B) Arcella; E) Euglipha (Barnes, 1984)

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Filo Actinopoda: Protozoos ameboides generalmente flotadores o sésiles, con

actinopodios y filopodios finos que irradian desde un cuerpo esférico.
Subclase Testaceafilosia: Amebas con concha. Marinas y dulciacuícolas, algunas
especies viven en los musgos, por ejemplo, Gromia, Euglypha.
Clase Granoreticulosia: Protozoos ameboides con delicados reticulopodios granulares.
Orden Foraminiferida (Fig. 8.4): Fundamentalmente son especies marinas que
generalmente tienen conchas multicamerales. Las conchas pueden ser orgánicas,
si bien con frecuencia son calcáreas, por ejemplo, Globigerina, Orbulina,
Discorbis, Spirillina, Numulites, Homotrema.
Figura 8.4. Foraminiferos: Archaias sp. (Barnes, 1984)

Los órdenes Athalamida y Monothalamida constan, respectivamente, de un
número pequeño de especies desnudas y un número pequeño de especies con
conchas monocamerales, que en su ciclo vital carecen de alternancia de
generaciones.
Clase Acantharea (Fig. 8.5): Radiolarios con un esqueleto radial de sulfato de estroncio.
Marinos, por ejemplo, Acanthometra.
Clase Polycistinea: Radiolarios con esqueleto silíceo y una membrana capsular
perforada. Marinos, por ejemplo, Thassicola, Collozoum, Sphaerozoum.
Clase Phaedorea: Radiolarios con esqueleto silíceo pero con una membrana capsular
que contiene tres grandes poros. Marinos, por ejemplo, Aula canta.
Clase Heliozoea: Sin capsula central. Desnudos, o con esqueleto de escamas y espinas
silíceas. Marinos y de agua dulce, por ejemplo, Actinophrys, Actinosphaerium,
Camptonema.

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Figura 8.5. Radiolarios y Heliozoarios (Barnes, 1984)
8.3.1.2 Protozoos flagelados
Dinoflagelados: Fitoflagelados con un flagelo ecuatorial y otro longitudinal localizados
en surcos (Fig. 8.6). Cuerpo desnudo o cubierto por placas de celulosa, valvas o por una
membrana de celulosa. Por lo general con cromoplastos amarillos o marrones y estigmas,
aunque hay muchas especies incoloras (Álvarez, 2006). En su mayor parte marinos;
algunos parásitos. Incluye los géneros marinos Gonyaulax, Noctiluca, Histiophysis, y
Ornithocercus, y los géneros marinos y dulciacuícolas Glenodinium, Gymnodinium,
Ceratium, Oodinium y Symbiodinium.
Figura 8.6. Dinoflagelados: A) Ceratium; B) Gymnodinium; C) Glenodinium (según Pennak)

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MINIEDUCACIÓN”
Flagelados con cuatro a mas flagelos. Sin mitocondrias diferenciadas, aparato de

Golgi que junto con un filamento asociado al cuerpo basal compone un orgánulo
diferenciado, el cuerpo parabasal. Comprende dos grupos a saber (Fig. 8.7):
Los tricomonadinos: Con cuatro a seis flagelos por mastigonte, uno de los flagelos es
rastrero. Se encuentran en el tubo digestivo de los vertebrados e insectos, por ejemplo,
Trichomonas (parasito del tracto urogenital de vertebrados, incluido el hombre).
Figura 8.7. A) Trichomonas; B) Hexamita (Barnes, 1984)

Los Hypermastigida: con muchos flagelos por sistema mastigonte; se encuentran en
el sistema digestivo de termitas y cucarachas xilófagas: Lophomonas, Trichonympha,
Barbulanynpha.
Filo Metamonada: Zooflagelados pluriflagelados. De uno o varios sistemas mastigontes
con entre uno y cuatro flagelados cada uno. Uno de los flagelos de cada sistema está
dirigido hacia atrás (Ville, 1999)..
Clase Anaxostylea: carecen de varilla microtubular longitudinal como parte del
sistema mastigonte.
Orden Retortamonadina: Parásitos del tracto digestivo de insectos y vertebrados,
con dos o cuatro flagelos. Un flagelo asociado con el citostoma localizado
centralmente, por ejemplo, Chilomastix.
Orden Diplomonadida: Flagelados bilateralmente simétricos, con dos núcleos,
cada uno de los cuales está asociado a un numero de flagelos que oscila entre uno
a cuatro. Sin mitocondrias. La mayoría parásitos, por ejemplo, Hexamita, Giardia.
Clase Axostylea: con una varilla microtubular longitudinal como parte del sistema
mastigonte.
Orden Oxymonadida: Flagelados comensales o mutualistas en el tubo digestivo de
insectos; unos pocos en vertebrados. De uno a muchos núcleos, cada núcleo
asociado a cuatro flagelos, por ejemplo, Oxymonas, Pyrsonympha.
Filo Kinetoplastida: Uno o dos flagelos originados en una concavidad. Un cuerpo con
ADN (cintetoplasto) localizado dentro del alargado mitocondrión y asociado con los

2018
cuerpos basales flagelares, la mayoría parásitos, por ejemplo, Bodo, Leishmania,
Trypanosoma.
Filo Euglenophyta: Flagelados alargados de color verde o incoloros con dos flagelos que
arrancan de una cavidad anterior (Fig. 8.8). Estigma presente en las formas coloreadas.
Fundamentalmente de aguas dulces, por ejemplo, Euglena. Phacus, Peranema,
Rhabdomonas.
Figura 8.8. Flagelados, Euglena (Barnes, 1984)

Filo Cryptophyta: Fitoflagelados biflagelados, comprimidos, con una o reservorio
anterior. Dos cromoplastidos, por lo general amarillo, pardo o incoloro. Marinos y
dulciacuícolas. Chilomonas es un género incoloro frecuente en aguas contaminadas.
Filo Opalinata: Cuerpo cubierto de filas oblicuas longitudinales de cilios que nacen de
unas filas subterminales anteriores. Falta la infraciliación característica de los auténticos
ciliados. Dos o más núcleos monomórficos (Álvarez, 2006). División binaria
generalmente longitudinal. Reproducción sexual con singamia compleja y con gametos
flagelados. Comensales del tubo digestivo de los anuros; menos frecuentes en salamandras
y reptiles, por ejemplo, Opalina (Fig. 8.9), Zelleriella.
Figura 8.9. Otros flagelados: A) Opalina, B Morfología C) Trypanosoma (Barnes, 1984)
Filo Heterokonta: Tienen dos flagelos distintos, uno con mastigonemas y otro liso. Los
cloroplastos contienen clorofila a y c. Este enorme y heterogéneo grupo de protistas,

2018
“VIGILADA
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principalmente autótrofos, incluye a las algas pardas multicelulares, a algunas algas

filamentosas, y a las diatomeas. En estas formas la condición flagelada aparece solamente
en los reproductores.
Los principales Protozoos heterokontos son los miembros de la
Clase Chrysophycea. Estos son pequeños flagelados con cromoplastos que contienen
fucoxantina. La mayoría son desnudos, pero algunos tienen el cuerpo cubierto con
escamas silíceas (Álvarez, 2006; Cairns y Ruthven, 1972). Principalmente habitantes de
aguas dulces, por ejemplo, Chromulina, Ochromonas, Synura.
Filo Chlorophyta: Protistas verdes autotróficos que tienen clorofilas a y b. Incluyen
muchas especies multicelulares (algas verdes) con estados reproductores flagelados. Los
principales protozoos flagelados son miembros del orden Volvocales, especies
unicelulares y coloniales con dos a cuatro flagelos apicales y un único cloroplasto por
célula en forma de copa. Algunas coloreadas y principalmente de aguas dulces, por
ejemplo, Chlamydomonas, Polytomella, Haematococcus, Gonium, Pandorina,
Platydorina, Eudorina, Pleodorina, Volvox.
Filo Haptophyta: Pequeños flagelados que tienen un orgánulo semejante a un flagelo
(haptonema) que se localiza entre los dos flagelos verdaderos. Cuerpo cubierto por
escamas orgánicas, aunque en los cocolitoforidos estas escamas están revestidas por
cristales de carbonato cálcico. Principalmente marinos, por ejemplo, Coccolithus.
Filo Choanoflagellida: Zooflagelados solitarios y coloniales con un único flagelo
rodeado por un collar de microvellosidades (Álvarez, 2006). Algunas especies son sésiles
y pedunculadas. El cuerpo puede estar desnudo o cubierto por una teca, que en algunas
especies marinas es silícea. Marinos y dulciacuícolas, por ejemplo, Codonosiga,
Proterospongia, Salpingoeca.
8.3.1.3 Protozoos ciliados
Filo Ciliophora: Protozoos que poseen una infraciliación y, al menos alguna vez en su
ciclo vital, cilios en la superficie (Ville, 1999). Los núcleos son dimorficos.
Subclase Hypostomata: Cuerpo cilíndrico o aplanado dorsoventralmente, en todos
los casos con la boca en el lado ventral. Ciliación somática a menudo reducida.
Especies de vida libre y muchas simbiontes, por ejemplo, Synhymenia, Nassula,
Microthorax, Hypocoma, Trochiloides, Chilodochona, Lobochona, Spirochona,
Stylochona, Ancistrocoma, Foettingeria, Chromidina, Ascophrys.
Subclase Suctoria: Sésiles, generalmente pedunculados, con tentáculos en el
extremo libre. Adultos sin cilios, pero presentes en los estados larvarios nadadores.
La mayoría son ectosimbiontes de invertebrados acuáticos, por ejemplo, Ephelota,
Podophrya, Acineta.
Clase Oligohymenophora: Aparato oral normalmente bien desarrollado que contiene
orgánulos ciliares compuestos (Fig. 8.13).
Subclase Hymenostomada: Ciliación corporal normalmente uniforme y estructuras
orales inconspicuas, por ejemplo, Colpidium, Glaucoma, Tetrahymena,
Paramecium, Pleuronema (Ville, 1999).

2018
D
Figura 8.13. A y B) Ciliados hipostomata C) Paramecium D) Suctorio (Acineta) (Barnes, 1984)

Subclase Peritricha: Formas principalmente sésiles, con ciliacion corporal reducida
(Fig. 8.14). Ciliación oral a bandas normalmente conspicuas, por ejemplo,
Carchesium, Epistylis, Lagenophrys, Vorticella, Zoothamnium, Trichodina.
Figura 8.14. Ciliphora: Vorticella (Barnes, 1984)

Clase Polihymenophora: Región oral con zona adoral de membranelas bucales
patentes. Algunas especies con orgánulos compuestos, como los cirros.
Subclase Spirotricha: con características de clase.
especialmente grandes con ciliacion corporal uniforme, por ejemplo, Blepharisma,
Bursaria (Fig. 8.15), Spirostomun, Stentor (Fig. 8.16), Folliculina.

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A B
C D
15 16
Figura 8.15. Espirotricos: Bursari (Barnes, 1984)
Figura 8.16. Ciliados A) Stentor; B) Spirostomum ambiguum; C) Stylonychia; D) holotrico Euplotes (Barnes,
1984)
Orden Odontostomatina: Ciliados con forma de cuña, comprimidos lateralmente,
con ciliacion corporal reducida, por ejemplo, Saprodinium.
Orden Oligotrichida: Ciliados con ciliacion somática reducida, pero con largas
proyecciones de orgánulos ciliares bucales, por ejemplo, Halteria. El suborden
Tintinnina tiene especies lorigadas: Codonella, Favella, Tintinnopsis, Tintinnus.
Orden Heterotrichida: con cilios de diversas longitudes.
Clase Kinetofragminophora: Cinetias aisladas en la región oral del cuerpo que llevan
los cilios, pero no orgánulos filiares compuestos.
Subclase Gymnostomata: Citostoma en o cerca de la superficie del cuerpo y
localizado en el extremo anterior o lateralmente. Ciliación somática por lo general
uniforme, por ejemplo, Stephanopogon. Loxodes, Coleps,
Prorodon, Actinobolina, Didinium, Dileptus, Lacrymaria, Litonotus, y
Loxophyllum.
Subclase Vestibulifera: Citostoma dentro de un vestíbulo que lleva Ciliación
diferente. Especies de vida libre y simbiótica, por ejemplo, Balantidium, Colpoda,
Blepharocorys, Entodinium.
Otros grupos de protozoarios parásitos son:
8.3.1.4 Protozoos formadores de esporas
Filo Sporozoa o Apicomplexa: Protozoos parásitos que forman esporas, con un complejo
acicalen algún estado. Las esporas carecen de filamentos polares. Están representados por
organismos de las clases Gregarinea, Clase Coccidea, Clase Piroplasmea

2018
Filo Microsporea: Protozoos parásitos que tienen esporas con un filamento polar, por
ejemplo, Nosema.
Filo Myxosporidia: Protozoos parásitos que tienen esporas con filamento polar y
rodeados por algunas valvas, por ejemplo, Myxosoma.

Para todo el grupo: Dos preparados de cultivo de protozoos, uno proveniente de sistema
de Biofloc del CINPIC y otro con un preparado de reservorios no controlados (cunetas,
lagunas, canales, etc.).
8.4.1 Preparación de medios y el material

Para cada mesa de trabajo se deberá disponer de los siguientes materiales
› Frascos de vidrio transparente con boca anca de 500 a 1000 cc de capacidad
› Nasas de 50 a 100 micras de ojo de malla
› Papel de filtro estéril (puede reemplazarse por papel de cocina)
› Cajas de Petri pequeñas y grandes
› Gradillas de apoyo
› Bandejas y papel secante o servilletas
› Protozoos
Observación al microscopio
› Estereoscopio (1 en cada mesa)
› Microscopios por cada mesa (2 en cada mesa)
› Asa de aguja (2 unidades)
› Pipetas Pasteur de vidrio (4 unidades por mesa)
› Pinceles Nº 0 de pelo de camello o de marta (4 unidades por mesa)
› Portaobjetos y cubreobjetos (lo necesario)
› Lugol (gotero)
› Glicerina (gotero)
› Aceite de inmersión (gotero)
› Esmalte de uñas transparente
Para obtener una muestra nutrida de protozoarios de vida libre, dos a tres semanas con
anterioridad, se prepara un recipiente preferiblemente de vidrio transparente de 500 a 1000
ml de boca ancha y se llena hasta la mitad con agua de una fuente específica con material
de hojarasca o propios del estanque o ecosistema acuático con restos orgánicos, y se coloca
en un ambiente con iluminación 12:12, cubierta con una malla que permita el intercambio
de aire.
8.4.2 Método de observación, caracterización y recuento

› Para la observación se debe agitar delicadamente el agua y filtrar una fracción de 5
mL de muestra, con nasa de 50 a 100 micras dependiendo del interés,

2018
“VIGILADA
MINIEDUCACIÓN”
› Depositar dicha muestra en una cámara de Bogorov, Sedgwick-Rafter o caja de Petri

pequeña.
› Se hace una primera observación en el estereoscopio, retirando material vegetal grande
con pinzas, para mejorar la observación. Puede pasar al microscopio si es necesario.
› Se realiza observación cualitativa, esquematizando los microorganismos observados
como “morfotipos” o usando atlas de protozoología
› Se realiza el recuento de cada una de los morfotipos encontrados.
› Se repite el procedimiento cinco veces
› Usando pipeta Pasteur se transfiere cada una de los “morfotipos” encontrados a
portaobjetos para la caracterización taxonómica, las cuáles serán depositados sobre
una gota de agua de la muestra para observar “in vivo”.
› Se repite este procedimiento, pero ahora se fijan con 1 gota de glicerina-lugol en 1
gota y se cubre con laminilla evitando que líquido salga de los bordes
› Se observará al microscopio y se preservarán sellando el portaobjetos con esmalte
transparente para evitar la desecación de la muestra.
› Se rotularán las placas preservadas con fecha, origen de la muestra y método de
fijación.

Los estudiantes deberán incluir los resultados en la siguiente tabla y de acuerdo al
porcentaje de afinidad, establecer la especie o grupo taxonómico con mayor probabilidad
o mayor índice de afinidad.
Realizará esquemas de las observaciones de microorganismos en fresco y la observación
con lugol, en aumentos de 40X y 100X, si es del caso. Deberán señalar las estructuras
morfológicas externas e internas observables. En el informe deberá incluir la fuente
bibliográfica de atlas de identificación. La Tabla 8.2 es una orientación para el registro de
los datos:
TABLA 8.2. Resultados registrados y tabulados
Característica Morfotipos y características de protozoos

morfológica 1 2 3 4 5 6 7 8
Cilios
Flagelos
Quistes
Otra
POSIBLE ESPECIE
≥ 80% de afinidad
8.6 BIBLIOGRAFÍA
Álvarez AR. Los protozoos. Características generales y su rol como agentes patógenos.
Cátedra de Patología General y Anatomía Patológica Facultad de Ciencias
Veterinarias, UNLPam. Ciencia Veterinaria. 2006; 8(1): p-p. ISSN: 1515-1883

2018
Barnes R. Zoología de los invertebrados. Interamericana, México. 1985; pp 13-77 ISBN
968-25-0815-0
Cairns J, Ruthven JA. A test of the cosmopolitan distribution of fresh-water protozoans.
Villée C. Biología. México D. F. Editorial Interamericana. 1999. 200-201pp
Yaeger RG. Protozoa: structure, classification, growth, and development. In: Tropical
Medicine and Parasitology. Heyneman, R. and Goldsmith, R. (Eds.). 1989.
Appleton and Lange. California. USA.

2018
“VIGILADA
MINIEDUCACIÓN”

Preparación de medios de cultivos
Agua Microorganismo
Glicerina,
Cubreobjetos,
Microcultivo proveniente de resina o
Observación
sistema de biofloc, charca, lago, Incubación esmalte
y recuento
canal con hojarasca, etc Cubreobjetos +
aceite de
inmersión
Ingreso de materiales Azul de metileno,

lugol
Residuo (no se genera) Residuo Residuo

biológico 1 biológico 2

TIPO DE CAREACTERISTICAS CLASIFICACIÓN ETIQUETEADO DE CODIGO

RESIDUOS PELIGROSIDAD SGA SEGÚN DECRETO TRANSPORTE UN
Residuo 1 Nocivo N. A 2821

• En esta experiencia se generó un residuo.
• Residuo1: Será depositado en bidón R12
• Residuo2: Será depositado en bidón R10

2018
9 ECOLOGÍA MICROBIANA DEL SUELO - AGUA: COLUMNA DE
WINOGRADSKY
9.1 INTRODUCCIÓN
A diferencia de los estudios realizados por Luis Pasteur y Roberto Koch sobre cultivos
puros, dos famosos microbiólogos: Sergei N. Winogradsky (1856-1953) y Martinus
Willem Beijerinck (1851-1931), fueron los primeros en estudiar las relaciones entre
diferentes tipos de microorganismos que conviven en un mismo hábitat y cuyas
poblaciones se mezclan.
En este trabajo práctico, se enfoca en la utilización del Nitrógeno y del azufre por los
distintos microorganismos, pero realizando pequeñas modificaciones se pueden estudiar
ciclos equivalentes para el carbono y otros elementos.
9.2 OBJETIVOS
9.2.1 Objetivos Educativos
Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de comprender los procesos en la sucesión
de la comunidad microbiana y biofilm en estanques en tierra y en el sistema de recirculación de
biofloc. Aplicar los conocimientos y habilidades adquiridas en los métodos microbiológicos, en el
estudio de ecología microbiana
9.2.2 Objetivos instructivos

- Identificar las variaciones en las características físicas y colorimétricas de la sucesión
microbiana en la columna de Winogradsky en el tiempo.
- Determinar las diferencias morfológicas de las colonias bacterianas que crecen en el
medio natural (biopelículas -biofilms-), versus en medios artificiales.
- Determinar la presencia de grupos funcionales de microorganismos presentes en los
estanques piscícolas en la interface suelo-agua y en sistema de recirculación de biofloc.
- Determinar la abundancia general y de los grupos funcionales de la columna Winogradsky
9.3 MARCO TEÓRICO

Sergei N. Winogradsky (1856-1953) y Martinus Willem Beijerinck (1851-1931), fueron
los primeros científicos en estudiar las relaciones entre diferentes tipos de
microorganismos que conviven en un mismo habitat y cuyas poblaciones se mezclan.
Una demostración simple de laboratorio - la columna de Winogradsky- ilustra cómo
diferentes microorganismos interactúan entre sí, de forma tal que la actividad metabólica
de un microorganismo posibilita el crecimiento de otros y viceversa. Estas columnas, que
llevan el nombre del microbiólogo ruso que las utilizó por primera vez, son sistemas
completos autoreciclables, puestos en marcha solamente por energía lumínica.

2018
“VIGILADA
MINIEDUCACIÓN”
Inicialmente, todos los microorganismos están presentes en muy baja proporción, pero
cuando la columna se incuba por 2 o 3 meses, los distintos tipos de microorganismos
proliferan y ocupan distintas zonas en donde las condiciones ambientales favorecen sus
actividades específicas.
La columna de Winogradsky permite observar cómo los microorganismos interactúan
entre sí en el mismo nicho biológico, de acuerdo a sus tolerancias ambientales y sus
requerimientos de carbono y energía. La columna permite observar cómo los elementos
minerales son reciclados de manera análoga a como ocurre en los ambientes naturales.
9.3.1 Observación macroscópica y colorimétrica de la Columna de Winogradsky

Como se presenta en la figura 9.1, la distribución espacial de las diferentes poblaciones
microbianas dependerá de las condiciones ambientales y la disponibilidad de nutrientes
en la columna de lodos.
ZONA Capa de agua verde Diatomeas,

transparente
AERÓBICA Cianobacterias
O2
Algas y
Color claro microorganismos
aerobios que oxidan el
Color azufre: Beggiotoa,
herrumbre Trriothrix, Thiobacillus
Fotoheterótrofos
Rhodospirillum,
Rhodopseudomo
Zona
ZONA Púrpura/roji Bacteria púrpura
MICROAERÓFILA za
del azufre
Chromatium
Zona verde Bacteria verde del
azufre
Chromatium
H2S
Difusión Desulfovibrio
ZONA
ANAERÓBICA Zona
anaerobica Clostridium
H S Color !
Figura 9.1. La columna ideal de Winogradsky representando la distribución de las poblaciones en cada uno
de los estratos:

2018
› Muestra de barro de un lago, pantano o estanque (aproximadamente 1000 –1500 gr de
sedimento superficial o subsuperficial).
› Recipiente alto de paredes trasparentes y rectas (botellas plásticas o probetas de vidrio.
› Tapón de goma o cobertura plástica.
› Pipetas de vidrio, portaobjetos, cubreobjetos, cajas de Petri.
› Medios de cultivos de enriquecimiento, selectivos y diferenciales, colorantes,
reactivos para bacterias hetero-organotróficas
› Cajas de Petri con Agar-agar
› Lámparas o fuente de luz
› Medio de cultivo para nitrobacterias
› Medio de cultivo para bacterias anaeróbicas
› Medio de cultivo para organismos sulfitorreductoras
› Medio de cultivo para hongos (Sabouraud)
› Papel de filtro o en su defecto papel de diario finamente cortado.
› 5 gr de cada una de las siguientes sales: CaCO3, CaSO4, CaHPO4.
› Muestra agua del sistema de biofloc, (aproximadamente 100 –150 gr de sedimento
superficial o subsuperficial).
9.4.1 Preparación del medio de cultivo para microorganismos fotosintéticos

La tabla 9.1 contiene los nutrientes requeridos para preparar el medio de enriquecimiento
de microorganismos autotróficas.
TABLA 9.1: Medios de enriquecimiento y condiciones de cultivo para aislar las especies representativas
de uno o más grupos fotosintéticos:
ORGANISMOS A SER FUENTE DE C
SALES INORGÁNICAS ATMÓSFERA PH
ENRIQUECIDOS ORGÁNICA
Bacterias verde aerobia o aerobia +
ninguna ninguna 6,0 - 8,0
azuladas 5%CO2
NH4Cl: 1,0
Bacterias verdes del
ninguna Na2S.9H2O: 2,0 ninguna 7,5
azufre
NaHCO3: 5,0
NH4Cl: 1,0
Bacterias púrpuras del
ninguna Na2S.9H2O: 1,0 ninguna 8,0 - 8,5
azufre
NaHCO3: 5,0
malato de sodio: 5,0
Bacterias púrpuras NH4Cl: 1,0 ninguna 7,0 - 7,5
extracto de levadura: 0,5
9.4.2 Preparación del medio de cultivo para microorganismos heterotróficos

Las tablas 9.2 y 9.3 contienen la fórmula para preparar medios de enriquecimiento de
microorganismos litotróficos.

2018
“VIGILADA
MINIEDUCACIÓN”
TABLA 9.2 Medio de cultivo para la columna de Winogradsky

COMPONENTE NOMBRE CANTIDAD FUNCIÓN DEL COMPONENTE
Sucrose 10.0 g C y fuente de energía
K2HPO4 Fosfato monoacido de potasio. 2.5 g buffer pH; fuente de P y K
KH2PO4. Fosfato diácido de potasio
KH2PO4 Fosfato de potasio 2.5 g buffer pH; fuente de P y K
(NH4)2HPO4 Fosfato monoamónico Fosfato de 1.0 g buffer pH; fuente de N y P
amonio, monobásico; Fosfato diácido
de amonio
MgSO4 7H2O Sulfato de Magnesio cristalizado 0.20 g fuente de S y Mg++
FeSO4 7H2O Sulfato Ferroso cristal 0.01 g fuente de Fe++
MnSO4 H2O Sulfato de magnesio mono 0.007 g fuente de Mn++
agua 985 ml
pH 7.0
TABLA 9.3. Otra fórmula para el medio basal para la columna de Winogradsky
COMPONENTE NOMBRE CANTIDAD FUNCIÓN DEL COMPONENTE
K2HPO4 Fosfato monoacido de potasio. 2.5 g buffer pH; fuente de P y K
KH2PO4. Fosfato diácido de potasio
FeSO4 7H2O Sulfato Ferroso cristal 0.01 g fuente de Fe++
MnCl2.4H2O Clururo de manganeso 0,002 g fuente de Mn
tetrahidratado
CaCl2 Carbinato cálcico 0,02 g fuente de Ca
NaMoO4.2H2O Molibdato de sodio dihidratado 0,001 g fuente de Mo
NaCl Cloruro de sodio 0,5 g fuente de Na
agua 985 ml
pH 7.0
La concentración de los componentes de los medios se expresa en gr/l.
› Medio ambiente: iluminación constante y 25 - 30 °C.

› Las técnicas de coloración y las pruebas bioquímicas están detalladas en las guías
correspondientes a esos temas.

2018
9.4.3 Preparación de la columna de Winogradsky (semana 0)
› Preparar una botella de gaseosa o de polipropileno limpia de
volumen 1,5 a 2 L, y separar la parte estrecha superior para que sirva
de tapón.
› Tomar una muestra de lodo de estanques y homogenizar
suficientemente (retirar el exceso de agua), mezclarlo con las sales y
papel finamente cortado
› Marcar el nivel de agua, para controlar la evaporación
› Cubrir con el extremo superior de la botella o con papel de aluminio
y una banda de caucho
› Incubar a temperatura ambiente cerca de una ventana para que
reciba una adecuada cantidad de luz, pero no excesiva
› Revisar y registrar cada semana los cambios: con fotos y
descripciones. No dejar que la botella quede sin agua en la superficie
(reponer con agua destilada esterilizada)
Figura 9.2. Botella con lodo de estanque
9.4.4 Preparación de las láminas portaobjetos (semana 4, 8 y 12)

› Efectuar incisiones en la botella en posición horizontal e introducir sendos
portaobjetos en diferentes sitios de la botella, como se ilustra en la figura 1, y dejar
incubando por 5 a 7 días. Cubrir con película de plástico, como se ilustra en la fig. 20.
› Al cabo del período de incubación a los intervalos prefijados (semanas 4, 8 y 12)
remover los portaobjetos para observar las características de las colonias adheridas a
las placas de vidrio.
Figura 9.3. Método de inserción de las laminillas portaobjetos en la botella con lodo y la secuencia semanal
del retiro.
9.4.5 Análisis cualitativo de las láminas portaobjetos (semana 1, 4, 8 y 12)

› Mitad de la superficie intacta del portaobjetos debe ser dedicada a observar los
microorganismos en fresco (sin teñir y con cubreobjetos) para determinar la motilidad
y características in vivo. Realizar esquemas y realizar registros fotográficos (fig. 9.4)
› La otra mitad de la superficie debe fijarse en una solución de ácido acético al 40%

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“VIGILADA
MINIEDUCACIÓN”
(v/v).
› Teñir con coloración de Rosa de Bengala (preferiblemente) durante 3 a 5 minutos y
sin que se seque, cubrir con una laminilla cubreobjetos. Puede usar Lugol, Azul de
metileno ó Giemsa para efectuar las observaciones en 40 y en objetivo de inmersión
(100X).
Figura 9.4. Observación de los microorganismos en fresco y con tinción

› Llevar un registro de las observaciones en los períodos de tiempo estipulados; Cuando
la fijación de las biopelículas se realiza directamente en el medio natural, las técnicas
de fijación y coloración microscópicas utilizadas deberán para la caracterización de
bacterias, algas, protozoarios e invertebrados
Se prefieren los preparados frescos sin colorear especialmente si se está muestreando la
zona aeróbica superior, donde se encuentran con mayor probabilidad algas y
cianobacterias.
9.4.6 Análisis cualitativo de microorganismos en medio artificial (semana 1, 4, 8 y

12)
› Realizar un frotis con hisopo estéril de una de las superficies de la laminilla y sembrar
en los siguientes medios:
- Agar cuentagérmenes por el método de agotamiento en superficie.
- Agar papa y caldo para Nitrobacterias,
- Agar para anaerobios e incubar en cámara de anaerobiosis
- Medio para bacterias sulfitorreductoras
- Agar Saboraud
› Incubar a temperatura ambiente (25 a 28ºC) por 48 horas
› Al cabo del período de incubación, realizar registros fotográficos y describir las
características de las colonias en las diferentes semanas
› Realizar tinción de Gram para caracterizar las bacterias
9.4.7 Análisis cuantitativo de las siembras en medio artificial (semana 8 y 12)

› Tomar 1 gramo de lodo de cada zona de la botella y disolver en agua peptonada al
0,89% hasta llevar a 100 ml. Realizar diluciones hasta 10-5, en tubos con 9 ml de agua
peptonada. Asegurarse de homogenizar muy bien el preparado para reducir el error
metodológico
› Sembrar en diferentes medios de cultivo (0,1 ml para cada caja de Petri) mediante el
método de placa vertida.

2018
› Tres (3) de las diluciones preparadas son inoculadas en los diferentes tratamientos:
Agar-Agar, agar Nutritivo, agar Sabouraud, Agar selectivo para Nitrobacterias y
medio selectivo para bacterias sulfitorreductoras
› Repita el procedimiento para siembras en ambiente anaeróbicos
› Repita el procedimiento utilizando agar-agar y exponer a la luz para permitir el
desarrollo de bacterias autotróficas.
1,0 ml
1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Muestra lodo 1:100 w/v
0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
Figura 9.5. Preparación de las diluciones para el recuento de Unidades Formadoras de Colonia por mililitro
(UFC/ml)

Registrar los datos en las siguientes tablas para organizar la información y realizar el
análisis de los resultados
9.5.1 Registro y Tabulación de la información

Describir las características de las colonias a partir de los portaobjetos observados
TABLA 9.4. Análisis cualitativo de microorganismos en medio natural (para cada semana 8 y 12)

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Origen de la muestra:
Semana: ____ COLO COLO COLO COLO COLO COLO Col
Forma
Fecha: _____ NIA 1 NIA 2 NIA 3 NIA 4 NIA 5 NIA n GRAM
Bacterias
Color
Tamaño
Forma
Estructura
Borde
Motilidad
Otra
TABLA 9.5. Análisis cualitativo de microorganismos en medio artificial (para cada semana 8 y 12)
Origen de la muestra: _______________________________________________________

Semana: ______ COLO COLO COLO COLO COLO COLO Col
Forma
Fecha _______ NIA 1 NIA 2 NIA 3 NIA 4 NIA 5 NIA n GRAM
Color
Tamaño
Forma
Elevación
Borde
Textura
Carácter óptico
Olor
Otra
TABLA 9.6 Dise.ño del muestreo cuantitativo con diferentes tratamientos
Origen de la muestra: ___________________________ Semana: _____________. Fecha: ________________

TRATAMIENTOS Dilución Dilución Dilución Dilución Dilución
Rép UFC/ml
diferentes medios 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
1
Agar – Agar (+ LUZ) 2
3
1
Agar Nutritivo 2
3
1
Agar Sabouraud 2
3
1
Agar Nitrobacterias 2
3
1
Agar Sulfitorreductoras 2
3
Completar las tablas con la información y elaborar esquemas y realizar fotos

2018
9.5.2 Cuestionario
1. Inserte en este informe las fotos de la botella de Winogradsky en lapso de cada 4
semanas como en el dibujo, y describa su evolución (trate de mantener la escala entre
las botellas)
2. ¿Cuáles fueron los cambios más significativos en la botella durante las semanas de
incubación? Describa en cada semana como aparece en la siguiente escala:
3. ¿Cuáles son los grupos funcionales que predominaron en el tercio superior de la
botella? ¿A qué cree que se debe esta situación?
4. ¿Cuáles son los grupos funcionales que predominaron en el tercio intermedio de la
5. ¿Cuáles son los grupos funcionales que predominaron en el tercio inferior de la
6. Con respecto a los portaobjetos, ¿observó alguna diferencia la cobertura en alguna de
las tres capas? en cuál de las capas?
7. Al observar los portaobjetos inoculados en la columna de Winogradsky, e incubados
por 72 horas, ¿presentaron diferencias en las formas y cobertura de las colonias
celulares en las tres capas?
TABLA 9.7. Esquema de registro de las observaciones semanalmente
Semana 0 Semana 4 Semana 8 Semana 12
Superficie:
Intermedio:
Fondo:
Una vez sembradas las bacterias de cada una de las tres capas en la botella
(superior, media e inferior, conteste:
8. Inserte las fotos de los portaobjetos con coloración de Gram en la siguiente retícula

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MINIEDUCACIÓN”
9. ¿Qué puede concluir de este proyecto? ¿Qué implicaciones tiene estos resultados en
los sistemas de cultivo en tierra?
TABLA 9.8. Esquema de registro de las observaciones en las placas portaobjetos.
Superficie Intermedio Fondo
Cobertura
9.6 BIBLIOGRAFÍA
Brock TD, Madigan MT. Microbiología. Sexta edición. Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 1993.
Seeley HW JR, Vandemark PJ, Lee JI. Microbes in action. A Laboratory Manual of Microbiology. W. H.
Freeman and Company New York. Fourth Edition. 1991.
Tortora GJ, Funke BR, Case CL.: Introducción a la Microbiología. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza,
España. 1993.
Vullo D, Wachsman M, Alche L. Microbiología en Práctica. Manual de técnicas de laboratorio para la
enseñanza de Microbiología básica y aplicada. Primera edición Editorial Atlante S.R.L.,
Buenos Aires, 2000.

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Preparación de la Columna de Winogradsky
Agua Lodo proveniente de

Microorganismo
estanques
Glicerina,
Cubreobjetos,
resina o
Microelementos (cantidades Observación
Incubación esmalte
traza) y recuento
Cubreobjetos +
aceite de
inmersión
Ingreso de materiales Azul de metileno,

lugol
Residuo (no se genera) Residuo Residuo

biológico 1 biológico 2


Aislamiento de microorganismos a partir de la columna de Winogradsky
Preparación de medio litotróficos
Crecimientos
Muestra de lodo Microorganismos
bacterianos
Preparar medio
inocular incubar Observar
heterotrófico
Residuo 1
Preparación de medio organotróficos Residuo 2

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Prueba 1 – Agar -Agar (autotróficos fotosintéticos)
Muestra Cambio en
problema el medio
Incubar Registro de
Caja de Petri
Luz Observar la Residuo a
con agar agar radiante observación
Prueba 2 – Agar nutritivo o para anaerobios
Muestra Cambio en
problema el medio
Cajas de Petri Registro de

Incubar en
con agar Observar la Residuo b
anaerobiosis
Nutritivo observación
Prueba 3 – Agar bismuto sulfito o medio de SIM
Muestra Cambio en
problema el medio
Tubos o cajas Registro de

con agar Incubar Observar la Residuo c
bismutosulfito observación

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Prueba 4 – Agar Sabouraud
Muestra Cambio en
problema el medio
Cajas de Petri Registro de

con agar Incubar Observar la Residuo d
Sabouraud observación
Residuo
Residuo 2. Medios de cultivo para organotróficos

Residuo 2 (a): Agar agar (20 grs para 150 ml de agua destilada)
Residuo 2 (b): Agar nutitivo (20 grs para 80 ml de agua destilada)
Residuo 2 (c): Bismuto sulfito o Medio SIM (10 grs para 50 ml de agua destilada)
Residuo 2 (d): Agar Sabouraud (10 grs para 40 ml de agua destilada)
Todo esto se prepara dependiendo el número de estudiantes.
TIPO DE CAREACTERISTICAS CLASIFICACIÓN ETIQUETEADO

CODIGO UN
RESIDUOS PELIGROSIDAD SGA SEGÚN DECRETO DE TRANSPORTE
Residuo 1 Nocivo N.A 2014
Residuo 2
N. A N. A N. A N. A
a,b,c,d,d

En esta experiencia se generaron cuatro residuos
Residuo será depositado en el bidón R11
Residuo 2 Biológico: serán desinfectados y depositados en bolsas rojas y
entregados a bioresiduos.

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10 CALIDAD BACTERIOLÓGICA DEL AGUA, TEJIDO DE PECES Y

MARISCOS
10.1 INTRODUCCIÓN
En el agua pueden encontrarse una gran variedad de microorganismos, los cuales afectan
en mayor o menor medida a la potabilidad del agua y a sus características organolépticas.
Además de la flora normal (Bacillus, Pseudomonas, etc.), en el agua pueden existir
microorganismos contaminantes. Una de las fuentes principales de contaminación son las
aguas residuales, las cuales suelen contener restos de heces que pueden portar
microorganismos patógenos.
Aparte del problema de transmisión de enfermedades, la contaminación del agua también
acarrea otras consecuencias. Por ejemplo, la degradación biológica por los
microorganismos de grandes cantidades de residuos orgánicos vertidos al agua hace
disminuir rápidamente el oxígeno existente, creando un ambiente desprovisto de toda
forma de vida que no sea anaeróbica: mueren los peces, disminuye la vida vegetal y se
produce el hedor característico debido a las actividades de los microorganismos
anaerobios.
En el sistema acuícola, la presencia de Coliformes no tiene las mismas implicaciones que
en los humanos, no obstante acarrea otro tipo de problemas, básicamente en lo relacionado
con la alteración del equilibrio amonio-nitrito-nitrato, ya que se ha comprobado que
bacterias como E. coli en ausencia o bajas concentraciones de oxígeno tiene la capacidad
mediante vía anaerobia reducir el nitrato de nuevo a nitrito llevando al cultivo a una alerta
de calidad del agua. De otro lado, el incremento de las concentraciones de Coliformes en
el agua de manera permanente tiende a incrementar en el músculo del pez la carga
bacteriana superior a los niveles permisibles en el procesamiento post cosecha.
10.2 OBJETIVOS
10.2.1 Objetivos instructivos
Promover en el estudiante las habilidades necesarias para el proceso de determinación de
la calidad bacteriológica del agua, entendiendo el porqué de cada procedimiento e
interpretar los resultados adecuadamente de acuerdo con cada circunstancia
10.2.2 Objetivos Educativos

- Determinar la cantidad de coliformes totales y fecales en las muestras de agua de
diferentes ambientes mediante el método de fermentación múltiple
- Determinar la presencia de bacterias patógenas en estas muestras
- Evaluar la calidad de las muestras de agua de los diferentes ambientes estudiados

2018
10.3 MARCO TEÓRICO
10.3.1 Bacterias Coliformes y su sistema de medición (Colimetría)
Son bacterias de morfología bacilar, Gram negativas, aerobias o anaerobias facultativas,
oxidasa negativas, no esporógenas y capaces de fermentar la lactosa con producción de
ácido y gas a 37°C en un tiempo máximo de 48 horas. Las bacterias coliformes de origen
fecal se incluyen dentro de las bacterias entéricas o "enterobacterias" y se caracterizan por
habitar el tracto gastrointestinal del hombre y otros animales. Este grupo incluye los
géneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter. Las heces pueden ser
vehículos de transmisión de otras bacterias no coliformes que son patógenas como
Salmonella, Proteus y Shigella, algunas de cuyas especies causan infecciones intestinales
como la fiebre tifoidea y la disentería bacilar. Ya que los microorganismos patógenos son
muy sensibles y se encuentran en bajas concentraciones se toma como indicador de
contaminación fecal la presencia en las aguas de los géneros arriba indicados y
principalmente de Escherichia coli.
Para la determinación de su presencia, se realizan dos pruebas: prueba presuntiva y prueba
confirmativa; el ensayo se considera positivo si dan positivas ambas pruebas. Para
poblaciones humanas, la determinación de Coliformes en el agua debe hacerse con una
frecuencia y determinado número de muestras de acuerdo con el tamaño de la población.
La legislación colombiana ha establecido mediante en el capítulo IV del Decreto 1594 de
1978 los criterios para control de la contaminación hídrica, del ordenamiento y su
destinación de los recursos: A continuación presentamos un resumen de esta normativa,
considerando solamente lo referente a la calidad bacteriológica del agua, como sigue:
En el Artículo 38 se definen los criterios de calidad bacteriológica admisibles para la
destinación del recurso para consumo humano y doméstico, e indican que para su
potabilización se requiere solamente tratamiento convencional, si los niveles son:
Coliformes totales (NMP): 20.000 microorganismos/100 ml
Coliformes fecales (NMP): 2.000 microorganismos/100 ml
El Art. 39, señala los criterios de calidad admisibles para la destinación del recurso para
consumo humano y doméstico, e indican que para su potabilización se requiere solo
desinfección, si:
Coliformes totales (NMP) hasta1.000 microorganismos/100 ml
El Art. 40 define los límites permisibles para uso agrícola, estableciendo que el NMP de
Coliformes totales no deberá exceder de 5.000 cuando se use el recurso para riego de
frutas que se consuman sin quitar la cáscara y para hortalizas de tallo corto.
El NMP de Coliformes fecales no deberá exceder 1.000 cuando se use el recurso para el
mismo fin del literal anterior.

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“VIGILADA
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En el Artículo 41: se exponen los criterios de calidad admisibles para la destinación del
recurso para fines recreativos de contacto primario (baño, piscinas). Con respecto a la
carga de Coliformes define:
Coliformes fecales (NMP) 200 microorganismos/100 ml
Coliformes totales (NMP) 1.000 microorganismos/100 ml.
Para contacto secundario (pesca, navegación) se establecen los límites de Coliformes
totales (NMP) 5.000 microorganismos/100 ml
Artículo 45: Los criterios de calidad admisibles para la destinación del recurso para
preservación de flora y fauna, en aguas dulces, frías o cálidas y en aguas marinas o
estuarinas son los siguientes:
Artículo 46: Corresponde a la EMAR (entidades encargadas del manejo y administración
del recurso) la realización de bioensayos que permitan establecer los valores de la
concentración letal media en 96 horas (CL9650) de los parámetros contemplados en el
artículo anterior, como también el establecimiento del NMP de coliformes totales para
acuicultura y los valores para temperaturas según las diversas situaciones.
10.3.2 Estándares de calidad del agua para la acuicultura a nivel internacional:

Estudios realizados sobre la utilización de aguas residuales para uso en la acuicultura
(WHO; 1989) han demostrado que la estimación del período de retención en las lagunas
de estabilización sirve como una herramienta eficiente para el diseño y operación de
sistemas que involucren el uso de efluentes en actividades como la acuicultura, donde la
principal limitante es el nivel de bacterias permisibles.
Se ha demostrado que una exposición prolongada de los peces a las aguas con niveles de
Coliformes fecales superiores a 1x105 NMP/100 ml pueden originar el ingreso de
bacterias (no necesariamente patógenas) al músculo del pez. Así mismo, que observa que
en los mismos estanques, es posible la depuración de estos peces contaminados si las
concentraciones de Coliformes retornan a los niveles permisibles durante un período
mínimo de un mes.
Sin embargo, podrían existir imprevistos que determinen cambios drásticos, aunque
temporales, de la calidad del agua. Ante estas circunstancias, se recomienda verificar que
el nivel de bacterias en el músculo no exceda de 50 UFC por gramo. Si ese fuera el
caso, el período de cultivo debe extenderse por lo menos un mes después de ocurrido el
imprevisto, con el propósito de lograr una auto-depuración de los peces.
Se determinó que la calidad sanitaria de los peces se mantiene óptima mientras en los
estanques se mantienen niveles Coliformes fecales de hasta 1x104/100 ml y también se
ha encontrado una disminución de por lo menos un ciclo logarítmico entre la carga de
Coliformes fecales del efluente del sistema de tratamiento y los estanques de acuicultura.
Por lo tanto, se considera que el nivel máximo de Coliformes fecales en el efluente
debe ser de 1x105/100 ml. Este límite estaría un logaritmo por encima del recomendado

2018
por la Organización Mundial de la Salud (WHO, 1989), ya que correspondería a un valor
de 1x104 para los estanques de peces.
En principio, la calidad sanitaria de los peces estaría asegurada si la colimetría del efluente
del sistema de tratamiento se mantiene por debajo de los límites fijados, por lo que un
monitoreo debe orientarse en ese sentido. En el caso de que la calidad del agua se
mantenga adecuada durante el período del cultivo, el control de calidad sanitaria de los
peces cosechados podría quedar supeditado a las exigencias de las entidades oficiales que
certifican la aptitud de los productos pesqueros para consumo humano directo.
El programa de monitoreo de un sistema de tratamiento estará orientado básicamente a
garantizar la calidad sanitaria para el uso de los efluentes en acuicultura. Por lo tanto, se
considera incluir como mínimo las mediciones diarias de caudal y temperatura del agua
(máxima y mínima), y mensuales de DBO50 y Coliformes fecales, tanto en el afluente
como en el efluente del sistema.

La calidad del agua se determina principalmente por análisis bacteriológicos. Las pruebas
que se realizarán son: Colimetría y Clostridiometría
Se tomarán muestras de 3 estaciones con dos réplicas c/u, como sigue:
Muestra 1 (Río Sinú), Muestra 2 (Agua del acueducto), Muestra 3 (Estanque con cultivo
de peces). Cada grupo de trabajo se ocupará de una muestra
Materiales por muestreo
› Estufa incubadora a 37°C 1
› Estufa incubadora a 44,5 ± 0,5°C 1
› Baño serológico 1
› Botellas estériles de cierre hermético (250 cc) 1
› Pipetas estériles (de 1 y 10 ml) 5
Medios de cultivo para 6 muestras (multiplicar por 6)
› 12 tubos con 9 ml de Caldo BRILA y campana Durham
› 99 ml de agua peptonada al 0,8%
› 4 tubos con 9 ml de agua peptonada al 0,8% para 20 diluciones
› 1 cajas de Petri con agar nutritivo (AN)
› 1 cajas de Petri con agar EMB (Eosina Azul de Metileno)
› 1 cajas de Petri con agar TSBS (Tiosulfato Sucrosa Bilis)
› Tabla estadística de “Número Más Probable” (NMP)

2018
“VIGILADA
MINIEDUCACIÓN”
10.4.1 Colimetría
10.4.1.1 Prueba presuntiva:
El agua problema se siembra en el medio denominado caldo lactosado bilis verde brillante
(BRILA) que permite el enriquecimiento e identificación de bacterias coliformes. La
lactosa existente es fermentada produciendo ácido y gas que se detecta en la campana de
Durham. La bilis inhibe el crecimiento de cocos Gram positivos y bacilos formadores de
endosporas y no inhibe a los bacilos entéricos Gram negativos ni otros ambientales (ej.
Pseudomonas). Es un medio de enriquecimiento y selectivo.
Procedimiento
› Preparación de diluciones:
› Dependiendo de la presunción o el desconocimiento de la carga bacteriana, se
procederá a elegir el máximo nivel de dilución (a mayor concentración de coliformes,
mayor dilución)
› Para este ejercicio procederemos a efectuar 4 niveles de dilución, para elegir
finalmente las tres más representativas
› Siga cuidadosamente las instrucciones de asepsia, y orden en cada paso del
procedimiento para evitar errores de manipulación y llevar a falsos negativos o falsos
positivos. Recuerde que sus resultados dependerás del manejo y finalmente el éxito de
la producción
› Se tendrá preparado con antelación el material para las diferentes pruebas y debe tener
en consideración que el experimento tiene una duración de al menos 72 horas
La muestra debe ser tomada preferiblemente en horas de la mañana antes que el sol altere
las condiciones del estanque. Se sumerge la botella cerrada al menos 30 cm por debajo de
la superficie, se deja que entre el agua evitando removerla mucho, se cierra la botella y
luego se sella, se rotula y se almacena hasta un máximo de 6 horas a una temperatura entre
4 y 10 ºC. NUNCA SE DEBE CONGELAR, NI DEJAR A LA INTEMPERIE, recuerde
que los microorganismos pueden replicarse cada al menos cada 15 minutos.
Si se toma la muestra de agua de un grifo, como paso previo debe flamear con un mechero
la boca del tubo, dejar salir agua de la llave al menos 1 minuto y paso seguido acercar la
botella cerca un mechero, abrir la botella y llevar a un volumen mínimo de 100 ml
› Para ambos casos debe dejarse una cámara de aire de aproximadamente el 20% de la
capacidad de la botella.
› Siembra en el laboratorio:
› Todo el material debe estar listo, estéril y los tubos con su correspondiente rótulo que
especifique: Numero de muestra y Dilución
› Si no se va a procesar la muestra de inmediato se refrigera máximo un total de 6 horas.
› Una vez preparado todo el material disponible, se procede a la dilución que dependerá
de la presunta carga bacteriana, del nivel de precisión requerida y también de la
disponibilidad de material. Existe el método de dilución con cinco réplicas, pero el
método actual más utilizado se lleva a cabo con tres diluciones logarítmicas y tres

2018
réplicas cada una, como se demuestra en el esquema a continuación.
Primer paso: si la muestra ha estado en refrigeración, permita la aclimatación por un
lapso de tiempo de 10 minutos aproximadamente
Segundo paso: homogenizar la muestra en la botella, agitando energética y verticalmente
la botella unas 25 veces (número mágico)
Tercer paso: asépticamente (con mechero) transfiera la cantidad definida 1 ml de muestra
al primer tubo de dilución, homogenice suficientemente y de ese mismo tubo transfiera 1
ml hacia el segundo tubo de dilución, procediendo del mismo modo hasta la última
dilución
En esta práctica se utilizarán cuatro diluciones logarítmicas, de las cuales serán elegidas
al final las tres más significativas. Esta dilución puede efectuarse en agua destilada
esterilizada, pero en este caso utilizaremos agua peptonada al 0,89 % para evitar el estrés
osmótico de las células. Esta dilución se efectúa con una pipeta que debe mantenerse libre
de contaminación
Figura.10.1. Diluciones en agua peptonada y en tubos con Caldo Brila y la secuencia de diluciones en base 10
› Una vez preparado las diluciones, se procede a transferir de cada tubo de dilución a
los tubos con caldo BRILA con campana DURHAM. De la primera dilución de
siembra (1/10), 1 ml a cada una de las réplicas.
Tenga en cuenta:

2018
“VIGILADA
MINIEDUCACIÓN”
- Si procede a la inoculación a partir de la menor dilución, debe cambiar de pipeta en

cada dilución para evitar errores metodológicos
- Homogenizar muy bien tanto los tubos de dilución como los de caldo brila, para
permitir un muestreo homogéneo
- Incubación: Incubar durante 24 horas a 37 ºC.
10.4.1.2 Prueba presuntiva para Coliformes totales y fecales:
Se consideran positivos para Coliformes totales cuando haya crecimiento positivo y para
Coliformes fecales aquellos en los que aparece enturbiamiento y acumulación de gas en
la campana. Los "tubos gas -" se incuban otras 24 h (fig. 10.2). La interpretación se realiza
según la tabla de “número más probable” (NMP) adjunta. Esta tabla indica el número más
probable de microorganismos presentes en 100 ml de agua (NMP), teniendo en cuenta los
tubos en que hay crecimiento, así como las diluciones y aplicando métodos estadísticos.
Figura 10.2. Pruebas presuntivas y confirmativas de la presencia de patógenos a partir de incubación a 44,5 ±
0,5 ºC, formación de gas y crecimiento en agar EMB
10.4.1.3 Prueba confirmativa

Una vez trascurrido un tiempo de 48 horas, todos los tubos que dieron positivo para
crecimiento se repican de nuevo en caldo Brila nuevamente y se incuban a 44,5 ± 0,5 ºC

2018
durante 24 horas. También se siembran en agar EMB (Eosina Azul de Metileno) para
aislar cepas verdes con brillo metálico (E. coli) o rosadas, grandes, mucoides, elevadas
(Klebsiella spp.)
Procedimiento:
› Siembra en estría en placas de EMB (medio selectivo y diferencial para coliformes) a
partir de "tubos gas+".
› Incubar a 37°C durante 24 h.
› Interpretación de los resultados:
10.4.1.4 La prueba confirmativa de la presencia de E. coli
Consiste en sembrar los microorganismos que han crecido en caldo Brila a 37°C en este
mismo medio, pero incubando a 44 ± 0,5 °C. Bacterias E. coli y Klebsiella spp. tienen la
capacidad de fermentar la lactosa en estas condiciones. Otra manera es sembrando en agar
EMB; en este medio los microorganismos fermentadores de lactosa forman colonias
características opacas y pigmentadas en rosa, azul o violeta con o sin brillo metálico (por
ejemplo, E. coli forma colonias de color verde-violeta oscuro metálico características
sobre este medio). La prueba es (+) si aparecen este tipo de colonias fermentadoras de
lactosa.
10.4.1.5 Clostridios sulfito-reductores (Clostridiometría)
Son bacterias de morfología bacilar, Gram (+), anaerobios estrictos, capaces de formar
esporas y con actividad sulfito reductora (desasimilatoria). Algunas especies de
Clostridium habitan en el tracto intestinal de animales, otras en el suelo, etc. El ensayo
consiste en contar el número de bacterias anaerobias formadoras de endosporas con
capacidad sulfito reductora en un medio que contiene sulfito sódico y una sal de hierro,
denominado medio Wilson Blair (WB). Estas colonias aparecen de color negro debido a
la formación de sulfuro ferroso por reducción del sulfito.
Materiales:
› 20 cajas con medio Wilson Blair (20 tubos de agar WB fundido),
› Asa de vidrio, mechero de alcohol y alcohol de quemar.
› Baño serológico a 80ºC
Procedimiento:
› Fundir previamente el medio Wilson-Blair 2x (WB) y mantener en baño a 60°C.
› Calentar la muestra de agua (10 ml) durante 10 minutos a 80°C, para matar formas
vegetativas e inducir la germinación. Enfriar en el grifo.
› Añadir la muestra de agua precalentada al tubo de WB 2x
› Tapar bien el tubo con algodón y con Parafilm™. Mezclar por inversión.
› Incubar a 37°C durante 24-48 horas.

2018
“VIGILADA
MINIEDUCACIÓN”
Interpretación de resultados:
Contar el nº de colonias negras existentes en la totalidad del tubo (sin tener en cuenta las
colonias puntiformes). El resultado se expresa como nº de clostridios existentes en el
volumen de agua sembrada. (Ver normas vigentes).
El agua se considera potable si los valores obtenidos en los ensayos están dentro de los
límites establecidos por la ley. Las normas legales exigen:

Inserte en este informe las fotos de la botella de Winogradsky en lapso de cada 4 semanas
como en el dibujo, y describa su evolución (trate de mantener la escala entre las botellas)
Registre los resultados en las siguientes tablas, para facilitar el análisis.
La tabla 10.1. Modelo para incluir los resultados, que deberá ser adaptada de acuerdo con
las características del muestreo, las diluciones empleadas y pruebas adicionales efectuadas
En la tabla 10.2 se presenta el Número Más Probable en 100 mililitros (NMP/100mL) de
acuerdo con el número de tubos positivos para crecimiento y/ para producción de gas.
Basado en la literatura y la revisión bibliográfica hacer las debidas conclusiones.
TABAL 10.1 Número de tubos positivos con límite de confianza del 95% (NMP/100 mL)
Muestra 1 Origen: Muestra 2 Origen: Muestra 3 Origen:
Fecha: Dilución Dilución Dilución

Diluci
Diluci
Diluci
1x10-1
1x10-2
1x10-3
1x10-4
1x10-1
1x10-2
1x10-3
1x10-4
1x10-1
1x10-2
1x10-3
1x10-4
ones
ones
o
24 h repli repli repli

ca1 ca1 ca1
repli repli repli
ca2 ca2 ca2
repli repli repli
ca3 ca3 ca3
ca1 ca1 ca1
repli repli repli
ca2 ca2 ca2
repli repli repli
ca3 ca3 ca3
ca1 ca1 ca1
repli repli repli
ca2 ca2 ca2
repli repli repli
ca3 ca3 ca3
Fac
Dil

2018
Colif Mue Mue Mue
Tot stra stra stra
1 2 3
Colif Mue Mue Mue
fec stra stra stra
1 2 3
Crec EMB EMB EMB
Crec TCB TCB TCB
S S S
Crec Cetri Cetri Cetri
mide mid m
Crec AN AN AN
TABAL 10.2. Número de tubos positivos con límite de confianza del 95% (NMP/100 mL)
3 tubos de 3 tubos de 3 tubos de Índice Límite Límite
10 ml 1 ml 0,1 ml NMP/100ml inferior superior
0 0 1 3 <0,5 9
0 1 0 3 < 0,5 13
1 0 0 4 < 0,5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 149
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 17 379
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800
Cuestionario:
1) ¿Cuáles fueron los cambios más significativos en la botella durante las semanas de

2018
“VIGILADA
MINIEDUCACIÓN”
incubación? Describa en cada semana como aparece en la siguiente escala

2) Describa la abundancia y tipos de colonia que obtuvo por enumeración de TSA.
3) ¿Cómo comparan estos organismos con los observados directamente en las laminillas?
4) ¿Qué tipos de morfología colonizan tempranamente las laminillas?
5) Al observar los portaobjetos inoculados en la columna de Winogradsky, e incubados
por 72 horas, ¿presentaron diferencias en las formas y cobertura de las colonias
celulares en las tres capas?
6) Con respecto a los portaobjetos, ¿observó alguna diferencia la cobertura en alguna de
las tres capas? en cuál de las capas?
7) ¿Quiénes predominan sobre las laminillas al final del experimento?
8) ¿Cómo comparan los resultados observados en los diferentes tratamientos?
9) ¿Cuáles son los grupos funcionales que predominaron en el tercio superior de la
10) ¿Cuáles son los grupos funcionales que predominaron en el tercio intermedio de la
11) ¿Cuáles son los grupos funcionales que predominaron en el tercio inferior de la
12) Inserte las fotos de los portaobjetos con coloración de Gram en la siguiente retícula
10.6 BIBLIOGRAFÍA
Moscoso J, León G. Uso de aguas residuales en acuicultura: Uso de Aguas Residuales
HDT 59. Hojas de divulgación técnica CEPIS. 1994. Disponible el 2009-05-08 en
URL:http://www.cepis.org.pe/bvsair/e/repindex/repi53/raa/raacap06.html#res02
WHO. Guidelines for Drinking-water Quality. Third edition. Incorporating the first and
second addenda Volume 1. World Health Organization, Geneva 2008.
Bartram J, Balance R. (Eds). Water quality monitoring: A practical guide to the design and
implementation of freshwater quality studies and monitoring programmes. WHO.
Chapman D. Water quality assessments: A guide to the use of biota, sediments and water
in environmental monitoring, 2nd ed. UNESCO, WHO and UNEP by E&FN Spon.
London.

2018
Preparación de medios de cultivos y metodología a seguir
Agua (150 mL para
Muestra problema Agar Cuentagérmenes
cada medio)
Preparar
Peptona Esterilizar Servir Utilizar Diluir Agua Sembrar Incubar
peptonada
universal 2g
Residuo 1 Observar
Preparar biológico
caldo
lactosado
VBB -Brila
Recuento
Registro de la
Continuidad del proceso información
Residuo
Residuo 2
biológico

Residuo 1 Biológico N.A N.A N.A N.A
Residuo 2 Biológico N.A N.A N.A N.A

En esta experiencia no se generó residuo químico, solo biológico, los cuales se esterilizan
y almacenan en bolsa roja y se entrega a bioresiduos.

2018
“VIGILADA
MINIEDUCACIÓN”
11 CONTROL DE MICROORGANISMOS: PRUEBAS DE SENSIBILIDAD

ANTIMICROBIANA
11.1 INTRODUCCIÓN
El uso de sustancias químicas como los desinfectantes y quimioterapéuticos han sido
utilizados durante mucho tiempo para el control de microorganismos mediante la
higienización y terapéutica de infecciones bacterianas en humanos y animales. Sin
embargo, el manejo inadecuado ha traído consigo que se desarrollen resistencias
antimicrobianas a estos productos con el subsecuente riesgo para la salud.
Es importante que, en el proceso de higienización, desinfección se realice de manera
rotativa y en la terapéutica se realicen selectivamente los quimioterapéuticos para
combatir las cepas bacterianas sensibles en la dosis adecuada para reducir el riesgo de
desarrollar resistencia antimicrobiana a otras cepas de la misma o diferente especie.
La Concentración Mínima Inhibitoria CMI, permite establecer la concentración mínima
requerida de un quimioterapéutico para inhibir el desarrollo de un determinado
microorganismo.
11.2 OBJETIVOS
11.2.1 Objetivos educativos
Adquirir las destrezas necesarias en el análisis de una prueba de sensibilidad
antimicrobiana y de CMI
11.2.2 Objetivos educativos

- Determinar la sensibilidad de E. coli, a diferentes sustancias desinfectantes
- Determinar la CMI de cuatro desinfectantes
11.3 MARCO TEÓRICO

La susceptibilidad de los microorganismos a los antibióticos se determina mediante
técnicas basadas en la dilución o difusión del antibiótico en un medio de cultivo donde
desarrolla el microorganismo en estudio.
Las técnicas de dilución en caldo y agar son utilizadas para medir la actividad de un agente
antimicrobiano frente a una cepa bacteriana y permiten determinar la concentración
inhibitoria mínima (CIM), definida como la menor concentración de antimicrobiano capaz
de inhibir el crecimiento de una bacteria específica. Este método ha sido estandarizado
por la NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards).
El método es el de Bauer y Kirby, conocido como antibiograma y se basan en la difusión
del quimioterapéutico. Este método consiste en embeber la sustancia química en discos

2018
de papel absorbente y colocarlo sobre un medio de cultivo sólido Müller-Hinton ®
inoculado con el microorganismo a evaluar. Al cabo de un período de incubación de 18 a
24 horas se mide el halo alrededor del disco donde no crecieron bacterias.
El proceso se completa midiendo el halo de inhibición a diferentes concentraciones del
antimicrobiano elegido.

11.4.1 Materiales a utilizar
› Cultivo exponencial de la cepa bacteriana a analizar.
› Agar Müller Hinton
› Cajas de Petri estériles
› Asa
› Hisópos estériles
› Pipetas de 1 ml y 10 ml estériles
› Solución fisiológica estéril
› Solución de hipoclorito al 5% para descarte de material contaminado.
› Tubos de ensayo estériles
› Escala de McFarland
› Discos de antibiograma
› Incubadora a 37 °C
› Agua oxigenada (0,5%)
› Lugol (0,5%)
› Hipoclorito de sodio (0,5%)
› Etanol (70%)
› Etanol (96%)
› Formalina (0,4%)
› Creso (0,5%)
› Amonio cuatrenario (0,5%)
11.4.2 Determinación de la sensibilidad antimicrobiana

› Sumergir discos de papel absorbente esterilizados en los diferentes desinfectantes
› Preparar placas de Petri con agar Müller Hinton (M-H) de aproximadamente 4 mm de
alto. Dejar solidificar y secar bien.
› Sembrar una cepa bacteriana en cada caja de M-H mediante el método de agotamiento
› Colocar un disco por cada desinfectante equidistantemente en la caja de Petri (máximo
6 discos) y en el medio un disco sin ningún producto (control negativo)
› Incubar 24 a 48 h a 37ºC
› Verificar y registrar el halo de inhibición

2018
“VIGILADA
MINIEDUCACIÓN”
11.4.3 Determinación de la CIM por dilución en caldo

› Se realizan diluciones al medio decrecientes del antibiótico en tubos conteniendo 1 ml
de caldo Müeller-Hinton
› Se siembra 1 mL de una suspensión bacteriana de aproximadamente 105 bacterias por
mL que equivale a una dilución 1/500 del tubo 1 de la escala de Mc Farland.
› Se realiza un control de crecimiento inoculando un caldo sin antibiótico y un control
negativo con caldo sin inocular.
› Se incuban todos los tubos a 37 °C durante 24 horas. Luego se observa turbidez
indicativa del desarrollo bacteriano.
› Se determina la CMI como aquella concentración del antibiótico contenida en el tubo
que posee la mayor dilución del mismo en la que se detecta falta de turbidez. La
mínima concentración que inhibe el crecimiento bacteriano.
› Preparar con el cultivo de la cepa a analizar, una suspensión bacteriana con solución
fisiológica estéril, ajustarla a 0,5 de la escala de McFarland.
› Sumergir un hisopo estéril en la suspensión recién preparada, escurrir el excedente de
líquido en las paredes del tubo y sembrar la placa de Petri con medio de cultivo
anteriormente preparada. Distribuir uniformemente el inóculo en toda la superficie del
agar.
› Cuando la superficie del agar este completamente seca, apoyar los discos de
antibiograma utilizando el aplicador o una pinza estéril. Asegurarse que toda la
superficie de los discos esté en contacto con el agar, una vez colocados no deberá ser
movidos, dado que el antibiótico es liberado instantáneamente cuando entra en
contacto con el agar.
› Incubar en estufa a 37 °C durante 24 horas.
› Observar y medir para cada disco el halo de inhibición del crecimiento.
› Analizar si las cepas bacterianas utilizadas son resistentes o sensibles a los antibióticos
probados, según los datos que figuran en tablas de sensibilidad a antibióticos.

Registrar los datos obtenidos y realizar tablas de comparación e imágenes observadas
11.6 BIBLIOGRAFÍA
Bauer, A., Kirby, W., Sherris, J., Turk, M. American Journal of Clinical Pathology, 45:
493-496, 1986.
Davis, D. B., Dulbecco, R., Eisen, H., Ginsberg, H., Tratado de Microbiología. capítulo 7
Salvat Editores, Tercera edición, 1984.

2018
Preparación de medio Müller-Hinton

Desinfectantes
(a, b, c, d, e, f, g, h)
(2 mL c/u) –
Agua (150 mL para
Microorganismos Discos impregnados (5
cada medio)
micro L)
Preparar Agar M-H Servir inocular Incubar a 37ºC
Observaciones
Residuo 1
Residuo
Residuo 1. Medios de cultivo y discos con desinfectantes

Residuo 1: Agar Müller-Hinton® (20 grs para 150 ml de agua destilada)
Residuo 1(a): Agua oxigenada (0,5%)
Residuo 1(b): Lugol (0,5%) (5 mL)
Residuo 1(c): Hipoclorito de sodio (0,5%) (2 mL)
Residuo 1(d): Etanol (70%) (2 mL)
Residuo 1(e): Etanol (96%) (2 mL)
Residuo 1(f): Formalina (0,4%) (2 mL)
Residuo 1(g): Creso (0,5%) (2 mL)
Residuo 1(h): Amonio cuatrenario (2 mL)
El volumen final dependiendo el número de estudiantes.

CODIGO UN
Residuo 1-
N. A N. A N. A N. A
a,b,c,d,e, f, g, h

En esta experiencia no se generó residuo químico, solo biológico, los cuales se esterilizan
y almacenan en bolsa roja y se entrega a bioresiduos.

2018
“VIGILADA
MINIEDUCACIÓN”
Preparación de prueba de Mc Farland
Microorganismos
Agua (150 mL para Discos de
diferentes
cada medio) Antibióticos
concentraciones
Servir en
Preparar Caldo M-H inocular Agar M-H
tubos
Residuo 1
Incubar a 37ºC

Observaciones
Residuo
Residuo 2
Residuo 2. Agar Müller-Hinton con antibiótico

El volumen final dependiendo el número de estudiantes.

CODIGO UN
Residuo 1 N. A N. A N. A N. A
Residuo 2 Antibióticos en traza N. A N. A N. A

En esta experiencia se generó residuo biológico, los cuales se esterilizan.
Las concentraciones de antibiótico están en escala de traza (menor 0,1 microlitros)

2018

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UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA “Comprometida

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA con el

Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD

7 RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS

7.2.2 Objetivos instructivos.

7.3 MARCO TEÓRICO

7.3.1 Hongos Pluricelulares o Mohos

72 Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD.

7.3.2 Reproducción asexual

Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD. 73

Figura 7.1. Tipos de hifas y estructuras celulares (Carrillo, 2003).

Figura 7.2 Estructura y tipos de conidióforos en Aspergillus (Carrillo, 2003)

74 Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD.

Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD. 75

Figura 7.4 Fases de reproducción asexual y sexual de zigomycetes (Carrillo, 2003)

7.3.3 Sistema de clasificación

76 Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD.

Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD. 77

78 Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD.

Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD. 79

7.3.8 Levaduras características morfológicas y fisiológicas

Figura 7.6 Ultra estructura de la levadura (Brock et al., 2010)

80 Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD.

Figura 7.7. Estructura de los Basidiomicetes (Carrillo, 2003)

Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD. 81

7.4 MATERIALES Y MÉTODOS

7.4.2 Ensamblaje de la micro cámara

Trozo de agar con

Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD. 83

7.5 RESULTADOS ESPERADOS

CARACTERÍSTICA CARACTERÍSTICAS DE CADA CEPA DE HONGOS

84 Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD.

Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD. 85

7.7 MANEJO DE RESIDUOS QUÍMICOS Y PELIGROSOS

Agua (150 mL Siembra de los

Aceite de Azul de lactofenol

Continuidad del proceso

Residuo 1: 3 gotas por placa

TIPO DE CAREACTERISTICAS CLASIFICACIÓN SEGÚN ETIQUETEADO DE CODIGO

Residuo 1 Nocivo NA 2821

Residuo 2 Nocivo N.A 3082

Tipo de tratamiento y disposición final in situ

86 Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD.

8.3 MARCO TEÓRICO

8.3.1 Sistema de clasificación

8.3.1.1 Protozoos ameboideos

88 Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD.

Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD. 89

Filo Actinopoda: Protozoos ameboides generalmente flotadores o sésiles, con

Figura 8.4. Foraminiferos: Archaias sp. (Barnes, 1984)

90 Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD.

Figura 8.6. Dinoflagelados: A) Ceratium; B) Gymnodinium; C) Glenodinium (según Pennak)

Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD. 91

Flagelados con cuatro a mas flagelos. Sin mitocondrias diferenciadas, aparato de

Figura 8.7. A) Trichomonas; B) Hexamita (Barnes, 1984)

92 Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD.

Figura 8.8. Flagelados, Euglena (Barnes, 1984)

Figura 8.9. Otros flagelados: A) Opalina, B Morfología C) Trypanosoma (Barnes, 1984)

Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD. 93

principalmente autótrofos, incluye a las algas pardas multicelulares, a algunas algas

94 Adriana Vallejo Isaza, Bióloga PhD.

Figura 8.13. A y B) Ciliados hipostomata C) Paramecium D) Suctorio (Acineta) (Barnes, 1984)

Figura 8.14. Ciliphora: Vorticella (Barnes, 1984)

Origen de la muestra: _____________________ Semana: _. Fecha: __________