Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Tesis Florencio Ramos Gómez
Tesis Florencio Ramos Gómez
Departamento de Biotecnología
TESIS
Que para obtener el grado de:
PRESENTA:
Directores de Tesis:
A mis directoras la Dra. Melina López Meyer y al Dr. Mario Rodríguez Monroy
por los consejos, orientación, sugerencias y asesoría en el trabajo. A los demás
integrantes de la comisión revisora, la Dra. Gabriela Sepúlveda Jiménez, la
Dra. Kalina Bermúdez Torres, el Dr. Luis Arturo Bello Pérez y la Dra. Perla
Osorio Díaz por los comentarios, observaciones, consejos y correcciones con
la finalidad de mejorar y reforzar este trabajo de tesis.
ÍNDICE
Página
Índice I
Índice de cuadros II
Abreviaturas V
Resumen VI
Abstract VII
1. INTRODUCCIÓN 1
2. REVISION DE LITERATURA 3
3. JUSTIFICACIÓN 15
4. OBJETIVOS 16
5. METODOLOGÍA 17
5.1 Microorganismos 17
5.2 Medios de cultivo 17
6. RESULTADO Y DISCUSIÓN 23
7. CONCLUSIÓN 34
8. LITERATURA CITADA 35
ÍNDICE DE FIGURAS
Número Página
1 Lesión causada por S. sclerotiorum. 4
2 Ciclo biológico de la enfermedad del moho blanco 5
causado por el hongo S. sclerotiorum.
3 B. subtilis, microorganismo usado para control biológico. 7
4 Ciclo de esporulación de B. subtilis 9
5 Compuestos producidos por B. subtilis: surfactina (a), 10
iturina (b) y fungicina (c).
6 B. subtilis 105 (a), y S. sclerotiorum (b). 17
7 Ensayo de antagonismo in vitro. 21
8 Crecimiento (A) y esporulación (B) de B. subtilis cepa 105 24
a nivel de matraz, evaluando los medios LB y soya.
9 Perfiles de tensión de oxígeno (TOD), durante el cultivo 26
de B. subtilis 105, en el medio LB (A) y el medio soya (B),
bajo una TOD<20% y una TOD>20%. Línea límite de
20% de TOD.
10 Crecimiento (A) y esporulación (B), de B. subtilis 105 a 27
nivel de biorreactor en medio LB, evaluando la TOD < 20
% y TOD > 20%.
11 Crecimiento (A) y esporulación (B), de B. subtilis 105 a 28
nivel de biorreactor en medio soya, evaluando la TOD <
20 % y TOD > 20%.
12 Porcentaje de inhibición micelial de S. sclerotiorum, 32
evaluando el sistema matraz, biorreactor bajo una TOD
por arriba y por abajo del 20%.
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro Página
Símbolo Significado
vv Volumen sobre volumen
vvm Volumen de aire por volumen de líquido por minuto
rpm Revoluciones por minuto
Cel Célula
LB Luria agar Broth
UFC Unidades formadoras de colonias
TOD Tensión de oxígeno disuelto
DMCT Diámetro micelial con tratamiento
DMST Diámetro micelial sin tratamiento
RESUMEN
Bacillus subtilis105 is a bacterial strain with antagonistic activity against the fungus
Sclerotinia sclerotiorum, which is a pathogen that affects agricultural crops of
commercial importance, such as common beans, potatoes and tomatoes, among
others. B. subtilis 105 grown in microbiological LB medium in Erlenmeyer flask has
shown to be an outstanding strain due to its growth and antagonistic abilities.
Then, in order to obtain mass production, it is desirable the use of a culture media
formulated with industrial components in bioreactor. Since dissolved oxygen
tension (DOT) is a determining factor for growth, sporulation, and antagonistic
activity of bacteria during its cultivation in a bioreactor, the main objective of this
work was to evaluate the effect of oxygen limitation in bioreactor and the
substitution of culture medium on the growth of B. subtilis strain 105 and its
antagonistic activity against S. sclerotiorum.
Erlenmeyer flasks and bioreactor assays using the soy medium which is
composed of low-cost components [protein from soy (10 g L- 1), extract of yeast (5
g L-1) and sodium chloride (5 g L-1)], showed favorable results for growth and
sporulation of B. subtilis strain 105. So, this growth medium is considered suitable
to replace the microbiological LB medium. Additionally, using the soy medium in
bioreactor and under a condition without oxygen limitation (DOT > 20%), bacterial
growth reached 218 x 106 cfu mL-1 and 21.4 ±3.63 % sporulation; whereas in
condition of oxygen limitation (DOT < 20%), growth was reduced to 43% and
sporulation to 15 ± 2.14 %. On the other hand, the culture broth obtained under
DOT < 20% showed and stronger effect on S. sclerotium (41.4 ± 2.8 % inhibition),
compared to the effect of the broth obtained under DOT > 20% (29.5 ± 7.3 %
inhibition). This suggests that oxygen limitation during the cultivation of B. subtilis
strain 105 in bioreactor promotes the production of active compounds that
enhance the antagonistic activity against the fungus.
I. INTRODUCCIÓN
Actualmente existe demanda por cultivos comestibles de calidad, así como libres de
pesticidas de origen químico, ya que estos últimos puedan llegar a ser peligrosos
para la salud humana. En México, el frijol es un cultivo agrícola de importancia
económica y social, por lo que existe el interés de adoptar estrategias para reducir o
reemplazar parcial o completamente los agroquímicos utilizados para la prevención y
control de algunas de las enfermedades que lo atacan (Erental et al., 2008; SIEA-
SAGARPA, 2011).
Reino Fungi
Filum Ascomycotina
Clase Ascomycetes
Orden Helioteliales
Familia Sclerotiniaceae
Género Sclerotinia
Especie S. sclerotiorum
Liberación de
Germinación de
las ascosporas
ascosporas en
las flores
Esclerocios
Hongo Formación de los
colonizando apotecios en la
flores superficie del suelo
Planta de frijol
marchita Germinación en
el suelo
Formación de
esclerocios en
vainas y tallos
Figura 2. Ciclo biológico de la enfermedad del moho blanco causado por el hongo S.
sclerotiorum. (Campa et al., 2009)
2.3 Tratamientos de control del moho blanco
B. subtilis fue considerado un aerobio estricto, pero se demostró que puede crecer
bajo condiciones anaeróbicas. B. subtilis puede crecer anaeróbicamente mediante la
reducción de nitratos o nitritos en amonio, mediante la utilización de la enzima nitrato
reductasa, codificada por el gen narGHJI. El mecanismo de regulación de esta
enzima se encuentra mediado por la condición de oxígeno generada dentro de un
medio de cultivo en fermentación. En ausencia de oxígeno, el nitrato o nitrito
funcionan como un aceptores de electrones en el proceso respiratorio de B. subtilis
(Nakano et al., 1997; Carvalho y Lacerda, 2010).
a b c
Figura 5. Compuestos producidos por B. subtilis: surfactina (a), iturina (b) y fungicina
(c).
Los biorreactores están equipados con varios sensores para la medición y el control
de la temperatura, de la velocidad de agitación, la concentración de oxígeno disuelto
(DO2), el pH, el potencial redox y la concentración de dióxido de carbono (CO2). El
principal inconveniente para el desarrollo de este tipo de tecnología, radica en que no
existe un diseño de biorreactor que se adapte a todas las aplicaciones (Preil, 1991).
Por otro lado, la sustitución de peptona del medio LB (Sigma) por harina de soya de
origen industrial en el cultivo de la cepa 105 de B. subtilis no causó diferencias
significativas en el crecimiento (Sarmiento, 2012).
Las pruebas in vitro y en hoja desprendida de frijol con el aislado de B. subtilis 105 se
realizaron con cultivos celulares crecidos en matraces Erlenmeyer de 250 mL con
medio LB grado microbiológico (Sigma) y que contenían. Después de 16 h de cultivo
2.89 X 108 UFC mL-1 (Sotomayor-García, 2011). Sin embargo, en este trabajo no se
determinó la viabilidad ni la producción de esporas.
B. subtilis 105 es una bacteria autóctona aislada de suelos agrícolas de Sinaloa. Esta
bacteria sobresale por su actividad antagonista sobre S. sclerotiorum, que es un
hongo que ataca a cultivos de importancia agrícola, particularmente al frijol. Como
parte del proyecto “Obtenidas de bacterias benéficas para el cultivo del frijol” que se
desarrolla dentro de la Red de Biotecnología de IPN. Se tiene antecedentes del
crecimiento de la cepa 105 de B. subtilis a nivel de matraz, así como biorreactor. Los
caldos de cultivo obtenidos muestran actividad antagónica contra el hongo S.
sclerotiorum. Dado que el crecimiento de la bacteria y la producción de sus
compuestos antifúngicos se pueden ver afectados por el suministro de oxígeno, es
deseable entender el efecto que puede generar una condición de limitación de
oxígeno y una no limitada, en el crecimiento celular y la actividad antagonista del
caldo contra el hongo.
IV. OBJETIVOS
5.1 Microorganismos
a) b)
Durante la resiembra se tomó una asada de B. subtilis cepa 105, las cajas se
incubaron a 37 °C en una estufa durante 24 horas. Las cepas crecidas en las placas
de agar se almacenaron a 4 °C.
La cuantificación del crecimiento celular y de las esporas se realizó por medio del
conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC), que se describe a
continuación.
Para la cuantificación por UFC de células vegetativas se tomaron 10 mL de muestra
del caldo de fermentación cada 30 minutos. Se hicieron diluciones en tubos
eppendorf de 1 mL y alícuotas de 0.1 mL, y de los caldos diluidos fueron usadas
para la siembra en cajas Petri con medio Luria Agar (Sigma-Aldrich). Los cultivos se
incubaron durante 24 h a 37°C y se contó el número de colonias. Para determinar
la concentración celular se utilizó la ecuación siguiente:
Ec. 1
Las pruebas del efecto antagonista de los caldos de B. subtilis 150 sobre S.
sclerotiorum se realizaron en ensayos in vitro y utilizando los caldos de los cultivos
obtenidos a las 10 h, en la fase estacionaria del cultivo. En cajas de Petri con medio
PDA (Sigma-Aldrich), se colocó una porción de 0.5 mm de diámetro de micelio del
hongo crecido previamente a 27°C por 7 días en PDA. En uno de los extremos de la
caja se agregó 0.1 mL de caldo de cultivo. La muestra se incubó durante tres días a
37°C y se midieron los diámetros de crecimiento del micelio. El efecto antagonista se
reporta como el porcentaje de inhibición de B. subtilis sobre S. sclerotiorum,
calculado mediante la ecuación 2.
Ec. 2
'()
!"
'!"
' * + ' * +
# $
# $ # $ ,
%& %&
Figura 8. Crecimiento (A) y esporulación (B) de B. subtilis cepa 105 a nivel de matraz, en el medio LB (—) y soya (- - -).
Comparando los resultados obtenidos por Sarmiento (2012), que obtuvo un
crecimiento en el medio de soya de 480 x 106 células mL-1 y para el medio LB de 480
x 106 células mL-1, contra los obtenidos mediante la técnica de UFC, se puede inferir
que el conteo directo sobreestima el crecimiento del cultivo, ya que no considera la
viabilidad de las células vegetativas. Sin embargo, se confirma que el medio de soya
favorece el crecimiento y esporulación de B. subtilis 105.
La figura 9a, muestra para la condición de TOD 20% en el medio LB (sigma), cómo
la TOD del cultivo descendió desde 100 % a 0% en las primeras dos hora del cultivo.
A partir de las cuatro horas, la TOD se mantuvo por debajo del 20% mediante la
inyección de nitrógeno al sistema. Por otra parte, para el medio de soya, en la figura
9b, se observa que para el control de la TOD 20%, sólo se requirió de la inyección
de nitrógeno a la hora seis.
A B
Por el contrario, para mantener la condición de TOD 20%, fue necesario enriquecer
la corriente de entrada de gas con oxígeno. Los perfiles con el cultivo del medio LB y
el medio de soya muestran que desde la hora dos, el sistema de cultivo empezó a
ejercer la acción de control.
El establecimiento de la condición TOD 20% se consideró como una condición de
oxígeno limitante tomando en cuenta el reporte previo de Tseng et al. (1996). En
dicho reporte, cultivos de B. subtilis en una TOD 10% (22 µM oxígeno) se indujo la
expresión de los genes de la nitrato reductasa respiratoria (narGHJI), indicando que
el metabolismo de la bacteria cambió de aerobiosis a anaerobiosis (Tseng et al.,
1996).
Figura 11. Crecimiento (A) y esporulación (B), de B. subtilis 105 a nivel de biorreactor en
medio soya, evaluando la TOD < 20 % (—) y TOD > 20% (- - -).
Por otro lado, si se comparan los valores de crecimiento y esporulación obtenidos
bajo la misma condición de TOD, pero con diferente medio. Se observa que a una
TOD 20% la producción de células de B. subtilis en el medio LB (151 X 106 ± 60.3 x
106 UFC mL-1) fue 30% menor a la que se obtiene con el medio de soya (218 x 106 ±
10.6 x106), esta diferencia resultó significativamente menor (P < 0.001). No obstante
la producción de esporas correspondientes a ambas condiciones (48.7 x 106 ± 4.25 x
106 UFC mL-1 y 46.7 x 106 ± 4.18 x 106 UFC mL-1, para el medio de LB y soya
respectivamente) no presentó diferencia significativa (P < 0.001).
Los resultados mostraron que la mayor inhibición de crecimiento del hongo se obtuvo
con los caldos de B. subtilis 105 obtenidos en la condición de TOD 20%,
independientemente del medio utilizado. El porcentaje de inhibición para el cultivo
crecido en el medio LB fue de 39.3 ± 2.5 % y para el cultivo creado en el medio de
soya 41.4 ± 2.8 %. Mientras que los caldos de B. subtilis cepa 105 generados bajo la
condición de TOD 20%, produjeron inhibición micelial del 30.4 ± 5.8 % el medio
LB y 29.5 ± 7.3% con el medio de soya.
Finalmente, la menor actividad inhibitoria fue la obtenida con los caldos en los
matraces, donde la actividad fue menor al 25% menor. El análisis de varianza mostró
que los porcentajes de inhibición de los caldos obtenidos en condiciones de TOD
20% fueron significativamente mayores (P<0.001) a las obtenidas bajo condiciones
de TOD 20% (Figura 12).
,
,
Figura 12. Porcentaje de inhibición micelial de S. sclerotiorum, evaluando el sistema matraz, biorreactor bajo una TOD 20%
y TOD 20%. Los gráficos presentados muestran promedio ± DS (n=6), letras diferentes indican diferencias estadísticas
según la prueba de una vía y una comparación múltiple por medio de la prueba Tukey (P 0.001).
El mantener el cultivo bajo limitación de oxígeno (por debajo del 20% TOD), después
de la fase exponencial de crecimiento pudo haber inducido la formación de
compuesto bioactivos tales como micosubtilina, surfactina y plispaspatina, entre otros
(Nakano et al., 1997; Ongena et al., 2005; Pérez-García et al., 2011).
Abawi G., Grogan R., 1975, Source of primary inoculum and effects of temperature
and moisure on infection of beans by Whetzelinia sclerotiorum, Phytopatology,
65:300-309.
Bailey K. L., Boyetchko S. M., Längle T., 2010, Social and economic drivers shaping
the future of biological control: A Canadian perspective on the factors affecting
the development and use of microbial biopesticides, Biological Control,
52:221–229.
Berry C., Dilantha W. G., Loewen P. C., Kievit T. R., 2010, Lipopeptides are essential
for Pseudomonas sp. DF41 biocontrol of Sclerotinia sclerotiorum, Biological
Control, 55:3:211-218.
Boland G. J., Hall R., 1994, Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum, Canadain
Journal Plant Pathology, 16:93-108.
Campa A., Pascual A., Ferreira., 2009, El moho blanco: una enfermedad común en el
cultivo de Faba Granja Asturiana, SERIDA – Área de cultivos Hortofrutícolas y
Forestales, Programa de Genética Vegetal, Disponible en:
http://www.serida.org/publicacionesdetalle.php?id=3814, Consultado: Febrero
2013.
Carvalho A., Lacerda U., 2010, Growth sporulation and production of bioactive
compounds by Bacillus subtilis R14, Brazilian Archives Biology and
Technology, 53:3:643-652.
Chen Z. M., Li Q., Liu H. M., Yu N., Xie T. J., Yang M. Y., Shen P., Chen X. D., 2009,
Greater enhancement of Bacillus subtilis spore yields in submerged cultures by
optimization of medium composition through statistical experimental designs,
Applied Microbiology and Biotechnology, 85:1353-1360.
Duncan W. R., Fernando D. W. G., Rashid Y. K., 2005, Time and burial depth
influencing the viability and bacterial colonization of sclerotia of Sclerotinia
sclerotiorum, Soil Biology and Biochemestry, 20:1-10.
Errington J., 1993, Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expression and
control of morphogenesis, Microbiology Revision, 57:1-33.
Fritze D., 2004, Taxonomy of the Genus Bacillus and Related Genera: The Aerobic
Endospore-Forming Bacteria, Phytopathology, 94:11:1245-1248.
Horbach R., Navarro-Quesada A. R., Knogge W., Deising W. B., 2011, When and
how to kill a plant cell: Infection strategies of plant pathogenic fungi, Journal of
Plant Physiology, 168:1:51-62.
Kwon E. Y., Kim K. M., Kim M. K., Lee I. Y., Kim B. S., 2011, Production of
nattokinase by high cell density fed-batch culture of Bacillus subtilis,
Bioprocess and Biosystems Engineering, 34:789-793.
Marazioti C., Kornaros M., Lyberatos G., 2003, Kinetic modeling of a mixed culture of
Pseudomonas Denitrificans and Bacillus subtilis under aerobic and anoxic
operating conditions, Water Research, 37:6:1239-1251.
Matsumoto T., Sugiura Y., Kondo A., Fukuda H., 2010, Efficient production of
protopectinases by Bacillus subtilis using medium based on soybean flour,
Biochemical Engineering Journal, 6:2:81-86.
Molle V., Fujita M., Jensen S.T., Eichenberger S., González-Pastor J., E., Liu J. S.,
Losick, R., 2003, The Spo0A regulon of Bacillus subtilis, Molecular
Microbiology, 50:5:1683–1701.
Nakano M., Dailly Y. P., Zuber P., Clark D. P., 1997, Adaptation of Bacillus subtilis to
oxygen limitations, FEMS Microbiology Letters, 157:1-7.
Ongena M., Jacques P., Toure Y., Destain J., Jabrane A., Thonart P., 2005,
Involvement of fengycin-type lipopeptides in the multifaceted biocontrol
potential of Bacilli, Phytopathology, 94:11:1272-1275.
Pérez-García A., Romero D., De Vicente A., 2011, Plant protection and growth
stimulation by microorganisms: biotechnological applications of Bacilli in
agriculture, Current Opinion in Biotechnology, 22:2: 187-193.
Sarmiento L., 2010, Producción de Bacillus subtillis cepa 105 en reactor y evaluación
de su actividad antagonista a Sclerotinia sclerotiorum, Tesis licenciatura,
Instituto Tecnologico superior de Alamo Temapache.
Schisler A., Slininger P. J., Behle R. W., Jackson M. A., 2004, Formulation of Bacillus
sp. for Biological Control of Plant Diseases, Phytopathology, 94:11: 1267-1271.
Schneider K.B., Palmer T.M., Grossman A. D., 2002, Characterization of comQ and
comX, two genes required for production of ComX pheromone in Bacillus
subtilis, Journal of Bacteriology, 184: 410-419.
Thakore Y., 2006, The Biopesticide Market, BCC Research © January, Report Code:
CHM029B.
Tseng C. P., Albrecht J., Gunsalus R. P., 1996. Effect of microaerophilic cell growth
conditions on expression of the aerobic (cyoABCDE and dmsABC) respiratory
pathway genes in Escherichia coli, Journal of Bacteriology, 178: 1094-1098.
Yánez-Mendizábal V., Viñas I., Usall J., Torres R., Solsona C., Teixidó N., 2012,
Production of the postharvest biocontrol agent Bacillus subtilis CPA-8 using
low cost commercial products and by-products, Biological Control, 60:3: 280-
289.
Yeh M. S., Wei Y. H., Chang J. S., 2006, Bioreactor design for enhanced carrier-
assisted surfactin production with Bacillus subtilis, Process Biochemistry, 41:8,
1799-1805.
Zeng W., Kirk W., Hao J., 2012, Field management of Sclerotinia stem root of
soybean using biological control agents, Biological Control, 60:2: 141-147.