VS ¿Donde es mejor conseguir

muestras?
 Sin agricultura intensiva
 Parques nacionales, reservas, sitios
mas de 5 años sin cultivo son buenas
fuentes de microorganismos auto
reguladores (antagonistas).
 Regulados por el SNAP (y todo el
marco legal).
 Baja tasa de virulencia.
 Baja tasa de patogenia.
 Crecimiento muy lento.
 Gran contenido de metabolitos
secundarios.
Agricultura intensiva
 En todos los cultivos donde exista uso de
agroquímicos (plaguicidas o pesticidas)
existen sitios específicos donde se
encuentran microorganismos antagonistas.
 No regulados.
 Alta tasa de virulencia.
 Alta taza de patogenicidad.
 Crecimiento depende de la cepa (en general
rápido). Fácil adaptación.
 Bajo contenido de metabolitos secundarios.
 MATERIALES EQUIPOS
Viales de plástico de diferentes Cámara fotográfica
tamaños.

Marcador de tinta indeleble GPS

Bolsas de plástico y de papel
Pinceles
Lupa 20X y 30X
Hieleras.
Pinzas entomológicas
Esferos, lápices y borrador
Tijera para podar.
Pala, navaja multifuncional
DOCUMENTOS

 Formatos para toma de

datos.
 Información de la región
 Identificación del personal
de exploración.
 Mapas (celular).

ALMACENAR EN
REGISTRO O BASE DE
DATOS.

CREAR EXPEDIENTE
DIGITAL.
 Cambios de coloración. (comparado Signos físicos de la infección causada
con sanos). por hongos entomopatógenos.

 Tegumentos transparentes y semi-  HE crecimiento exuberante y colorido

transparentes
 Beauveria bassiana produce un pigmento de
color rojo (oosporeina) y amarillos
(bassianina y tenellina).
 Manchas necróticas producidas en los sitios
de penetración del hongo
sobre la superficie del insecto.
 B. bassiana insecto momificado.
 M. Anisopliae esporulación abundante
de color verde

Comportamiento inusual
➢ Desinterés por alimentarse.
➢ Suelen subir a los puntos altos de las plantas
hospederas.
➢ Movimientos lentos
Técnicas de Colecta de Insectos Infectados por
Hongos Entomopatógenos.

❖ Colecta directa
❖ Colecta indirecta
➢ Técnica del insecto trampa
 Separar al insecto del sustrato con la
ayuda de las pinzas entomológicas.

Insectos micosados Si el cadáver del insecto se encuentra

adherido a la planta, se recomienda
Aparente infección por hongos colectarlo junto con la porción de
esta para evitar dañarlo.

Colocar individualmente a los insectos

micosados en recipientes limpios ,
estériles, secos y debidamente
etiquetados.

Insectos que muestran cambios de coloración, * Agente de secado Gel de sílice o

ya sean vivos o muertos, además de aquellos papel filtro. O CuSO4 ayuda a
que tengan comportamiento diferente al resto retardar la germinación de los hongos
de la población. saprobios en las muestras y disminuye
la HR
 AISLAMIENTO

Los cultivos fúngicos fueron realizados bajo condiciones de esterilidad

(cámara de flujo laminar), los medios de cultivo así como todos los
materiales fueron esterilizados en autoclave a 121 ºC y 1 atmósfera de
presión durante 20 minutos.
 Insectos se trasladan al laboratorio en
recipientes adecuados.
 Desinfección de los especímenes,
sumergiendo en :
 Alcohol 70 v/v (°GL) 10s y 3 enjuagues.
 NaClO al 0.5%, durante 1 min., y se enjuagan tres
veces en agua destilada estéril.

 Se colocan sobre papel filtro.

 Cajas Petri como cámara húmeda estériles:
 papel filtrz
 una bolita de algodón humedecido
 dos portaobjetos colocados en cruz, sobre los
cuales se colocan los especímenes desinfectados.
24 horas.
 Removidos con una aguja entomológica estéril y se inocularon
directamente en cápsulas de Petri conteniendo medio de cultivo
Sabouraud dextrosa agar +CF+GM o PDA + CF + GM.

 Los medios de cultivo contenían antibióticos (gentamicina y cloranfenicol) para

evitar el crecimiento de bacterias contaminantes.

 Una vez obtenidos los aislamientos puros, estos fueron transferidos

a tubos de vidrio con medio de cultivo SDA o PDA 1% en estría para
ser mantenidos a 4 °C, hasta su utilización.
Obtención de HE a partir de suelo.

técnica del insecto trampa.

Aislamiento en medios selectivos.

 Tres a cinco puntos de suelo
superficial (planta madre).
Excavando 10 a 15 cm
(depende de la especie y
rizoma).
Se mezclan la muestras con
una pala en otro recipiente
se toma una aprox. 500g.

Depositar:
Se recomienda procesar las
muestras lo mas pronto
Envase estéril
posible, dentro de los Las muestras deberán
mantenerse en hieleras Una bolsa
primeros 5 días después de
la colecta.
etiquetada y esterilizada.
Útil para el aislamiento y la identificación de hongos autóctonos presentes en los suelos (proceso más lento)

Para procesar la muestra, se utiliza suelo húmedo (atomizador y

agua estéril).
P
A Utilizar contenedores de plástico con tapa, y agregar de 10 a 20 larvas.

S
La muestra de suelo se coloca en el recipiente, debe estar limpia para
O que los resultados no se vean alterados por posibles contaminantes.
S
Se puede desinfectar al espécimen con alcohol al 70% por 10s, enjuagarlos con agua
estéril, posteriormente, tratarlos con cloro comercial al 0.5.% durante un minuto y,
finalmente volver a lavar con agua estéril. El exceso de humedad se elimina colocando los
insectos sobre papel filtro estéril
Incubar a 25°C. y periódicamente, invertir los contenedores para asegurar que las larvas estén
expuestas al hongo.

Después de 14 días, cuando la muestra de suelo contiene HE, es posible observar las larvas
infectadas.

Eliminar el suelo adherido al cuerpo del espécimen con un pincel fino, auxiliándose con el
microscopio de disección o lupas para no contaminar.

Para el aislamiento, se transfieren las estructuras del hongo a cajas Petri con medio de
cultivo (PDA o SDA), adicionado con antibiótico (cloranfenicol + GM).

Posteriormente se realiza la identificación, considerando las estructuras morfológicas.

Tomar la muestra colectada y pesar 20g.

En tubos Eppendorf de 2 mL, se depositan 1g de suelo, agregándose 1 mL de

agua destilada estéril. Posteriormente, se agita el tubo por 30 seg y se toma una
alícuota de 50 μL (0.05ml), sembrándose en cada caja de Petri con medio
selectivo.

Incuba a 25 °C; transcurridos tres días, se deben realizar observaciones, las

colonias con características similares a HE.

Una vez hecho esto, se debe realizar la identificación de las características

morfológicas que aseguren que se trata de un hongo patógeno.
Se empleó la metodología de aislamientos por dilución seriada.

 Se suspendieron 10 g de cada muestra en 90 ml de agua

destilada dentro de un Erlenmeyer.

 Se transfirió 1 ml de esta solución madre a un tubo de

ensayo conteniendo 9 ml de agua destilada estéril.
CAJAS PETRI DE 10cm
DIAMETRO!.
 Se agitó mediante el uso de un vórtex durante 1 min y se
repitió esta operación 5 veces más (en total 6 diluciones).

 De las últimas tres diluciones se sembraron 100 μl de la

última dilución en cajas de Petri conteniendo medio de
cultivo PDA + CF + GM o cultivo Sabouraud dextrosa agar
suplementado con extracto de levadura 1% (SDYA).
0.05 ml (50
 Se evalúa características morfológicas macro y microscópicas.
 Aislar las mejores colonias según la identificación previamente
realizada
 Se realiza el proceso de dilución seriada****.

****reduce la concentración de microorganismos de una muestra.

#colonias que crecen depende de la concentración, la dilución puede ser
útil para obtener resultados más manejables o para tener un número
definido de colonias de cultivo en cada placa.
|
Comúnmente usado.

Vs.
Agua es estado de ebullición. Adición del arroz al agua.

3-5 minutos (Depende del tipo de arroz).

Para términos generales se usa 3 minutos.

AUTOCLAVE O CHOQUE TERMICO

Bolsas Autoclavables Con Filtro
COLOCAR 500 g de ARROZ
• Fundas con distinta
capacidad, desde 100
g hasta 1 kg.
• Se coloca el sustrato
y se cierra con un
dobles y ligas.

Las fundas se
esterilizan en
autoclave a 121°C
con 15 psi, durante
30 minutos.
 Se prepara 100 ml de AD + Tween 20 al 0.05% en un matraz Erlenmeyer.

 Se realiza un primer enjuague de las conidias de la matriz.

 Se hacen otros enjuagues sucesivos hasta completar 500 ml.

 Se agrega 65 mg de cloranfenicol.

 Para la inoculación del sustrato se utilizan 5 ml de esta suspensión por

funda.
 FUNDAS FUNDAS 500 g
1kg

AD + Tween 20 al 0.05%
De 5- 21 días.

15 - 28 °C.
Reactivación
Partiendo de una cepa seleccionada, sea nativa o introducida, es necesario
mantener la patogenicidad y virulencia de este organismo a través de dos
reactivaciones al año.

Para esto se utilizan insectos vivos procedentes de la cría del laboratorio o del
campo, que no muestren síntomas de afectación por algún patógeno.

(NaClO) al 0.5%, Se puede colocar el

durante 2 min, 3 La inoculación
insecto en el
enjuagues A.D. puede ser por un
congelador por 45
atomizador en
Inoculación en una seg. A fin de
algunos insectos
suspensión de disminuir su
voladores.
1x10^8 (Gotas) movilidad.
CONTROL DE CALIDAD:

 Todo producto obtenido dentro del laboratorio se debe muestrear al momento de ser
cosechado, así como, de ser observado durante su producción, anotar que si se cumplieron
las recomendaciones y si se siguió el procedimiento adecuadamente.

 De la muestra obtenida se debe a proceder hacer las siguientes pruebas.

a) Conteo de esporas.
b) Prueba de viabilidad de las esporas.
c) Determinación de contaminantes (pureza)
Formulación
METODOLOGIA STANDAR PARA LA PRODUCCIÓN COMERCIAL DE HE

Esterilización Control de Formular según

del material calidad la presentación

Preparación del Envasar y

Cosechar
sustrato etiquetar

Inoculacion del
Incubación/crecimiento
m/o HE
Crecimiento microbiológico.

Sustrato.

Condiciones Agua
ambientales.

Nutrientes
Tiempo (macro /
micro).
CRECIMIENTO
 Polvos solubles.
 Emulsiones concentradas.
 Gránulos.
 Pellets.
 Geles.

A base de hongos benéficos, para la implementación de bioensayos.

FORMULACION LIQUIDA
CONCENTRADA
 Formulación liquida (mas empleada).
¿Por que se usa tanto esta formulación?

 El costo de producción es bajo.

 El volumen es basado en el peso el agua.
 Esporas se mantienen viables un tiempo
aceptable.
 Visualmente se ve mucho producto por un bajo
costo.
 Nos permite colocar coadyuvantes.
 Extracto de patente (España).

https://patentimages.storage.googleapis.com/05/f1/5e/452d5d69c1a864/WO1997016974A1.
Análisis de patente (España).

https://patentimages.storage.googleapis.com/05/f1/5e/452d5d69c1a864/WO1997016974A1.pdf
Proceso de preparación.
Materiales a usar durante la preparación:
Proceso de preparación.
Reactivos a usar durante la preparación 100L:

1. Sorbitol (6kg).
2. Fosfato tricalcico (2kg). / MAP / DAP.
3. Nitrato de potasio (2kg).
4. Sulfato de magnesio (1kg).
5. Nitrato de amonio (2kg).
6. Sulfato de zinc (1kg).
7. Ácido Bórico (1kg).
8. Sulfato de manganeso (2kg).
9. EDTA. (3kg). / Acido lignocelulosico.
Proceso de preparación.
1. Dividir cada funda de 500g con sustrato-microorganismo en 3 partes.
2. Colocar cada parte con 500 ml de agua en la licuadora.
3. Colocar a máxima velocidad por 1 minuto 30 segundos. (Esto se evalúa).
4. Se pasa por la coladora (malla 40).
5. Liquido dejar reposar tapado por 5 horas.
6. Calentar agua hasta ebullición.
7. Colocar la mezcla de sales en el siguiente orden (Nitratos – sulfatos-
fosfatos- Ácidos- EDTA*- Sorbitol).
1. *2 kg EDTA + 2kg de Sulfato de manganeso.
2. *1 kg EDTA + 1kg de Sulfato de zinc.

8. Se mueve constantemente hasta total disolución.

9. Se deja reposar por 5 horas.
10. Se unen las 2 soluciones.
FORMULACION POLVO SOLUBLE
 Formulación Solida.

¿Por que no se usa tanto esta formulación si es tan

buena?
 El costo de producción es semejante al liquido.
 El volumen es bajo (mezcla de sales y aditivos pueden
llegar a máximo 1 kg).
 Esporas viables por un largo tiempo.
 Visualmente se ve poco producto por su costo.
 Se debe humedecer el producto antes de aplicarlo.
 Formulación solida.
• Materiales:
 Necesitamos: – Molino manual /
eléctrico.
 Productoseco (10% - 20%
Humedad). Cámara o área de – Pala de plástico /inox
secado. – Fundas al vacío.
 Arrocillo. – Selladora al vacío.
 Mezcla de sales* KNO3, Ca(NO3)2,
MnSO4.
Proceso de preparación.
1. Moler el arrocillo con el molino (granulo tipo harina).
Se puede auto clavar.
2. Se muele el producto de sustrato-microorganismo
seco (Se recomienda tapar las entradas de aire del
molino en este paso al igual que la salida).
3. Se mezcla la harina de arrocillo con las sales.
4. Se adiciona el producto sustrato-microorganismo.
5. Se envasa al vacío.
 Secado del producto
 El sustrato se coloca en un cuarto o equipo de secado, a
una temperatura de 28 °C*, con baja humedad relativa
(<70%) y sin entrada de rayos solares (cuarto oscuro).
 El material se esparce sobre papel periódico esterilizado o
cartón o sobre un plástico negro, manteniéndose de 10 a
12 días, hasta que el contenido de humedad descienda al
12 ó 14% (se comprueba con un medidor de humedad).

 *se puede variar la temp. Hasta lo 40°C y bajar el tiempo de

secado.
 ¿Con que puedo secar mi producto?

EQUIPO CALEFACTOR OPTIMO / IDEAL.

 120 V
 Interruptor de seguridad de vuelco
 Seguridad de sobrecalentamiento apagado
 Control de termostato
 Temporizador programable de 12 horas
 ECO / 750 / 1500W
 Salida de calor: 5000 BTU / h
 U$S 35 - $60

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gabinete-infrarrojo-de-4-elementos-_JM?quantity=1
 U$S 149

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ciclonico-lasko-_JM?quantity=1
CUARTO Secado / crecimiento.
FORMULACION EN PELLET
Formulación Solida (Prensado).
¿Por que les gusta tanto esta formulación a los
agricultores?
 El costo de producción es mas alto.
 Elvolumen es logrado con una mezcla de sales,
carbohidratos gelatinizados y microorganismos.
 Esporas viables por un largo tiempo (si se secan o
deshidratan de forma correcta la formulación).
 Visualmente se ve mucho producto por su costo.
 Tiene doble función (Fertilizante /enmienda – bio-
controlador).
 PARBOLIZADO.
 Al tratamiento hidrotérmico del arroz entero.
 La desnaturalización o fusión del almidón debida a la
acción del calor en presencia de agua se conoce como
“gelatinización”.
 La fusión de los segmentos cristalinos del almidón
produce un sistema completamente amorfo.
 El reordenamiento parcial del sistema amorfo se conoce
como retrogradación o recristalización y es un proceso
dependiente de la temperatura y el contenido de
humedad.

TODO ESTO PARA QUE NOS SIRVE?

 Proceso de preparación.

1. Moler el arrocillo con el molino (granulo tipo harina). Se

puede auto clavar.
2. Se muele el producto de sustrato-microorganismo seco (Se
recomienda tapar las entradas de aire del molino en este
paso al igual que la salida).
3. Se mezcla la harina de arrocillo con las sales disueltas* con
agua a 92°C hasta formar una pasta
4. Cuando la temperatura este a 40°C se adiciona el producto
sustrato-microorganismo.
5. Se espera 15 – 20 minutos.
6. Se amasa y se pasa por la maquina de pelletizado.
7. Se lleva al horno de secado (no pasar los 35°C).
FORMULACION GELES
 Formulación Semi-solida (Gel).

¿Por que seria una buena opción para los agricultores

esta formulación?
 El costo de producción medio.
 Elvolumen es logrado con una mezcla de químicos que no
afectan a la planta.
 Esporas viables por un tiempo aceptable.
 Visualmente se ve innovador.
 Tiene función de aplicación especifica y ayuda a mantener
la humedad por mayor tiempo.
 Ingredientes:

 Homopolímero del ácido 2-

propenóico;
homopolímero del ácido
acrílico. (Carbopol).
 2,2',2"-Trihidroxi-
trietilamina, Trietilolamina,
Trolamina, TEA.
 Agua.
Carragenanos 2%, CMC 5%, MC 15%, Cellocize 5%,
Gomas, extractos de plantas suculentas, Chia, aloe
vera, etc).
 Proceso de preparación 1.

1. Se muele el producto de sustrato-

microorganismo seco.
2. Se mezcla el carbopol 1.5% + agua
(Homogeniza). Para homogeneizar colocar en
licuadora.
3. Se adiciona el molido de microrganismo –
sustrato a la mezcla de carbopol.
4. Se adiciona TEA hasta pH 7.
5. Se envasa y se etiqueta.
 Proceso de preparación 2.

1. Se muele el producto de sustrato-

microorganismo seco.
2. Se mezcla el carbopol 1.5% + agua + sustrato-
microorganismo seco.(Homogeniza).
3. Se adiciona TEA hasta pH 7.
4. Se envasa y se etiqueta.
FORMULAS PROPIAS
Harina de Sangre
 La harina de sangre es una modificación de nitrógeno que se pueden agregar a su jardín. La
adición al suelo ayudará a elevar el nivel de acidez del suelo y la voluntad de ayudar a las
plantas a crecer más exuberante y verde. Lo cual es beneficioso para algunos tipos de plantas
que prefieren suelos con bajo pH (suelo ácido). Con una forma muy concentrada de nitrógeno y
el exceso de nitrógeno en el suelo puede, como mucho, mantener las plantas en floración o
fructificación y en el peor, "quemar" la planta y posiblemente matarlos. Y también se utiliza
como un elemento de disuasión para algunos animales, como los topos, ardillas y venados. Se
piensa que el olor de la harina de sangre no es atractivo para estos animales.
 La harina de sangre se seca, la sangre en polvo utilizada como fertilizante alto en nitrógeno y
una alimentación alta en proteínas. N = 13,25%, P = 1,0%, K = 0,6%. Es una de las fuentes no
sintéticos más altos de nitrógeno y si sobre-aplicada que puede quemar las plantas con exceso
de amoníaco. Es completamente soluble y puede ser mezclado con agua para ser utilizado como
un fertilizante líquido. Por lo general proviene de un matadero de ganado como subproducto.
También puede ser utilizado como un suplemento alimenticio para animales y de hecho es
ampliamente utilizado debido al alto contenido de lisina, aunque al menos uno de un vendedor
importante está ofreciendo harina de sangre procedente de cerdos, debido a preocupaciones
por la EEB.
 El nitrógeno es más típicamente falta de suelos que los otros elementos previstos por la
mayoría de los fertilizantes (fósforo y potasio). Las plantas que crecen en el suelo carece de
cantidades adecuadas de nitrógeno se amarillenta de las hojas hacia abajo debido a la
deficiencia de nitrógeno. La aplicación de la harina de sangre ayudará a las plantas vuelven a
reverdecer.
Especificación []
Proteína 85% min
Pepsina-solluble proteína 85%
min
Humedad 10% max
Ceniza 7% max
Ceniza Solluble 0,5% max
RESULTADOS
 P. parasitica

CONTROL DE PHYTOPTORA
EVITANDO PROPAGACION DE
LA ENFERMEDAD A OTRAS
PLANTAS DE PIÑA GRACIAS A
LA ACCION DE FARM DUAL
MIX Y TRICOFERTI
RECUPERACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE
PIÑA Y CONTROL EFETIVO DE Anoxia
villosa CUTZO CON INSECTKILL
 PICUDO
Rhynchophorus ferrugineus
CULTIVO DE PASTO
MACHACHI
TRICOFERTI + N-P-K
Ventajas de consumir
alimentos sin
fitosanitarios.
FALLAS