PRÁCTICA 4

Viabilidad y contaje de Linfocitos T

1. Objetivo

Valorar los fundamentos que sustentan los diferentes procesos involucrados en la respuesta
inmune innata y adaptativa a nivel celular y molecular, articulados con la práctica en el
laboratorio y como elementos esenciales de apoyo para otras áreas del ejercicio profesional.

2. Resultados de aprendizaje esperados

• Identificar y describir los principales órganos y células del sistema inmune, así como los
componentes de la respuesta inmune innata.
• Aplicar técnicas inmunológicas adecuadas para demostrar la presencia o ausencia de
anticuerpos y/o antígenos que constituyen la base de la respuesta inmune respetando las
normas de bioseguridad y tomando en cuenta el control de calidad

3. Fundamento teórico

La cosecha de Linfocitos T de sangre periférica a través de cultivos celulares ha permitido su

estudio, análisis cromosómico e identificación de los marcadores de superficie denominados CD
(del inglés, Cluster of differentiation). Con esta información, se han podido desarrollar
tratamientos farmacológicos específicos e incluso ha permitido entender de mejor manera el
mundo de los trasplantes de órganos.

La realización de técnicas que nos permitan determinar su cantidad y su viabilidad son muy
importantes para valorar cuantitativa y cualitativamente a este estirpe celular.

El azul tripán (azul diamina, azul Niágara, azul vital) es un colorante derivado de la toluidina que
posee la capacidad de teñir a tejidos y células muertas. Su nombre se deriva de su capacidad
para matar a los tripanosomas, parásitos causales la enfermedad de Chagas en América,
enfermedad del sueño en África y Leishmaniasis. Este colorante es uno de varios empleados para
evaluar la viabilidad de células por exclusión de captación, ya que no puede penetrar y teñir a
las células vivas con membranas íntegras. El azul tripán no es necesario para realizar conteos
simples de células pero sí es imprescindible para diferenciar entre las células muertas (con
disrupción membranal) de las vivas con membranas íntegras. (Laboratorio de Genómica Viral y
Humana, 2013)
Para el contaje de estas células se debe usar una Cámara de Neubauer y usar los cuadrantes
externos.

4. Actividades prácticas

4.1 Uso de Cámaras de recuento celular

Las cámaras de recuento se utilizan para determinar el número de partículas por unidad de
volumen de un líquido. Dichas partículas pueden ser: leucocitos, eritrocitos, trombocitos,
bacterias, esporas, polen, espermatozoides, huevos de parásitos, etc, las mismas que se cuentan
visualmente con un microscopio óptico. (BRAND CORPORATION, 2018)

Existen disponibles varios tipos de cámaras de recuento, y la precaución que hay que tener es
conocer la medida de su profundidad y el número de cuadrículas de cada cámara. Para
reforzamiento de los conocimientos, pueden referirse al acápite 5,2 de la práctica No.2.

Los tipos de cámaras son: Neubauer, Neubauer improved, Neubauer improved, líneas claras,
Thoma, Bürker, Bürker-Türk, Fuchs-Rosenthal, Malassez y Nageotte.

4.1.1 Reactivos, materiales y equipos

REACTIVOS MATERIALES EQUIPOS
Solución de PBS Pellet de Mononucleares al 1% Microscopio óptico
Solución Salina al 0,85% Cámaras de Neubauer
Puntas amarillas
Puntas azules
Cámara de Neubauer
Papel absorbente
Tabla 9 Contaje de Células en Cámaras

4.1.2 Procedimiento

• Limpiar la Cámara de Neubauer con alcohol antiséptico para evitar contaminaciones

cruzadas con otras muestras.
• Humedezca los extremos del cubreobjetos de la Cámara de Neubauer con agua y colóquelo
de manera vertical de tal manera que cubra el 100% de la zona de contaje.
• Prepare una dilución 1:10 del pellet de células mononucleares con un volumen final de 100
µL.
• Homogenizar adecuadamente la suspensión y colocar aproximadamente 10 a 15 µL de la
suspensión a cada lado de la cámara de Neubauer con un flujo del pipeteo constante.

• Realizar el contaje usando microscopio óptico con lente de menor aumento en los 4
cuadrantes externos cubriendo una superficie de 4 mm2.
• Usando la fórmula explicada en el acápite 5,2 de la práctica No.2 calcular la concentración
de mononucleares en el pellet.
4.2 Viabilidad celular

La determinación de la viabilidad celular permite conocer el éxito de un proceso, ya sea este un

cultivo celular o incluso el impacto de una estrategia de remedición ambiental; dependiendo
de la acción tomada, se buscará

4.2.1 Reactivos, materiales y

equipos
REACTIVOS MATERIALES EQUIPOS
Solución de PBS Pellet de Mononucleares al 1% Microscopio óptico
Azul de Tripán al 0.4% Cámaras de Neubauer
Puntas amarillas
Puntas azules
Tubos vidrio limpios de 12x75 mm
Papel absorbente
Tabla 10 Coloración de Azul de Tripán al 0,4%

4.2.2 Procedimiento

• Estime el volumen del pellet de células mononucleares y anote en su registro de prácticas.

De ser conveniente, lleve a un volumen final de 1 ml usando solución de PBS.
• Agregue 90 μL de azul tripán al 0.4% en un tutbo de vidrio nuevo.
• Homogeneice la suspensión celular y agregue 10 μL de la misma al tubo con el el azul de
tripán al 0.4%.
• Mezcle la suspensión celular con azul tripán por pipeteo de 5 a 8 veces.
• Coloque 10 μL de la mezcla en cada cámara de Neubauer.
• Coloque la Cámara de Neubauer en el microscopio y localice la retícula grabada.
• Deje que las células se asienten durante 1-2 minutos y proceda al conteo en los extremos
externos, abarcando una superficie de 4 mm2.
• Cuente por separado a los mononucleares azules (muertas) y mononucleares
birrefringentes o blancas (vivas) que sean observadas en cada uno de los cuadrantes.
• De existir células en las esquina, fuera del borde de la cuadrícula, NO deberán ser incluidas
en el contaje.
• Calcule los resultados según el área establecida.

5. Cálculos y/o resultados

Para el cálculo de la concentración celular, seguir la siguiente fórmula:

Para el cálculo de la viabilidad celular, usar la siguiente fórmula:

El azul tripán tiene una mayor afinidad por las proteínas séricas que por las proteínas
intracelulares. Si el fondo extracelular de la suspensión celular aparece obscuro será necesario
volver a centrifugar la suspensión celular y re suspender el pellet celular en medio libre de
Proteínas como el PBS.

• Las células mezcladas con azul tripán deberán ser evaluadas inmediatamente. Incluso las
células vivas captarán el colorante tras exposiciones superiores a los 10 minutos.
• Si las células forman cúmulos o agregados, repítase el procedimiento asegurándose de
mezclar bien la suspensión celular y el azul tripán por pipeteo.

6. Presentación de resultados (Informe o reporte)

Para la elaboración del informe de resultados, se deberá tomar en cuenta el formato adjunto en
la sección de anexos. Para llenar la información del encabezado, se deberá colocar el nombre
del paciente que dio su sangre para la práctica.

7. Guía para discusión de resultados-cuestionario

Para reforzar los conocimientos adquiridos durante la práctica No. 1, se requiere que el alumno
conteste las siguientes preguntas y realice la discusión de las situaciones planteadas a
continuación:

Favor, resolver las siguientes preguntas:

• Investigue sobre las diferentes cámara de contaje celular detallas al inicio de la guía y realice
un cuadro comparativo con sus diferencias.
• Investigue al menos 5 aplicaciones de la técnica de viabilidad en el campo de su profesión,
pueden ser en el campo de microbiología agrícola o microbiología veterinaria y describa su
objetivo.

• Realice el cálculo de las siguientes soluciones, usando Cámaras de contaje de células, según
se indique:
o Tipo de cámara usada: Bürker-Türk, se contó un total de 254 espermatozoides de
un toro de lidia, dilución empleada 1:25 y se realizó el contaje en los 4 cuadrantes
externos de 1mm2.
o Tipo de cámara usada: Fuchs-Rosenthal, se contó un total de 25 huevos de parásitos
de perro, dilución de la muestra 1:100 y se realizó el contaje en 16 cuadrantes de 1
mm2.
 o Tipo de cámara usada: Nageotte, se contó un total de 69 huevos de nematodos de
cerdos, la dilución empleada fue de 1:50 y se realizó el contaje en 40 rectángulos de
2,5 mm2.
o Tipo de cámara usada: Malassez, se contó un total de 10 huevos de Haemonchus
contortus en un dilución de 1:150 y se realizó el contaje en una superficie de 1.25
mm2.
• Investigue las subclases de Linfocitos T existentes y describa la función representativa de
cada estirpe celular.
• Investigue como prepara el Azul de Tripán y sus componentes.

8. Conclusiones y recomendaciones

Al finalizar la práctica No. 4, el estudiante estará en la capacidad de:

• Manejar una cámara de recuento celular para determinar la concentración celular de

suspensiones de diferentes matrices.
• Diferenciar células viables en una suspensión determinada a través de la coloración de Azul
de Tripán.
• Se recomienda ejercitar el cálculo de la concentración de contajes celulares empleando la
fórmula dada y variando el uso de las cámaras de recuento disponible en el mercado.

9. Bibliografía

BRAND CORPORATION. (2018). BRAND GMBH+CO KG. Recuperado el 21 de Febrero de 2018, de

Catálogo General 900:
https://www.brand.de/fileadmin/user/pdf/GK900/Zaehlkammern/GK900_05_Clinical_
Lab_Zaehlkammern_s.pdf

Detrick, B. H. (2006). Manual of molecular and clinical lab immunology (7ma. ed.). Washington,
Washington, Estados Unidos: American Society for Microbiology.

Laboratorio de Genómica Viral y Humana. (13 de Octubre de 2013). Conteo celular y evaluación
de viabilidad. Laboratorio de Genomica Viral y Humana, Facultad de Medicina UASLP,
n/i.

PARASITIPEDIA.net. (2018). Recuperado el 21 de Febrero de 2018, de Parásitos del Ganado,

Caballos, Perros y Gatos: Biología y Control:
http://parasitipedia.net/index.php?option=com_content&view=article&id=178&Itemi
d=52
Roitt, D. M. (2015). Imnunología Fundamentos (12va. ed.). Madrid, España: Panamericana.

Wild, D. (. (2013). The immunoassay handbook : theory and applications of ligand binding, elisa
and related techniques (4ta. ed.). (D. Wild, Ed.) Oxford, United Kingdon: Elsevier Science.