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Revista de Periodoncia; Copyright 2017 DOI: 10.1902 / jop.2017.170328

Modelo no quirúrgico para la regeneración ósea alveolar de Proteína

morfogenética ósea-2/7 Terapia de genes

Mariko Kawai* † ‡, Yo-Hei Kataoka‡, Junya Sonobe†, Hiromitsu Yamamoto†, Masakazu

Inubushi*, Takuya Ishimoto§, Takayoshi Nakano§, Hiroki Maruyama‖, Jun-Ichi Miyazaki¶,

Toshio Yamamoto‡, Kazuhisa Bessho†, Kiyoshi Ohura*

*
Departamento de Farmacología, Universidad Dental de Osaka, Osaka, Japón.

†Departamento de Cirugía Oral y Maxilofacial, Facultad de Medicina, Kyoto

Universidad, Kyoto, Japón.

‡Departamento de Morfología Oral, Facultad de Medicina de la Universidad de Okayama,

Odontología y Ciencias Farmacéuticas, Okayama, Japón.

§Diseño de Biomateriales y Materiales Estructurales, División de Ciencia e Ingeniería de

Materiales, Escuela de Graduados de Ingeniería, Universidad de Osaka, Osaka, Japón.

‖Departamento de Nefrosciencia Clínica, Facultad de Medicina de la Universidad de Niigata

y Ciencias Dentales, Niigata, Japón.

¶División de Investigación en Regulación de Células Madre, Facultad de Medicina de la Universidad de Osaka, Osaka,

Japón.

Situación actual: el Dr. Toshio Yamamoto es profesor emérito de la Universidad de Okayama, Okayama, Japón

Antecedentes: el hueso alveolar es un tejido crítico para la retención de dientes; sin embargo, una vez que se pierde el hueso alveolar,

es posible que no se regenere espontáneamente. Actualmente, los injertos óseos o hueso artificial se utilizan comúnmente para la terapia de

regeneración ósea alveolar. Sin embargo, estas terapias requieren procedimientos quirúrgicos, que presentan riesgos, particularmente en

pacientes de edad avanzada. Por lo tanto, el desarrollo de técnicas de regeneración ósea alveolar que no requieran procedimientos quirúrgicos es

fundamental. Es bien conocido que las células madre presentes en el ligamento perióstico y periodontal pueden inducirse a diferenciarse en células

osteogénicas. En este estudio, planteamos la hipótesis de que la transferencia de la proteína morfogenética ósea (BMP)-2/7 gen en tejidos

periodontales a través de en vivo La electroporación induce la producción de BMP exógenas e induce a las células madre de los tejidos

periodontales a diferenciarse en células osteogénicas, lo que permite la generación de nuevo hueso alveolar.

Métodos: El BMP-2/7 El vector de expresión génica se introdujo mediante electroporación en el sitio diana en los

tejidos periodontales del primer molar del maxilar de la rata.

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Resultados: Se detectaron BMP-2 y -7 exógenas en las áreas objetivo y se observó el crecimiento de nuevo tejido

óseo alveolar cinco días después de la transferencia génica. El día siete, se encontró que los nuevos tejidos óseos alveolares

se conectaban con los tejidos óseos originales. Además, las tasas de aposición mineral del hueso alveolar siguiendo

BMP-2/7 La transferencia de genes fue significativamente mayor que la del grupo de control después de lacZ transferencia de genes.

Conclusiones: Los presentes hallazgos indican que una combinación de los BMP-2/7 vector no viral y en vivo La

electroporación representa una opción no quirúrgica prometedora para la terapia de regeneración ósea alveolar.

PALABRAS CLAVE:

Periodonto, Plásmidos, Electroporación, Hueso y Huesos, Regeneración, Proteínas Morfogenéticas

Óseas.

Las terapias destinadas a aumentar la masa ósea alveolar en pacientes que han perdido este tejido como resultado de una enfermedad

periodontal o un traumatismo son fundamentales, por ejemplo, para el éxito de la terapia con implantes dentales.1,

2. En la actualidad, las opciones terapéuticas implican la obtención de masa ósea alveolar para autotrasplante del

hueso ilíaco o mandibular de un paciente. Sin embargo, estas opciones requieren procedimientos quirúrgicos; en

particular, los pacientes que reciben injertos de hueso ilíaco requieren hospitalización. En la mayoría de los pacientes,

el riesgo de infección o fractura es alto.3-5. Estos riesgos son aún mayores en el caso de los pacientes de edad

avanzada.6-9. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de una terapia segura y no quirúrgica para la regeneración del

hueso alveolar.

La proteína morfogenética ósea (BMP) induce fuertemente la diferenciación de las células madre

mesenquimales en células osteogénicas.10. En consecuencia, numerosos intentos11-13 para utilizar BMP

para aplicaciones clínicas; sin embargo, estos enfoques no se emplean comúnmente en todo el mundo

en la actualidad. La aplicación de la proteína BMP recombinante para la inducción ósea requiere

portadores basados en biomateriales y operación quirúrgica.14-17. Por lo tanto, intentamos entregar el

BMP-2 gen a los músculos esqueléticos de ratas utilizando un vector de expresión adenoviral18-20. los

BMP-2 El vector de expresión del gen adenoviral indujo una respuesta inmune, por lo que no pudo

inducir la formación de hueso ectópico a menos que se administrara un tratamiento inmunosupresor.

18-20.

Finalmente, construimos un modelo de formación de hueso ectópico en los músculos esqueléticos de ratas

usando un BMP-expresión de vector plasmídico no viral a través de en vivo electroporación21. La combinación

del vector de expresión génica no viral yen vivo La electroporación permite la transferencia de genes con mayor

eficiencia que la lograda por los típicos vectores de expresión de genes no virales solos.22. Se encontró que la

formación de hueso ectópico es limitada en áreas galvanizadas con electrodos21. Además, construimos un

BMP-2/7 vector de expresión génica para lograr

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mayor osteoinducción23. Este vector produjo heterodímeros BMP-2/7 e indujo la formación de hueso ectópico

más rápidamente que elBMP-2 vector de expresión génica23. En general, se sabe que varios tipos de células

madre mesenquimales están presentes en los tejidos periodontales.24, 25. Por lo tanto, proponemos que las

BMP exógenas derivadas por transferencia de genes a tejidos periodontales promueven la diferenciación de

estas células madre mesenquimales en células osteogénicas (Fig. 1B).

En el presente estudio, intentamos inducir la formación de hueso alveolar introduciendo el

BMP-2/7 vector de expresión génica no viral en los tejidos periodontales de ratas a través de en vivo

electroporación.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales

Ratas Wistar macho de nueve semanas # se mantuvieron bajo condiciones específicas libres de patógenos en nuestra

instalación animal. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la

Universidad de Okayama (número de aprobación. Oku-2012137) y el Comité de Investigación Animal de la Universidad

Dental de Osaka (número de aprobación. 15-1001).

Transferencia de genes a los tejidos periodontales del molar maxilar de rata

Se anestesiaron ratas Wistar macho de nueve semanas de edad (n = 3 por grupo) mediante una inyección

intraperitoneal de pentobarbital sódico (5,0 mg / 100 g de peso corporal). losBMP-2/7 vector de expresión

génica no viral, pCAGGS-BMP-2/7 se ha descrito en detalle en nuestro estudio anterior23. En resumen, este

vector tiene dos casetes de expresión paraBMP-2 y BMP-7 sin un sitio de entrada ribosomal interno (IRES);

BMP-2 y BMP-7 se expresan igualmente, dando como resultado la producción de un heterodímero

BMP-2/723. El vector plasmídico se diluyó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 0,5 µg / µL y

se inyectó un volumen total de 50 µL en la región palatina de los tejidos periodontales en el primer molar

del maxilar derecho, utilizando jeringas con agujas de calibre 31.26. El vector plasmídico se inyectó

cuidadosamente para evitar derrames. Los electrodos tipo aguja,** que estaban separados por 5 mm, se

insertaron en las áreas inyectadas con el vector plásmido. Luego se realizó la electroporación

inmediatamente (Fig. 1A), con 32 pulsos eléctricos a 50 V durante 50 mseg.26.

Análisis histológicos

Las ratas (n = 3 por grupo) se perfundieron con solución salina a través del ventrículo izquierdo durante 3-5 minutos en el día 1,

3, 5 y 7 tras la transferencia génica. Luego, la solución salina se reemplazó con un fijador compuesto de

paraformaldehído al 4% y tampón de fosfato 0,05 M (pH 7,4)27. Regiones del paladar, incluyendo

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molares, se recogieron y fijaron con paraformaldehído al 4% tamponado con fosfato durante 12 h. Las

epífisis femorales se descalcificaron con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 5% (p / v) en tampón

fosfato 0,05 M durante 28 días.27. A continuación, se incluyeron en parafina. Partiendo de las secciones

frontales, cortamos secciones de 5 µm de espesor del tercer molar en la dirección del primer molar.

Durante nuestro corte de la sección, intentamos hacer un paralelo en el molar derecho e izquierdo

antes de llegar al primer molar. Las secciones de la mitad del primer molar se sometieron a tinción con

hematoxilina y eosina (H&E).27.

A continuación, las secciones del primer molar se sometieron a inmunohistoquímica (IHC). Las

secciones se rehidrataron y sumergieron en una solución de ácido periódico al 0,5% durante 10 min para

inhibir la actividad de peroxidasa endógena, y luego se trataron con hialuronidasa al 2,5% en solución

salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía Triton X-100 al 0,025% durante 60 min a 37 ° C. . A

continuación, las secciones se incubaron en PBS que contenía albúmina de suero bovino al 10% durante

15 min y se lavaron con PBS.27. Estos luego se incubaron con anti-fosfatasa alcalina (ALP)‡ ‡ a una dilución

de 1: 200 durante 12 ha 4 ° C, seguido de varios enjuagues e incubación con un anticuerpo secundario

marcado con peroxidasa† † a una dilución de 1: 400 durante 1 ha 37 ° C. La incubación se terminó

lavando con PBS; Las secciones se sumergieron luego en tampón Tris-HCl 0,05 M (pH 7,6, 100 µL)

suplementado con tetrahidrocloruro de 3, 3'-diaminobencidina (20 mg) y 30% de H2O2 (10 µL) durante 10

min a temperatura ambiente 27.

Para la tinción por inmunofluorescencia, las secciones seriadas se trataron con anti-CD68 de rata‡ ‡,

a una dilución de 1: 500, o con anti-BMP-2 humana‖‖ a una dilución de 1: 600, o con antihumana BMP-7‖‖ a una

dilución de 1: 400, durante 12 ha 4 ° C. Esto fue seguido por varios enjuagues e incubación con anticuerpos

secundarios: anticuerpos secundarios de cabra anti-IgG de ratón Alexa594 y anticuerpos secundarios de cabra

IgG anti-conejo Alexa488‖‖ a una dilución de 1: 100, durante 60 min. Después de varios enjuagues, Hoechst

33342¶ ¶ se realizó tinción28. Luego examinamos las secciones por microscopía de fluorescencia.# #.

Tinción de doble hueso y medición de las tasas de aposición de minerales

Las ratas (n = 3 por grupo) fueron inyectadas intraperitonealmente con calceína* * * (10 mg / kg) el día del inicio de la

transferencia génica; luego, tres días después de la transferencia genética, clorhidrato de tetraciclina* *
*
(30 mg / kg) se inyectó por vía intraperitoneal29. Seis días después de la transferencia de genes, las ratas se

inyectaron de nuevo con calceína. Siete días después de la transferencia genética, las ratas fueron sacrificadas

con una sobredosis de pentobarbital sódico. Las regiones maxilares de las ratas se disecaron y fijaron con

etanol al 70% durante 8 días, seguido de tinción con tinción de hueso Villanueva durante 10 días,

deshidratación con concentraciones crecientes de etanol e incrustación en metil

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metacrilato sin descalcificación. Después de la polimerización30, se obtuvieron cortes frontales de

10 µm del centro mesiolingual de los primeros y segundos molares superiores. Las secciones se

observaron mediante microscopía de fluorescencia.§ § § bajo irradiación UV para marcado con

tetraciclina (364 nm) y calceína (477 nm)31. El ancho de las áreas marcadas con calceína y

tetraciclina se midió verticalmente en 10 puntos de la región en la que se había realizado la

transferencia génica.31. Los análisis estadísticos fueron realizados port prueba.

RESULTADOS

Cambios histológicos después de la transferencia del gen BMP-2/7 mediante

electroporación in vivo

Un día siguiente BMP-2/7 transferencia de genes, observamos el influjo de linfocitos o sangre en los tejidos

periodontales (Fig. 2 F, G). Aunque estaban presentes numerosas células relacionadas con la inflamación

positivas para CD68 (Fig. 2 H), encontramos células humanas positivas para BMP-2- o BMP-7 en los tejidos

periodontales diana (Fig. 2 I, J). Tres días después de la transferencia de genes, continuamos detectando células

relacionadas con la inflamación positivas para CD68 en los tejidos periodontales (Fig. 3 H). Sin embargo,

identificamos adicionalmente BMP-2 humana- y células positivas para BMP-7 (Fig. 3 I, J). Cinco días después de la

transferencia génica, había menos células inflamatorias (Fig. 4 F, G) y no pudimos identificar células humanas

positivas para BMP-2- o BMP-7 (datos no mostrados). Sin embargo, se detectó nueva formación de hueso en los

sitios diana en los tejidos periodontales (Fig. 4 F y G, indicadas por flechas). Las células alrededor del nuevo

tejido óseo exhibieron una fuerte tinción de ALP (Fig.4 H, I,

J). Siete dias despuesBMP-2/7 transferencia de genes, encontramos que los nuevos tejidos óseos se habían fusionado

con el hueso alveolar (Fig. 5 F, flechas G). También se detectaron células positivas para ALP alrededor del nuevo tejido

óseo siete días después de la transferencia génica (Fig. 5 H, I, J).

Resultados morfométricos del hueso alveolar en la tinción de doble hueso

Detectamos un nuevo tejido similar al hueso adherido al hueso alveolar original mediante la tinción del

hueso de Villanueva; esto se visualizó como una línea de color rojo y se caracterizó como osteoide (Fig. 6 B,

flecha blanca). El ancho del tejido osteoide en el sitio de control fue menor (Fig.6 A) que en elBMP-2/7 sitio

de transferencia de genes (Fig. 6 B). Además, se observaron numerosos osteoblastos; algunos de estos

osteoblastos en elBMP-2/7-los tejidos periodontales transferidos por genes tenían forma cúbica (Fig. 6D,

flecha negra). El doble etiquetado del hueso con calceína y tetraciclina permitió la comparación de las

tasas de aposición mineral (MAR) entre el hueso alveolar conBMP-2/7 transferencia de genes y el control

(con lacZ transferencia de genes); el etiquetado en el primero fue significativamente mayor que en el

segundo de 3 a 6 días después de la transferencia de genes (Fig.

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6E). Sin embargo, de 0 a 3 días después de la transferencia de genes, no pudimos detectar diferencias

significativas en MAR entreBMP-2/7 hueso alveolar de transferencia genética y lacZ hueso alveolar

genotransferido (Fig. 6E). Además, detectamos diferencias significativas en la MAR total de 0 a 6 días después

de la transferencia de genes. Por lo tanto,BMP-2/7 Se encontró que la transferencia de genes a los tejidos

periodontales aumentaba MAR (Fig. 6E).

DISCUSIÓN
En este estudio, transferimos con éxito un BMP-2/7 vector de expresión de doble gen en los tejidos

periodontales de ratas por en vivo electroporación, provocando así la producción exógena de BMP-2 y BMP-7

humanas en estos tejidos durante hasta 3 días después de la transferencia génica. No se observó producción

de BMP-2 o BMP-7 humana exógena 5 días después de la transferencia génica. Estos hallazgos indican que el

presenteBMP-2/7 El sistema de transferencia de genes permitió la producción a corto plazo de BMP-2 y BMP-7

en los tejidos periodontales diana de ratas. Es bien sabido que altas dosis o la aplicación a largo plazo de BMP-2

humana recombinante da como resultado una retroalimentación negativa en el procesador de inducción ósea.

32, 33, riesgo de cáncer34 o falla de la fijación del implante dental35. Por lo tanto, nuestroBMP-2/7 sistema de

entrega de genes para la transferencia del vector de expresión génica no viral a través de en vivo La

electroporación se utilizó con éxito para la producción a corto plazo de BMP exógenas, evitando así los riesgos

asociados con la retroalimentación negativa.

Aunque se observó una producción exógena limitada de BMP-2/7 en los tejidos periodontales durante los

primeros tres días después de la transferencia génica, se logró con éxito la formación de nuevo hueso alveolar.

Sin embargo,BMP-4 Transferencia de genes al ligamento periodontal por en vivo La electroporación no indujo la

formación de hueso nuevo.35. En nuestros estudios anteriores, elBMP-2/7 El vector de expresión génica se utilizó

con éxito para la producción de heterodímeros BMP-2/7, lo que resultó en una rápida inducción de la formación

de hueso ectópico en los músculos esqueléticos de ratas.23. Especulamos que el mayor potencial osteogénico de

los heterodímeros BMP-2/736 induce la formación de nuevo hueso alveolar a través de la producción exógena de

BMP-2/7 a corto plazo en los sitios objetivo.

En el actual sistema de transferencia de genes, en vivo La electroporación de los tejidos periodontales de

ratas se realizó a un voltaje de 50 V. Para la formación de hueso ectópico en los músculos esqueléticos de ratas,

realizamos en vivo electroporación a 100 V21. Aunque la estimulación eléctrica mediante terapia

electroconvulsiva (TEC) para el tratamiento de trastornos psiquiátricos se realiza a 100 V

37, 38, el voltaje eléctrico por debajo de este valor se considera más seguro. Cuando la transferencia de genes a

los tejidos periodontales de ratas se realizó a 100 V, no hubo indicios de quemaduras eléctricas; sin embargo,

se observó movimiento de las cabezas de las ratas en acompañamiento con el

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pulsos eléctricos39. Nuestro estudio anterior reveló que la eficiencia reducida de la transferencia de genes

resultante de la reducción de voltaje de 100 V a 50 V puede compensarse aumentando el número de pulsos en

potencias de 2, es decir, de 8 pulsos a 32 pulsos. En consecuencia, indujimos con éxito la formación de hueso

ectópico en ratas esqueléticas en las siguientes condiciones: 50 V, 50 mseg y 32 pulsos39. Cuando redujimos el

voltaje de 50 V a 25 V, no pudimos recuperar la eficiencia de la transferencia de genes para la inducción de la

formación de hueso ectópico en los músculos esqueléticos; sin embargo, cuando aplicamos los electrodos a la

fascia después de hacer una incisión en la piel, la eficiencia de la transferencia de genes se recuperó al

aumentar el tiempo de duración del pulso de 50 mseg a 200 mseg.39. Para aplicaciones clínicas, los estudios

futuros deben tener como objetivo lograr la transferencia de genes a voltajes inferiores a 50 V.

Examinamos los tejidos periodontales y la formación de hueso alveolar durante siete días después de una

transferencia genética. Durante este período, no se observaron efectos adversos, como quemaduras, necrosis, tumores

o desorción alveolar severa, en estos tejidos. Los hallazgos indican queBMP-2/7 la transferencia de genes puede

repetirse después de la evaluación de la formación de hueso alveolar mediante imágenes, en caso de que sea necesaria

una mayor producción de tejidos óseos masivos en el sitio objetivo. Sin embargo, se necesitan más estudios para la

observación a más largo plazo de los tejidos periodontales, el hueso alveolar y el estado general después deBMP-2/7

transferencia de genes a través de en vivo electroporación. En nuestros experimentos preliminares, no encontramos

ningún cambio en la densidad mineral ósea alveolar tres semanas despuésBMP-2/7 transferencia de genes (datos no

mostrados). Por lo tanto, para la aplicación clínica, se requiere el análisis no solo del sitio de destino, sino también del

estado general, durante períodos más largos para minimizar los riesgos asociados conBMP-2/7 transferencia de genes

a los tejidos periodontales a través de en vivo

electroporación.

CONCLUSIÓN
En el presente estudio, realizamos con éxito BMP-2/7 transferencia de genes, a través de en vivo

electroporación, en los tejidos periodontales de ratas. Las BMP-2 y BMP-7 exógenas fueron detectables

mediante análisis de inmunohistoquímica hasta 3 días después de la transferencia génica. Además, detectamos

la formación de nuevo hueso alveolar 5 días después de la transferencia génica. Los hallazgos demuestran que

la combinación de losBMP-2/7 vector no viral y en vivo La electroporación representa un candidato prometedor

como estrategia no quirúrgica para la terapia de regeneración ósea alveolar.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio fue financiado por subvenciones para la investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la

Ciencia (Investigación Básica B número 24300182) y la Fundación de Ciencias de la Salud de Daiwa.

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CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses potencial con respecto a la autoría y / o publicación de este

artículo.

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Autor para correspondencia: M. Kawai, Departamento de Farmacología, Universidad Dental de Osaka, 8-1

Kuzuhahanazono-cho, Hirakata, 573-1121, Osaka, Japón. Correo electrónico: kawai-m@cc.osaka-

dent.ac.jp. Envíe por fax: + 81-72-864-3158

Recibido el 23 de mayo de 2017; aceptado para su publicación el 24 de julio de 2017.

Figura 1.

Modelo propuesto de transferencia del gen BMP-2/7 con electroporación in vivo e inducción de la formación de hueso alveolar. A)

Transferencia del gen BMP-2/7 a los tejidos periodontales de ratas mediante electroporación in vivo. B) Esquema para la formación de

nuevo hueso alveolar por transferencia del gen BMP-2/7 a los tejidos periodontales: tras la transferencia de BMP-2/7 a los tejidos

periodontales, se produjeron heterodímeros de BMP-2/7 en el sitio diana. Los heterodímeros de BMP-2/7 indujeron la diferenciación de

células madre alrededor del sitio diana en células osteogénicas.

Figura 2.

Un día después de la transferencia del gen BMP-2/7 a los tejidos periodontales. A, B) La tinción con hematoxilina y eosina

(H&E) se realizó en el sitio de control de los tejidos periodontales de rata. F, G) Tinción H&E para el sitio donde se transfirió el

gen BMP-2/7 a los tejidos periodontales. C) Inmunohistoquímica (IHC) para CD68 en el sitio de control. H) IHC para CD68 en el

sitio de transferencia del gen BMP-2/7. D) IHC para BMP-2 humana en los sitios de control. MI) BMP-7 en los sitios de control.

Yo, j) Sitios de transferencia del gen BMP-2/7. I) IHC para BMP-2 humana. J) IHC para BMP-7 humana; el aumento original para

A y F fue×4, mientras que para el resto fue ×10.

Figura 3.

Tres días después de la transferencia del gen BMP-2/7 a los tejidos periodontales. A, B) Tinción H&E en los tejidos

periodontales de ratas en el sitio de control. F, G) Tinción H&E de tejidos periodontales transferidos por el gen BMP-2/7. C) IHC

para CD68 en el sitio de control. H) IHC para CD68 en el sitio de transferencia del gen BMP-2/7. D, E) IHC para BMP-2 o BMP-7

humana en los sitios de control. Yo, j) IHC para BMP-2 o BMP-7 humana en los sitios de transferencia del gen BMP-2/7; el

aumento original para A y F fue×4, mientras que para el resto fue ×10.

Figura 4.

Cinco días después de la transferencia del gen BMP-2/7 a los tejidos periodontales. A, B) Tinción con H&E en los tejidos periodontales

de ratas en los sitios de control. F, G) Tinción H&E de tejidos periodontales transferidos por el gen BMP-2/7. Las flechas negras

indicaban tejidos óseos alveolares recién formados.C, D, E) IHC para ALP en los sitios de control. H, yo, J)

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IHC para ALP en los sitios de transferencia del gen BMP-2/7; el aumento original fue× 4 para A, C, F y H; ×

10 para B, D, G e I; y×20 para E y J.

Figura 5.

Siete días después de la transferencia del gen BMP-2/7 a los tejidos periodontales. A, B) Tinción H&E de los tejidos

periodontales de ratas en los sitios de control F, G) Tinción H&E de tejidos periodontales transferidos por el gen BMP-2/7; las

flechas negras muestran tejidos óseos alveolares fusionados.C, D, E) IHC para ALP en los sitios de control H, yo, J) IHC para

ALP en los sitios de transferencia del gen BMP-2/7; el aumento original fue× 4 para A, C, F y H; × 10 para B, D, G e I; y× 20 para

E y J.

Figura 6.

Cambios en la morfología ósea y tasas de aposición mineral durante el período de siete días. A) Doble tinción ósea con calceína

(color verde) y tetraciclina (color amarillo) en los tejidos periodontales transferidos por el gen lacZ como control B) Doble tinción

ósea de tejidos periodontales transferidos por el gen BMP-2/7; la flecha blanca representa el osteoide.C) Tinción ósea de

Villanueva de tejidos periodontales transferidos por el gen lacZ D) Tinción del hueso Villanueva de tejidos periodontales

transferidos por el gen BMP-2/7; la flecha negra muestra los osteoblastos cuboidales. El aumento original en cada caso fue× 10.

MI) Tasas de aposición mineral (MAR) del hueso alveolar: MAR del hueso alveolar para el control (gen lacZ transferido a los

tejidos periodontales) (color azul) y se muestran los grupos de transferencia BMP-2/7 (color rojo).

#
Kurea, Osaka, Japón

**
Ohta Inc., Okayama, Japón

† † Sigma, San Luis, MO

‡ ‡ BD Pharmingen, San Diego, CA

§§ Takara, Shiga, Japón

‖‖Abcam, Cambridge, Reino Unido

¶¶Sondas moleculares, Leiden, Países Bajos

##
Epson, Tokio, Japón

***
Sigma-Aldrich, Tokio, Japón

††† Marumo, Tokio, Japón

‡ ‡ ‡Wako, Osaka, Japón

§§§ Olympus, Tokio, Japón

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