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AR T Í C U LO OR I G I NAL

MicroRNA-21 promueve el movimiento dental ortodóncico

modulando el equilibrio RANKL/OPG en células T

Lili Wu1 | Yingying Su2 | Feiran Lin1 | Siying Zhu1 | Jingyi Wang3 | Yanan Hou4 | L i l i
Wu
Juan Du1 | Yi Liu 1 | Lijia Guo 5

Beijing Baiqianwan Talents Project, Grant/ A w a r d N u m b e r : 2017A17; Beijing Municipal Administration

1Laboratoriode Regeneración Tisular
of Hospitals' Ascent Plan, Grant/Award Number: DFL20181501
e Inmunología y Departamento de
Periodoncia, Laboratorio Clave de
Regeneración y Función Dental de
Pekín
Reconstrucción, Facultad de Estomatología,
Capital Medical University, Pekín, China
2Departamento de Estomatología, Hospital
Tiantan de Pekín, Universidad Médica de la
Capital, Pekín, China
3Facultad de Odontología, Universidad de
Pensilvania, Filadelfia, PA, EE.UU.
4Departamento de Ortodoncia, Facultad de
Estomatología del Tercer Centro Dental,
Universidad de Pekín, Pekín, China
5Departamento de Ortodoncia, Facultad
de Estomatología, Capital Medical
University, Pekín, China

Correspondencia
Lijia Guo, Departamento de Ortodoncia,
Facultad de Estomatología, Capital Medical
University, Tian Tan Xi Li No.4, Pekín
100050, China.
Correo electrónico: Orthoest@163.com

Información sobre financiación

Fundación Nacional de Ciencias
Naturales de China, número de
subvención/concesión: 81600891 y
81974149; Comisión Municipal de Ciencia
y Tecnología de Pekín, número de
subvención/concesión:
Z161100000516203; Programa Juvenil
de la Autoridad de Hospitales de Pekín,
Número de subvención/concesión:
QML20181501;
Beijing Natural Science Foundation, Grant/
Award Number: 7172087; The Capital
Health Research and Development of
Special, Grant/Award Number: 2016-2-
2141; Beijing Municipal Administration of
Hospitals Clinical Medicine Development,
Grant/Award Number: ZYLX201703;
 resistente al tartrato para analizar el número de osteoclastos durante el movimiento
Resumen
Recibido: 18 de julio de 2019 | Revisado: 29 de octubre
dentario. | Aceptado:
de 2019Para examinar
10 de la expresión de RANKL y OPG se utilizó el ensayo
Objetivos: El presente estudio
noviembre de 2019 DOI: 10.1111/odi.13239 inmunoenzimático, la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa
se diseñó para investigar los y el análisis inmunohistoquímico.
efectos del micro-ARN-21 Resultados: En los ratones miR-21−/− , la distancia de movimiento de los dientes se
(miR-21) en el movimiento retrasó, el número de osteo- clastos disminuyó y la expresión sérica de RANKL se
dental ortodóncico. redujo fuertemente. MiR-21 promovió la secreción de RANKL a partir de células T
Métodos: El modelo de activadas. Además, las células T activadas podían rescatar parcialmente la
movimiento dentario ortodóncico disminución del movimiento ortodóncico de los dientes en los ratones miR-21−/− . Se
se estableció en ratones demostró que miR-21 promueve el movimiento ortodóncico de los dientes
C57BL/6 y miR-21−/− con o sin modulando el equilibrio RANKL/OPG en las células T.
implantación de células T Conclusiones: El impacto de miR-21 en el movimiento de los dientes se ha
activadas. Se realizaron análisis dilucidado mejor, lo que nos permite comprender mejor su función y sus
histológicos e histomorfométricos aplicaciones clínicas en ortodoncia.
mediante tinción con
hematoxilina-eosina. Se utilizó K E Y WO R D S
remodelación ósea, microARN 21, ortodoncia, osteoclastos, receptor activador del factor nuclear-
tinción de fosfato ácido
κB (RANKL), células T

Lili Wu y Yingying Su han contribuido a partes iguales a este artículo.

2019 John Wiley & Sons A/S. Publicado por John Wiley & Sons Ltd. Todos los derechos reservados

370 | wileyonlinelibrary.com/journal/odi Oral Diseases. 2020;26:370-380.

WU ET AL. | 371

1 | INTRODUCCIÓN
2.1 | Animales
El movimiento dental ortodóncico (MDO) es un proceso típico
Los ratones WT C57BL/6 (8 semanas de edad, machos) procedían
basado en la reconstrucción ósea. Cuando los dientes se someten a
directamente de Vital River Laboratories Co., Ltd (Pekín, China). Los
una fuerza mecánica, se produce una resorción ósea mediada por
ratones MiR-21−/− (8 semanas de edad, machos) fueron
osteoclastos (OC) en el lado comprimido, y la tensión conduce a la
proporcionados por el Institute of Laboratory
formación de hueso nuevo, lo que resulta en el movimiento
ortodóncico de los dientes (Davidovitch, Nicolay, Ngan y Shanfeld,
1988; Isola, Matarese, Cordasco, Perillo y Ramaglia, 2016). Dado
que los OC son inducidos por el receptor activador del ligando
nuclear fac- tor-κB (RANKL) (Walsh y Choi, 2014; Zupan, Jeras y
Marc, 2013), la inhibición de la expresión de RANKL podría atenuar
la reabsorción ósea. Las células T activadas promueven la
osteoclastogénesis a través de la expresión de RANKL in vitro
(Horwood et al., 1999; Kong et al., 1999). Recientemente, se han
identificado las células Th17 como subconjuntos de células T
generadoras de OC (Sato et al., 2006), y se ha informado de que la
IL-27 inhibe la diferenciación Th17 y la expresión de RANKL en las
células T (Kamiya et al., 2011). Además, se confirmó que varias
citocinas, como IFN-γ e IL-6, suprimen la expresión de RANKL en
células T (Kamiya et al., 2011; Takayanagi et al., 2000). Aunque se
ha demostrado que varios factores, como la IL-1β y el TNF-α,
inducen la expresión de RANKL en células T (Dai, Nishioka y
Yudoh, 2004; Horwood y otros, 1999), las moléculas que regulan la
expresión de RANKL en células T siguen siendo en gran medida
desconocidas.
Los microARN son pequeñas moléculas de ARN no codificante
(de aproximadamente 22 nucleótidos) que han demostrado regular
la d i f e r e n c i a c i ó n y la actividad de los osteoblastos y los OC
en la remodelación ósea (Gaur et al., 2010; Ji, Chen y Yu, 2016).
Estudios previos han demostrado que el microARN-21 (miR-21) se
expresa en gran medida en los precursores de los osteoblastos y
promueve la diferenciación de los osteoblastos inducida por RANKL
in vitro (Sugatani y Hruska, 2013; Sugatani, Vacher y Hruska, 2011).
Además, se informó de que miR-21 regula la osteoclastogénesis y
la apoptosis de OC inducida por estrógenos (Pitari et al., 2015;
Sugatani & Hruska, 2 0 1 3 ). Más recientemente, un estudio reveló
que la OTM en miR-
21 (miR-21−/− ) disminuyó notablemente en comparación con la de
los ratones de tipo salvaje (WT). Se demostró que miR-21 se dirige
a la muerte celular pro- gramada 4 (Pdcd4), que a su vez regula a la
baja C-fos y, finalmente, promueve la función OC (Chen et al.,
2016). Cada vez más estudios demostraron que miR-21 podía influir
en la respuesta inmunitaria (Pan et al., 2010; Wu et al., 2007),
mientras que la OTM también estaba controlada por el sistema
inmunitario (Yan et al., 2015).
Sin embargo, el efecto de miR-21 sobre la expresión de RANKL
en células T y su mecanismo subyacente siguen siendo en gran
parte desconocidos. En este caso, se planteó la hipótesis de que
miR-21 podría modular OTM no sólo mediante la inhibición directa
de la función de los OC, sino también mediante la regulación de la
expresión de RANKL en las células T activadas.

2 | MATERIALES Y MÉTODOS
372 | WU ET AL.

píxel. Los datos de micro-TC se evaluaron con el software de

Ciencias Animales, CAMS & PUMC (Pekín, China). Todos los
análisis de imágenes DataViewer.
experimentos se realizaron de acuerdo con el programa de
investigación animal aprobado por la institución.

2.2 | Modelo OTM

Los animales (n = 6/grupo, 20-25 g) fueron anestesiados con

hidrato de cloral (40 mg/kg), y se aplicó fuerza ortodóncica como
se describió anteriormente (Yan et al., 2015). Un resorte en espiral
de níquel-titanio (tamaño del alambre, 0,2 mm; diámetro y
longitud, 1 mm; Tomy International, Inc., Japón) proporcionó 30-35
g de fuerza (Taddei et al., 2012) entre el incisivo y el primer molar
maxilar izquierdo del ratón (Zeng et al., 2015), y se utilizó una
resina restauradora fluida (3M ESPE, MN, EE. UU.) para unir el
resorte (Figura 1b). Tras la cirugía, los ratones tuvieron libre
acceso a comida blanda y agua. Los ratones fueron sacrificados al
decimocuarto día de la intervención, tras lo cual se extrajeron los
maxilares y se recogió la sangre mediante s a n g r a d o retro-
orbital en tubos Eppendorf.

2.3 | Aislamiento de suero y ELISA

Tras 30 m i n u t o s de reposo, las muestras de sangre se

centrifugaron para
10 min a 4.000 rpm para separar el suero. El contenido de
RANKL soluble en el suero se midió mediante un kit ELISA de
cuanquinas TRANCE/RANK L/ TNFSF11 de ratón (R&D System,
MN, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Brevemente, se añadieron 50 μl de estándares de RANKL o
suero a una microplaca de poliestireno de 96 pocillos recubierta
con un anticuerpo policlonal específico para RANKL. El
anticuerpo secundario ligado a HRP permitió una lectura
colorimétrica sensible, y la concentración de RANKL se
determinó a partir de la curva stand- ard. El RANK y la
osteoprotegerina (OPG) también se detectaron mediante kits
Quantikine de ratón.

2.4 | Medición de la distancia de movimiento de los

dientes

La distancia más cercana entre la cresta distal-marginal del primer

molar maxilar izquierdo y la cresta mesial-marginal del segundo
molar se midió como distancia OTM utilizando un microscopio
estereoscópico (SWZ1000, Tokio, Japón).

2.5 | Tomografía microcomputarizada

Cuando se sacrificó a los ratones, se cortó la zona del molar

bilateral maxilar y se fijó en paraformaldehído al 4% (PFA) durante
48 horas. Se realizó un escáner micro-CT (Inveon, Siemens,
Alemania) en el espécimen. El escáner se ajustó a un voltaje de
80 kV, una corriente de 80 μA y una resolución de 8,89 μm por
WU ET AL. | 373

FI G U R E 1 La deficiencia de miR-21 inhibe la distancia del movimiento dentario ortodóncico (OTM). (a) La expresión de miR-21 se redujo
significativamente en los ratones miR-21−/− (p < 0,01). (b) Representación esquemática del procedimiento para establecer el modelo de ratón
OTM. El aparato de ortodoncia se fijó entre el primer molar maxilar izquierdo y el incisivo. A continuación, se aplicó a los ratones una fuerza
ortodóncica de 30 g durante 14 d. n = 6/grupo. (c) La distancia de movimiento del diente es la distancia más cercana entre la cresta distal-
marginal del primer molar maxilar izquierdo y la cresta mesial-marginal del segundo molar. Las imágenes del análisis estereomicroscópico
muestran el OTM de los ratones WT y miR-21−/− . (d) Las imágenes obtenidas mediante análisis de tomografía microcomputarizada
demostraron el OTM de los ratones WT y miR-21−/− . La distancia de movimiento en los ratones miR-21−/− fue menor que en los ratones WT.
(e) Las secciones teñidas con H&E mostraron la anchura del ligamento periodontal en el lado de presión en ratones miR-21−/− y WT. (f) En el
análisis por estereomicroscopía, la distancia de movimiento dentario de los ratones miR-21−/− fue inferior a la de los ratones WT (p < 0,05). (g)
La distancia de movimiento dental medida en el análisis de tomografía microcomputarizada mostró la inhibición de OTM por la deficiencia de
miR-21 (p < 0,01). (h) Las secciones teñidas con H&E también mostraron que la anchura del ligamento periodontal en el lado de presión en
ratones WT era menor que en ratones miR-21−/− (p < 0,05). Todos los resultados son representativos de al menos tres experimentos
independientes. Los datos mostrados representan la media ± desviación estándar (DE); *p < 0,05; **p < 0,01. Las barras de escala en d es
de 500 μm, y las barras de escala en e son de 100 μm. T = diente, PDL = ligamento periodontal, AB = hueso alveolar [La figura en color
puede verse en wileyonlinelibrary.com].

2.6 | Análisis histológico e histomorfométrico 2.7 | Inmunohistoquímica

Tras el escaneado micro-TC, los maxilares se descalcificaron con
EDTA al 10% (pH 8,0) y se incrustaron en parafina. A continuación,
el espécimen incrustado se cortó en secciones de 5 micras de
grosor, que se utilizaron para la tinción con hematoxilina-eosina
(H&E). La anchura del ligamento periodontal en el lado de presión
se estimó con el software ImageJ. Además, se realizó una tinción
con fosfato ácido tartrato-resistente (TRAP) como se ha descrito
previamente (Pitari et al., 2015). Las células TRAP positivas se
obtuvieron de la zona de la raíz dental distal del primer molar
maxilar izquierdo. Los resultados se muestran como el número de
OC en el lado de presión.
Para el análisis inmunohistoquímico, las secciones incluidas en
parafina se separaron secuencialmente en xileno, se deshidrataron
en etanol y se incubaron en tampón citrato (MXB Biotechnologies,
Fuzhou, China) durante 10 minutos a 90 °C para desenmascarar los
antígenos. A continuación, se utilizaron kits de tinción de células y
tejidos (R&D systems, Minnesota, EE.UU.) para detectar los
antígenos en las muestras según un protocolo estándar. Las
secciones se tiñeron durante la noche a 4 °C con un anticuerpo anti-
RANKL (1:200; ab45039, Abcam, Cambridge, Reino Unido) y un
anticuerpo anti-OPG (1:250; ab9986, Abcam, Cambridge, Reino
Unido). Las imágenes se obtuvieron utilizando un sistema de
microscopio de fluorescencia (OLYMPUS, Tokio, Japón).
374 | WU ET AL.

normalmente se utilizó el ANOVA de una vía con la prueba de Tukey,

2.8 | Aislamiento e infusión de células T
mientras que para las muestras con heteroscedasticidad se
emplearon las pruebas de Kruskal- Wallis. Un valor p inferior a 0,05
Se utilizó el kit de aislamiento de células T Pan de ratón II (Miltenyi
indicaba significación estadística. Además, p < 0,01 indicaba
Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) para obtener células T a
diferencias estadísticamente significativas, y p < 0,001 indicaba
partir de suspensiones de blastocitos de ratones WT. A
diferencias extremadamente significativas.
continuación, se cosecharon aproximadamente 1,0 × 106 células T
aisladas y se resuspendieron en 100 μl de solución salina
tamponada con fosfato (PBS), y esta suspensión se inyectó por vía
intravenosa en ratones miR-21−/− dos días antes del establecimiento
del modelo.

2.9 | Cultivo de células T CD4 +

Las células T CD4+ se purificaron a partir de los esplenocitos de

ratones WT o miR-21−/− utilizando el sistema de clasificación celular
magnética MIDI (MACS; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,
Alemania). Las células T aisladas se resuspendieron en medio
RPMI-1640 (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino
inactivado por calor (FBS), 2 mmol/L de glutamina, 100 U/ml de
penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y 20 mol/L de HEPES
(Invitrogen). Las células se activaron con anti-CD3 recubierto en
placa (2 μg/ml) (Gibco), así como con anti-CD28 soluble (1 μg/ml). A
continuación, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos
celulares para detectar la concentración de RANKL con los kits
ELISA correspondientes.

2.10 | Transfección de imitadores de MiR-21

Se sembraron en placas de 6 pocillos aproximadamente 1,0 × 106

células T CD4+ ingenuas procedentes de ratones miR-21−/− y, a
continuación, se transfectaron con miR-21 mim- ics (RiboBio,
Guangzhou, China). El cultivo se mantuvo en una atmósfera hu-
midificada a 37 °C y 5% de CO2 .

2.11 | Transcriptasa inversa en cadena de la polimerasa

(RT-PCR)

El ARN total se extrajo de las células T activadas utilizando el

reactivo TRIzol (Invitrogen, EE.UU.) y luego se transcribió
inversamente en ADNc mediante hexámeros aleatorios u oligo dT.
A continuación, el ADNc sirvió como molde para la PCR con el kit
QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen, Alemania); las secuencias
de cebadores se presentan en la Tabla 1. Todos los ensayos se
realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

2.12 | Análisis estadístico

Para el análisis de los datos se utilizó el programa estadístico

SPSS19.0. Las diferencias entre dos grupos se examinaron
mediante pruebas t de muestras independientes. Para la
comparación de grupos múltiples con muestras distribuidas
WU ET AL. | 375

TA B L E 1 Cebadores utilizados para la RT-PCR

Ratón RANKL Símbolo del gen Secuencia (5'→3')
(F)GCAGAAGGAACTG Los OC son reguladores clave del proceso de modelado óseo, y
CAACACA varios estudios han demostrado que las células T CD4+ están

(R)TGATGGTGAGGTGTGCAAA
estrechamente relacionadas con la dif- ferenciación de los OC
mediante la secreción de RANKL (Uda, Azab, Sun, Shi, & Pajevic,
T
2017; Walsh & Choi, 2014). Se investigó la posible
GAPDH de (F)TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
ratón
(R)AGGTCGGTGTGAACGGATTTG

Abreviaturas: F, avance; R, retroceso.

3 | RESULTADOS

3.1 | OTM y OC se inhibieron en ratones miR-21 −/−

Para determinar el efecto de miR-21 en el tratamiento ortodóncico,

establecimos un modelo de ratón de OTM (Figura 1b). Todos los
ratones fueron sacrificados en el día 14, y la distancia de
movimiento de los dientes se midió como se describió
anteriormente. Se observó que la distancia OTM de los ratones
miR-21−/− era notablemente menor que la de los ratones WT
(Figura 1c, f, p < 0,05), y los resultados del análisis de tomografía
microcomputarizada eran coherentes (Figura 1d, g, p < 0,01). Las
secciones teñidas con H&E también mostraron que la anchura del
ligamento periodontal en el lado de presión de los ratones WT era
inferior a la de los ratones miR-21−/− (Figura 1e, h, p < 0,05).
Además, el número de OC disminuyó en los ratones miR-21−/−
(Figura 2a-c, p < 0,01). Por lo tanto, nuestra hipótesis era que el
retraso de la OTM en los ratones miR-21−/− podría deberse a una
disfunción de los OC.

3.2 | La deficiencia de MiR-21 suprimió

constitutivamente
Expresión de RANKL en ratones miR-21 −/−

El eje OPG/RANKL/RANK es de vital importancia para la

inmunidad ósea y la remodelación ósea (Jiang et al., 2015; Yan et
al., 2015). Para examinar si miR-21 influye en los niveles de
expresión de O P G / R A N K L / R A N K dirigiéndose a
las células T activadas, medimos sus concentraciones en el suero
sanguíneo. La concentración sérica de RANKL en los ratones
miR-21−/− disminuyó significativamente en comparación con la de
los ratones WT, y la distancia del movimiento dentario se redujo
aún más (Figura 2d, p < 0,05). Los niveles de expresión de OPG y
RANK no fueron obviamente diferentes entre los ratones miR-21−/−
y WT en lo que respecta al OTM (Figura 2e, f, p > 0,05). Los
resultados mostraron que la deficiencia de miR-21 bloqueaba de
forma constitutiva la expresión de RANKL y disminuía la relación
RANKL/OPG.

3.3 | MiR-21 promovió la activación de células T

secreción de RANKL
376 | WU ET AL.

(a) (b) (c)

(i) (ii) (i) (ii)

(d) (e) (f)

FI G U R E 2 La deficiencia de miR-21 inhibe la diferenciación de los osteoclastos (OC). (a-c) El número de OC disminuyó en el lado de
presión en los ratones miR-21−/− (p < 0,01). (d) La expresión sérica de RANKL en los ratones miR-21−/− disminuyó significativamente en
comparación con la de los ratones WT (p < 0,05). (e-f) Para examinar si miR-21 puede influir en los niveles de OPG/RANKL/RANK
dirigiéndose a las células T activadas, medimos sus concentraciones en el suero sanguíneo. Las concentraciones de OPG y RANK en
suero no fueron obviamente diferentes entre los ratones miR-21−/− y WT con respecto al OTM. (p > .05). Todos los resultados son
representativos de al menos tres experimentos independientes. Los datos mostrados representan la media ± desviación estándar (DE); *p
< .05; **p < .01. Las barras de escala en a-i y b-i son de 200 μm, y las barras de escala en a-ii y b-ii son de 50 μm.
T = diente, AB = hueso alveolar [La figura en color puede verse en wileyonlinelibrary.com].

FI G U R E 3 MiR-21 promueve la
secreción de RANKL por células T
activadas. (a) La expresión de RANKL
disminuyó en los ratones miR-21−/− ,
según se evaluó mediante RT-PCR (p
< 0,05). (b) En comparación con los
ratones WT, la producción de RANKL
se inhibió en las células T CD4+ de los
ratones miR-21−/− (p < 0,05). (c) La
sobreexpresión de miR-21 en cultivos
de
Las células T CD4+ aumentaron la
secreción de RANKL (p < 0,05). (d) Las
células T CD4+ representaron
aproximadamente el 95% de la
población celular inyectada. Todos los
resultados son representativos de al
menos tres experimentos
independientes. Los datos mostrados
representan la media ± desviación
estándar (DE);
*p < 0,05; **p < 0,01 [La figura en color
puede consultarse en
wileyonlinelibrary.com].

de miR-21 (Figura 3b, p < 0,05). Además, la sobreexpresión de miR-

interacción entre las células T activadas y miR-21. Los resultados
21 en cultivos de células T CD4+ aumentó la secreción de RANKL
de la RT-PCR demostraron que el RANKL estaba regulado a la baja
(Figura 3c, p < 0,05). Estos resultados demostraron que miR-21
en los ratones miR-21−/− (Figura 3a, p < 0,05). Además, cultivamos
inducía la secreción de RANKL en células T activadas.
células T CD4+ aisladas de ratones WT y miR-21−/− por separado y
descubrimos q u e l a secreción de RANKL disminuía en ausencia
WU ET AL.
3.4 | T aliviaron parcialmente la disminución de OTM | 377

distancia en ratones miR-21 −/−

Para verificar si miR-21 puede influir en el OTM mediante células T,

inyectamos aproximadamente 1,0 × 106 células T en ratones miR-
21−/− dos días antes del establecimiento del modelo. También se
midió la distancia de movimiento de los dientes a los 14 días. La
observación macroscópica mostró que la distancia en los ratones
miR-21−/− con células T aumentaba en comparación con la de los
ratones miR-21−/− sin células T, y que la distancia de movimiento
de los dientes en estos últimos era mayor que en los ratones miR-
21 .
378 | WU ET AL.

(a)

(b)

(c)

FI G U R E 4 Las células T pueden aliviar parcialmente la disminución de la distancia OTM en ratones miR-21−/− . (a) La observación
macroscópica mostró que la distancia de movimiento en los ratones miR-21−/− con células T estaba aumentada en comparación con la de los
ratones miR-21−/− , y la distancia de movimiento en este último grupo era menor que la de los ratones WT (p < 0,01, p < 0,05, n = 6/grupo).
(b) El análisis de tomografía microcomputarizada mostró la distancia de movimiento tras la OTM en ratones. La distancia de movimiento en
los ratones miR-21−/− con células T fue mayor que en los ratones miR-21−/− sin células T y menor que en los ratones WT (p < 0,05, n =
6/grupo). (c) La tinción H&E también mostró que la anchura del ligamento periodontal en el lado de presión aumentaba en los ratones miR-
21−/− (p < 0,01), mientras que las células T podían aliviar parcialmente este aumento. Todos los resultados son representativos de al menos
tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar (DE), y la significación estadística se
muestra como *p < 0,05,
**p < .01. Las barras de escala en b son de 500 μm, y las barras de escala en c son de 100 μm. T = diente, PDL = ligamento periodontal, AB =
hueso alveolar [La figura en color puede verse en wileyonlinelibrary.com].

inmunohistoquímico, se observó una ex- presión positiva de RANKL

fue menor que en los ratones WT (Figura 4a, p < 0,01, p < 0,05).
en las células de la zona de remodelación ósea activa de los grupos
Además, el análisis de tomografía microcomputarizada mostró
WT y T (Figura 5f-g, p > 0,05).
resultados similares. La distancia en los ratones miR-21−/− con
células T era mayor que en los ratones miR-21−/− sin células T y
menor que en los ratones WT (Figura 4b, p < 0,01, p < 0,05). Además,
las células T aliviaron parcialmente la mayor anchura del ligamento
periodontal en el lado de presión en los ratones miR-21−/− , como
muestra la tinción H&E (Figura 4c, p < 0,01).

3.5 | Las células T aumentaron el número de OC en

ratones miR-21 −/−

Para analizar la razón de este cambio, contamos el número de

OC en el lado de presión de la raíz dental con un microscopio
óptico. Las cantidades de OC en el grupo WT, el grupo miR-21−/−
y el grupo de células T fueron significativamente diferentes (Figura
5d, p < 0,01). La cantidad de OCs en el grupo de células T fue
mucho mayor que en el grupo miR-21−/− pero menor que en el grupo
WT (Figura 5a-c). Además, tras la infusión de células T, aumentó la
concentración sérica de RANKL (Figura 5e, p < 0,05, p < 0,01). OPG
y RANK no mostraron diferencias claras entre los grupos WT,
miR-21−/− y células T (figura 5f-g, p > 0,05). A partir del análisis
WU ET AL.
el primer molar en ratones WT, pero se observó poca expresión | 379

positiva de RANKL en ratones miR-21

- −/− (Figura 6a,b, g, p < .01).
El porcentaje de células positivas aumentó significativamente en
los ratones miR-21−/− con células T en comparación con los
ratones miR-21−/− (Figura 6b,c,g, p < .05). No hubo diferencias
significativas en la expresión de OPG entre los ratones WT y miR-
21−/− con o sin células T ( Figura 6d-f, h , p > 0,05). A partir de
estos datos, demostramos que la relación RANKL/OPG aumentó
significativamente tras la infusión de células T y que los OC
maduros participaron en el OTM gracias a las células T.

4 | DISCUSIÓN

Los miARN son muy sensibles a la fuerza mecánica externa

durante la OTM y actúan como reguladores postranscripcionales
clave en el mantenimiento de la homeostasis ósea (Chang, Lin, Luo,
Wang y Han, 2015; Franceschetti, Dole, Kessler, Lee y Delany,
2014; Yu et al., 2017). Aquí demostramos que la resorción ósea
estaba protegida en ratones miR-21−/− durante el proceso de OTM.
Nuestros resultados indicaron que miR-21 puede modular la
expresión de RANKL durante la OTM, lo que se atribuyó a las
células T activadas.
La reabsorción ósea alveolar inducida por la fuerza
ortodóncica favorece la OTM y se considera el factor limitante
de la velocidad (Garlet et al.,
380 | WU ET AL.

(a) (b)
(i) (ii) (i) (ii)

(c) (d)
(i) (ii)

(e) (f) (g)

FI G U R E 5 Las células T pueden aumentar el número de osteoclastos en ratones miR-21−/− . (a-d) El número de osteoclastos en
ratones miR-21−/− con células T fue superior al de los ratones miR-21−/− sin células T, pero inferior al de los ratones WT (p < 0,01). (e) Tras
la infusión de células T, la concentración sérica de RANKL aumentó parcialmente (p < 0,05), pero siguió siendo inferior a la de los ratones
WT (p < 0,01). (f-g) La OPG y la RANK no presentaban diferencias evidentes entre los tres grupos. Todos los resultados son
representativos de al menos tres experimentos independientes. Los datos mostrados
representan la media ± desviación estándar (DE); *p < 0,05; **p < 0,01. Las barras de escala en a-i, b-i y c-i son de 200 μm, mientras que las
de a-ii, b-ii y c-ii
son 50 μm. T = diente, AB = hueso alveolar [La figura en color puede verse en wileyonlinelibrary.com].

documentaron que miR-21 podría apoyar la diferenciación de OC

2008; Huang, Williams y Kyrkanides, 2014). MiR-21 actúa
inducida por RANKL en
directamente sobre las células precursoras de la OC y mejora la
función de la OC dirigiéndose a Pdcd4 para mediar C-fos (Chen et
al., 2016) en la OTM. Además, se demostró previamente que la
deficiencia de miR-21 protege la masa ósea alveolar debido a su
inhibición de la función de los OC en condiciones fisiológicas
(Chang et al., 2015). Además, se cree que los OC se originan a
partir de precursores mononucleares a través del sistema
RANKL/OPG (Kanzaki et al., 2006, 2004). La remodelación ósea
fisiológica debe mantener una proporción equilibrada de
RANKL/OPG (Walsh y Choi, 2014). Los estudios han demostrado
que la producción de H2 S inducida por la fuerza podría regu- lar la
expresión de RANKL/OPG y, por tanto, controlar el proceso de OTM
(Liu et al., 2017; Pu & Hua, 2017). El RANKL es un regulador
indispensable de la formación y activación del OTM (Jones, Kong y
Penninger, 2002; Park, Lee y Lee, 2017). Además, estudios previos
WU AL.
vitroET (Sugatani y Hruska, 2013; Sugatani et al., 2011). MiR-21 | 381

parece mediar en la OTM ajustando la resorción ósea alveolar

(Chen et al., 2016). Sin embargo, hasta donde sabemos, no se ha
informado de la asociación entre miR-21 y RANKL en el tejido
óseo. Los estudios han demostrado que los ratones miR-21−/−
tienen un tipo de esqueleto normal durante el desarrollo (Hu et al.,
2017). Aquí, descubrimos que la deficiencia de miR-21 suprime
constitutivamente el movimiento de los dientes y el número de OC.
Tanto los experimentos in vivo como in vitro mostraron además
una disminución de la expresión de RANKL en ratones miR-21−/− ,
produciendo así un grave desequilibrio en la relación RANKL/OPG,
lo que indica que miR-21 promovió el movimiento dental a través
de RANKL/OPG. Aunque se sabe que el RANKL es sintetizado por
neutrófilos, monocitos, células dendríticas y, especialmente,
osteoblastos y células T activas (Hu et al., 2017; Neve, Corrado y
Cantatore, 2011; Uda et al., 2017), aún no se ha dilucidado cómo
miR-21 media en la expresión del RANKL.
382 | WU ET AL.

(a) (b) (c)

(i) (ii) (i) (ii) (i) (ii)

(d) (e) (f)

(i) (ii) (i) (ii) (i) (ii)

(g) (h)

FI G U R E 6 Las células T pueden aumentar parcialmente la expresión de RANKL en ratones miR-21−/− . (a-c) Imágenes representativas
teñidas inmunohistoquímicamente de hueso alveolar tras OTM en ratones. Se observaron células RANKL-positivas alrededor del lugar de
resorción ósea activa en ratones. Las formas rectangulares con líneas azules son los sitios representativos en a-i, b-i, y c-i. Las imágenes de
a-ii, b-ii y c-ii muestran vistas de gran aumento de las zonas de resorción ósea.
áreas recuadradas en azul. (d-f) Se observaron células OPG- positivas alrededor de la zona de remodelación ósea activa tras la OTM en
ratones. Las formas rectangulares con líneas verdes son los lugares representativos en d-i, e-i y f-i. Las imágenes de d-ii, e-ii y f-ii muestran
vistas de gran aumento de las zonas recuadradas en verde. (g) Semicuantificación del porcentaje de células RANKL positivas en la zona de
remodelación ósea activa del primer molar. El porcentaje de células positivas aumentó significativamente en los ratones miR-21−/− con
células T en comparación con el de los ratones miR-21−/− sin células T (p < 0,05, n = 6/grupo). La expresión de RANKL también fue baja en
los ratones miR-21−/− en comparación con los ratones WT (p < 0,01, n = 6/grupo). (h) Se observó la expresión de OPG en el lugar de
remodelado óseo activo en ratones WT, ratones miR-21−/− sin células T y ratones miR-21−/− con células T.
No se observaron diferencias claras entre los tres grupos. Todos los resultados son representativos de al menos tres experimentos
independientes. Los datos mostrados representan la media ± desviación estándar (DE); *p < 0,05; **p < 0,01. Las barras de escala en a-i, b-
i y c-i son de 100 μm, mientras que las de a-ii, b-ii y c-ii son de 20 μm [La figura en color puede verse en wileyonlinelibrary.com].

resorción ósea mediante la expresión de RANKL.

El sistema inmunitario tiene un efecto fundamental en la
resorción ósea, dando lugar al concepto de osteoinmunología. Las
células T contribuyen a la OTM a través de citocinas relacionadas
con Th1 (Yan et al., 2015), y la respuesta inmunitaria innata también
es necesaria para la OTM (He, Kou, Luo, et al., 2015; He, Kou,
Yang, et al., 2015). Además de la participación dominante del
RANKL en la resorción ósea, varios estudios han destacado los
vínculos entre el RANKL y las células inmunitarias. Las células T
activadas son importantes proveedoras de RANKL durante la
osteoclastogénesis inducida por la inflamación (Ke et al., 2018;
Neve et al., 2011). Las células T separadas del líquido sinovial de
pacientes con artritis reumato- toide (AR) expresaron altos niveles
de RANKL, y el cocultivo de estas células T autólogas y monocitos
podría resultar en osteo- clastogénesis (Kotake et al., 2 0 0 1 ).
Además, tanto las células T activadas como sus sobrenadantes
indujeron la osteoclastogénesis in vitro (Kong et al. , 1999), lo que
aumentó la probabilidad de que las células T activadas regularan la
WU ET AL.
(Oostlander et al., 2012). Además, durante la activación de células | 383

T, miR-21 aumentó significativamente tras la activación. La

inducción de miR-21 fue pronunciada durante la activación de
células T CD8+ y CD4+ (Teteloshvili et al., 2015). Además, se
confirmó que miR-21 es un regulador principal de las respuestas
Th1 frente a Th2 (Lu et al., 2011; Lu, Munitz y Rothenberg, 2009).
Así pues, m i R - 2 1 está estrechamente relacionado con las
células T CD4+ en las respuestas inmunitarias, y el sistema
inmunitario y la inflamación desempeñan papeles importantes en
el OTM (Jiang et a l ., 2015; Yan et al., 2015). Sin embargo, se
dispone de escasa información sobre los efectos de miR-21 en los
niveles de RANKL en las células T activadas durante la O T M . En
nuestro estudio, las c é l u l a s T activadas se infundieron por vía
intravenosa en ratones miR-21−/− y atenuaron en parte la
disminución de la distancia OTM y la expresión de RANKL/ OPG
en ratones miR-21−/− . Además, descubrimos que la supresión de
miR-21 suprimía notablemente tanto la ex- presión de la superficie
celular como la secreción de RANKL en células T CD4+ activadas
en ratones con miR-21.
384 | WU ET AL.
vitro. Aunque no podemos negar la participación de los
osteoblastos y otras células en la expresión de RANKL, nuestros
datos in vivo e in vitro sugieren que las células T activadas
potencian la inhibición de la relación RANKL/OPG y la
diferenciación de OC mediada por miR-21−/− , contribuyendo así
al OTM. Así pues, en el futuro deberán realizarse estudios con
otras células para determinar el papel potencial de miR-21 en el
movimiento dentario.
5 | CONCLUSIÓN
La deficiencia de miR-21 impidió la resorción ósea alveolar y
bloqueó la pérdida ósea maxilar inducida por la fuerza ortodóncica
durante la OTM. El deterioro de la capacidad de osteoclastogénesis
se debió en parte a la reducción de los niveles de RANKL en los
ratones miR-21−/− . Este hallazgo sugiere que miR-21 no sólo puede
mejorar directamente los OC a través de la vía Pdcd4/C- fos, sino
que también influye en el nivel de RANKL secretado por las células
T y mejora la diferenciación de los OC. Se n e c e s i t a n más
estudios para determinar cómo miR-21 regula el RANKL y los
mecanismos moleculares implicados en la OTM. Nuestros
resultados sugieren que miR-21 es esencial para la diferenciación
de OC porque miR-21 promueve la diferenciación de OC de
f o r m a directa e indirecta. Estos hallazgos pueden ser importantes
para nuestra comprensión y aplicaciones clínicas del
m o v i m i e n t o dentario.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación
Nacional de Ciencias Naturales de China (81600891 a L.G,
81974149 a Y . L), Beijing Municipal Science & Technology
Commission (Z161100000516203 a L.G), Beijing Hospitals Authority
Youth Programme (QML20181501), Beijing Dongcheng Excellent
Talent (a L.G), la Beijing Natural Science Foundation (7172087 a
Y.L), The Capital Health Research and Development of Special
(2016-2-2141 a Y.L), el Beijing Municipal Administration of Hospitals
Clinical Medicine Development of Special Funding Support
(ZYLX201703 a Y.B), el Beijing Baiqianwan Talents Project
(2017A17 a Y.L), y el Beijing Municipal Administration of Hospitals'
Ascent Plan (DFL20181501 a Y.L). Los autores declaran que no
existen posibles conflictos de intereses en la autoría y/o publicación
de este artículo.
CONFLICTO DE INTERESES
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES
LW realizó la mayoría de los experimentos con la ayuda de YS, FL y
SZ. YS participó en la redacción del manuscrito. JW realizó la
instalación experimental y la coordinación. YH participó en el
análisis estadístico. JD ayudó a analizar los datos preliminares. YL
participó en el diseño del estudio y ayudó a redactar el manuscrito.
Lijia Guo concibió el estudio y revisó críticamente el manuscrito.
Todos los autores revisaron el manuscrito y aprobaron la versión
final.
APROBACIÓN Y CONSENTIMIENTO PARA PARTICIPAR
Realizamos el estudio siguiendo las directrices informadas
aprobadas por el Comité de Ética Animal de la Facultad de
Estomatología de la Capital Medical University (Pekín, China#2012-
x-53).
ORCID
Yi Liu https://orcid.org/0000-0002-4998-5547
Lijia Guo https://orcid.org/0000-0001-7537-2640
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