“Obtención Industrial de enzimas de origen microbiano”

Curso: Fundamento de biotecnología

Docente: Huayna Dueñas Luis Alberto
Integrantes:
❖ Luna Mezarina Leonardo Ernesto
❖ Maldonada Vilca Jhoselyn
❖ Paucar Sánchez Dahis Harieth
❖ Rios Villafane Yosari Shantal
❖ Valencia Zarate Luis Octavio
 ● Amilasas
¿Qué son las enzimas de origen
microbiano? ● Glucoamilasas
● Glucosa Isomerasas
Estas enzimas microbianas proceden de los ● Proteasas
microorganismo como las bacterias, arqueas y ● Pectinasas
hongos. La mayoría de estas enzimas microbianas
● Quitinasas
tienen aplicación en la biotecnología.
● Alginasa
Su obtención se realiza de forma extracelular, lo
● Lipasas
que permite que estas enzimas de origen
microbiano sean más específicas. ● Dnasas
Se debe de usar microorganismo no patógenos ni ● Esterasas
productores de toxinas.
 MECANISMOS DE BIOSÍNTESIS

MECANISMO DE INDUCCIÓN:

La mayor parte de las enzimas comerciales son

inducibles, es decir que necesitan de un sustrato para su
síntesis, este sustrato comúnmente es denominado
iniciador y según el modelo de Jacob y Monod, el
inductor permite la síntesis de la enzima al unirse con el
represor que bloquea al gen operador impidiendo así su
transcripción.
MECANISMO DE REPRENSIÓN:

Los mecanismo de reprensión en la síntesis de

enzimas permiten la inhibición de la síntesis de
alguna enzima específica, generalmente
inducibles, este proceso es denominado
represión catabólica.
Es un mecanismo mediante el cual la síntesis de
enzima se ve reprimida por la presencia de
productos finales de biosíntesis.
 Obtención industrial de las enzimas de
origen microbiano
Existen principalmente 4 etapas:

● Propagación de cultivos: Inicia en el laboratorio en un tubo de ensayo que contiene el

repique del microorganismo.
● Fermentación: Inicia con la fermentación con el material obtenido, se siembra en el tanque
inóculo, posteriormente se pasa a la fermentación.
● Procesos y operaciones de separación y purificación: Comprende las operaciones y
procesos de ceración y purificación de los productos (a. separación de insolubles por
filtración, centrifugación o decantación; b. separación primaria por extracción, absorción,
ultrafiltración; c. purificación por líquido - líquido o extracción a dos fases acuosas;
d. aislamiento del producto).
● Tratamiento de efluentes: Representa una etapa muy imprescindible, esto por ser
fundamental controlar la calidad del efluente.
 Ejemplo 1 Microorganismos productores de lipasa
de importancia médica:

Candida rugosa
Geotrichum candidum
Penicillium camembertii
Pseudomonas glumae
Chromobacterium viscosum
Pseudomonas cepacia
Lipasa Pseudomonas. sp. ATCC 21808
Rhizomucor miehei
Peso molecular 20 -60 k. D
Contienen 2 -15% de carbohidratos
Rhizopus spec.
p. H optimo = 5. 5 -8. 5 microbianas Humicola lanuginosa
T. optima = 30 -60 ºC Pseudomonas fluorescens
 Saccharomyces cerevisiae

Invertasa

- Acidas (pH 4.5-5.5)

- Neutras (pH cercano a 7)
- Alcalinas (pH 6.5-8.0)

Peso molecular 23 y 92 kDa

Extracción y ensayo de la actividad
invertasa de levadura de panadería
Calibrado de glucosa utilizando el método del DNS
A partir de una solución stock de glucosa 40 mM y por
dilución con agua destilada, preparar una gama de
soluciones del azúcar de distinta concentración, tal y
como se indica en la Tabla 1
Hacer las diluciones en tubos de ensayo. Una vez
hechas las mezclas, agitar bien para homogeneizar
la solución
De cada tubo se toman 0,1 ml y se
transfieren a un tubo de vidrio con tapón
de rosca. Añadir 1 ml del reactivo DNS,
incubando posteriormente la mezcla en el
bloque seco a 100 ºC durante 10 minutos;
enfriar y determinar la absorbancia a 570
nm, utilizando como blanco la mezcla del
tubo 0. En el caso de que la absorbancia
de alguna muestra resultase excesiva,
diluir convenientemente con agua
destilada, mientras que si fuera
demasiado pequeña, repetir el ensayo
pero con una mayor cantidad de solución
de glucosa (p. ej. 0,2 ó 0,3 ml). Para
mayor fiabilidad de los resultados, trabajar
por duplicado.
NOTA:
El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-ácido
dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una
muestra, seguido de la determinación espectrofotométrica a 540nm de
los azúcares reductores
Calibrado de BSA mediante el método de Bradford
A partir de una solución de BSA 20 µg ml-1 en agua
destilada y por dilución en agua, preparar una gama
de soluciones de diferente concentración de BSA,
según se indica en la Tabla 2
Hacer las diluciones en tubos de ensayo
A 0,5 ml de la solución de BSA de diferentes
concentraciones, preparadas según se ha indicado en
la Tabla 2, añadir 0,5 ml del reactivo de Bradford (hacer
la mezcla en la misma cubeta de medida del
espectrofotómetro). Agitar la mezcla (por inversión de la
cubeta, una vez se ha tapado con nescofilm) y
transcurridos unos 10 minutos determinar la
absorbancia a 595 nm frente al blanco (tubo 0).
Obtención de un extracto crudo de invertasa de
levadura de panadería
Suspender 1 g de preparado liofilizado de levadura
en 200 ml de tampón de extracción (tampón acetato
0,1 M, pH 5,0, en NaCl 0,5 M). Agitar la mezcla
durante 15 min (puede ayudarse la extracción
mediante sonicación de la suspensión u
homogeneización de la misma), centrifugar y tomar el
sobrenadante como extracto enzimático. El extracto
enzimático, cuando no se esté utilizando, se
guardará en frío (frigorífico).
NOTA:
Albúmina de suero bovino o ASB (más conocida por sus siglas en
inglés, BSA)
Ensayo de la actividad invertasa del extracto crudo
Preparar en tubos de ensayo las mezclas de reacción
(4 en total, 1 blanco de sustrato, 1 blanco de enzima y
2 problemas) que se indican en la Tabla 3.
Los tubos con los blancos y problemas se
incubarán a 55 ºC durante 15 minutos, para que la
actividad invertasa presente en el extracto hidrolice
la sacarosa. Pasado el periodo de incubación,
detener la reacción sumergiendo los tubos en un
baño de hielo picado. Tomar 0,1 ml de cada tubo y
pasarlos a tubos de ensayo con tapón de rosca,
analizándose el contenido de azúcares reductores
por el método DNS (ver apartado 3.1). A partir de
los valores de absorbancia de los ensayos
problema, descontados el valor de los blancos,
determinar la actividad invertasa del extracto. En el
caso de que la absorbancia fuera muy pequeña,
repetir el ensayo DNS con una mayor cantidad de
muestra de incubación (por ejemplo 0,2 ó 0,3 ml).
En el caso de que la absorbancia sea excesiva,
repetir la experiencia diluyendo el extracto
enzimático convenientemente (dilución 1:2 ó 1:3,
etc.).
Precipitación con sulfato amónico
Dos alícuotas de 20 ml de extracto crudo se llevarán,
respectivamente, al 40% y 80% de saturación con
sulfato amónico. La sal se añadirá en forma finamente
pulverizada y con agitación para favorecer su
disolución. Una vez que se haya disuelto la sal, dejar
en reposo y en frío durante 45 min. Pasado este
tiempo, separar por centrifugación el precipitado
obtenido del sobrenadante, anotando el volumen de
éste. Los pellas P1 (40% saturación) y P2 (80%
saturación) se redisolverán en un volumen
determinado (entre 5 y 10 ml) de tampón acetato 0,1 M
(pH 5,0). Una vez completada la redisolución, medir los
volúmenes obtenidos.
Desalado de las fracciones proteicas y análisis
de las mismas
Alícuotas de 2,5 ml de cada una de las cuatro fracciones
proteicas obtenidas de la precipitación con sulfato amónico
(soluciones de P1 y P2, y los sobrenadantes de tales
precipitaciones, respectivamente S1 y S2) se desalarán
mediante cromatografía en columna de Sephadex G-25
(columna PD-10), que se realizará de acuerdo con las
instrucciones siguientes:
1. Retirar la tapa superior de la columna y verter el exceso de
líquido
2. Retirar el tapón inferior
3. Pasar por la columna 25 ml de tampón acetato 0,1 M (pH
4,5) para equilibrarla
4. Aplicar a la columna 2,5 ml de la muestra a desalar, e
incorporar este volumen a la columna, desechando el
eluyente
5. Una vez incorporada la muestra en la columna, eluir con
3,5 ml de tampón, recogiendo ese volumen de eluyente
6. Lavar la columna con 25 ml de tampón de elución
7. Añadir 2 ml de tampón y tapar los extremos superior e
inferior de la columna Las muestras ya desaladas se
analizarán para actividad invertasa y contenido de proteína.
Con estos valores se construirá una tabla de purificación, tal
como se indica en la Tabla 2.
RESULTADOS ESPERADOS

Figura 1. Curva patrón para el análisis de glucosa por el método de DNS. Muestras (0,1 ml) conteniendo las
concentraciones de glucosa indicadas en la Tabla inserta recibieron 1 ml de reactivo de DNS y, tras
calentamiento a 100 ºC durante 10 min, se analizaron espectrofotométricamente a 570 nm. Los valores
representados son medias ± DE de muestras por duplicado de seis experiencias independientes.
De la Figura 1 puede concluirse que se cumple la ley de Lambert-Beer en todo el rango (0-40 mM) de
concentraciones de glucosa ensayado, pudiéndose deducir un coeficiente de extinción molar (εm) de 0,0283
mM–1cm–1

NOTA:
la ley de Lambert-Beer relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado
 Figura 2. Curva patrón para el análisis de proteína por el método de Bradford. Muestras (0,5 ml) conteniendo las
concentraciones de BSA indicadas en la Tabla inserta recibieron 0,5 ml de reactivo de Bradford y, tras mezcla y reposo
durante 10 min, se analizaron espectrofotométricamente a 595 nm. Los valores representados son medias ± DE de
muestras por duplicado de nueve experiencias independientes.
De la Figura 2 puede concluirse que, de forma menos satisfactoria que en el caso anterior, se cumple la ley de Lambert-
Beer en todo el rango (0-20 µg ml–1) de concentraciones de BSA ensayado, pudiéndose deducir un coeficiente de
extinción específico (εs) de 0,0261 µg–1 ml cm–1
Para el extracto crudo, el ensayo de actividad correspondiente a un experimento tipo originó lecturas de A570 de 0,81 ± 0,08 (frente
al blanco de sustrato) y de 0,77 ± 0,04 (frente al blanco de enzima). Usando la media de ambos valores, la actividad del extracto
puede cifrarse en 11267,4 nkat ml-1. Para la determinación de proteína, 25 µl del extracto crudo anterior, tras su dilución a 0,5 ml
con agua desionizada, produjo en el ensayo de Bradford una lectura de A595 de 0,35 ± 0,02. De los datos anteriores se deduce
una actividad específica del extracto de 5,42 kat Kg-1 proteína.
 PRODUCCIÓN DE ENZIMAS EXTRACELULARES POR BACTERIAS AISLADAS
DE INVERTEBRADOS MARINOS
Jorge León, Fabiola Pellón, Verónica Unda, Janeth David,
César Anaya y Victoria Mendoza *
 
INTRODUCCIÓN:

Para poder lograr la obtención de las enzimas microbianas, hablamos de ambientes

marinos, por lo que son muy provechosos para estás, por ello la búsqueda y
aislamiento de cepas de bacterias nativas productoras de substancias bioactivas se
realizó a partir de diversas muestras. Entre estas substancias destacan las "Enzimas
Extracelulares" (EEC), cuyo desarrollo en el sector industrial se ha producido en
forma explosiva en los últimos años.

Las enzimas microbianas procedentes de microorganismos de ambientes acuáticos

incluyen amilasas, glucamilasas, glucosaisomerasas, proteasas, pectinasas y otros
como agarasas, quitinasas, alginasas, lipasas, Dnasas y esterasas. La mayoría de
estas enzimas tienen aplicación biotecnológica, especialmente en la industria
alimentaria.
OBJETIVO GENERAL: 
● Seleccionar cepas nativas de bacterias marinas hiperproductoras de EEC.
UBICACIÓN:
⮚ Estas muestras de invertebrados intermareales y bentónicos fueron recolectadas en la
Bahía de Ancón ("San Francisco" y "Punta LA CRUZ", respectivamente).
⮚ Asimismo, muestras de Argopecten purpuratus "concha de abanico" y Crassostrea
gigas "ostra" fueron recolectadas en las zonas de cultivo "El Carbón" y "La Tiza"
(Bahía de Pucusana) y en la Isla San Lorenzo (Callao).
⮚ Los organismos intermareales y bentónicos fueron obtenidos mediante recolección
directa y por buceo respectivamente,
⮚ Las muestras de Argopecten purpuratus y Crassostrea gigas fueron tomadas
directamente de las "linternas de cultivo".

Las muestras fueron procesadas según la metodología descrita por León (1996), utilizando el Agar
Marino de ZoBell (AM) como medio de aislamiento bacteriano.
MATERIALES Y MÉTODOS:

Para la selección de cepas productoras de EEC, se utilizó el método de formación de "macrocolonias" .

 El AM sirvió como medio base al cual se incorporaron los sustratos

correspondientes:
● (almidón, caseína, tween-80, lecitina y DNA),en una concentración de 1%
(p/p).
● La actividad frente a la gelatina fue evaluada en el medio AM con adición de
gelatina microbiológica al 12% (p/p).
● Las cepas cultivadas fueron Incubadas a 22 oC hasta por 10 días.

La actividad enzimática de las cepas sobre los substratos en prueba fue determinada
por la presencia y tamaño de las zonas de hidrólisis alrededor de las macrocolonias.
Asimismo, 6 cepas aisladas de Argopecten purpuratits y 4 de Crassostrea gigas en
cultivos fueron identificadas a nivel de género utilizando esquemas de identificación
para bacterias marinas según Oliver (1982) y Sawabe et al. (1995).
A
Se aislaron un total de 102 cepas de bacterias (45 provienen de organismos intermareales,47
de bentónicos, 6 de Argopecten purpuratus y 4 de Crassostrea gigas).

Las cuales fueron evaluadas por su capacidad de producir substancias con actividad
multienzimática. La acción enzimática de las cepas en estudio sobre diversos substratos
muestra resultados homogéneos.
Sin embargo, cabe resaltar que las cepas provenientes de Semimytilus algosus "chorito negro"
(cepa Chol-AI) y de Tetrapigus niger "erizo negro" (cepas Eri5-AI y Eri7-AI) cuentan con
mejor actividad multienzimática, llegando inclusive a actuar frente a 5 substratos diferentes,

Siendo las más importantes la actividad amilolítica (amilasa), proteolítica (caseinasa) y

lipolítica (tween esterasa). Las cepas provenientes de Argopecten purpuratus de vida
libre (cepa Cab3-AII), 

Tetrapigits niger "erizo negro" (cepas Er12-AII, Er13-AII) y Thais chocolata "caracol"
(cepa Cch1-AII) mostraron igualmente mayor actividad multienzimática (Tabla 2).
RESULTADOS:
Introducción:
La celulosa es la fuente de carbono renovable más abundante de la Tierra. Sin embargo, la estructura de
este polímero constituye una barrera física y química para acceder al carbono, lo que ha limitado el
aprovechamiento del mismo. En la naturaleza, un pequeño porcentaje de microorganismos pueden
degradarla a través de la expresión de celulasas. Dentro de estos microorganismos, uno de los grupos más
activos y eficientes son los hongos filamentosos.
Objetivo:
Describir las similitudes y diferencias de los mecanismos de acción de las celulasas y los mecanismos de
regulación de su expresión para 3 de los modelos de hongos filamentosos celulíticos más estudiados:
Trichoderma reesei, Aspergillus niger y Aspergillus nidulans, y para un modelo recientemente descrito,
Neurospora crassa.
Resultados:
Se encontró que los mecanismos de acción enzimática son muy similares en todos los modelos estudiados,
no así los mecanismos de regulación génica. Entender las particularidades de cada sistema es fundamental
en el desarrollo de estrategias para la mejora de la producción de celulasas, ya sea proporcionando el
ambiente óptimo o aumentando la expresión en estos microorganismos mediante ingeniería genética.
Se ha predicho que el
genoma de N. crassa
contiene 171 genes que
codifican para
glucosilhidrolasas, un
15,5% menos que T.
reesei; sin embargo, de
estos genes, 34 codifican
para celulasas
Dentro de este grupo, T. reesei, A. niger, A. nidulans y, recientemente, N. crassa han sido extensamente estudiados con el fin de comprender no solamente los mecanismos
de hidrólisis enzimática, sino también la regulación de la expresión de los genes que codifican para estas enzimas. Los resultados de estas investigaciones muestran que los
mecanismos de hidrólisis enzimática son muy similares en estos microorganismos, no así los mecanismos de regulación, en los que se encuentran similitudes y diferencias.
Una de las mayores similitudes entre T. reesei y A. niger/A. nidulans es la presencia de un factor transcripcional general (Xyr1/XlnR) responsable de la activación de la
transcripción del sistema bajo condiciones de inducción. Sin embargo, esta condición de inducción es diferente: mientras que en Aspergillus la mayoría de celulasas son
correguladas con las xilanasas a partir de una sola molécula inductora (D-xilosa), en T. reesei la inducción se da por soforosa o celobiosa de una manera independiente de
las xilanasas. Además, en T. reesei se han identificado otros reguladores positivos, Ace2 y Bgl1, cuyos ortólogos no han sido reportados en Aspergillus

Otra característica en común en estos sistemas es el fenómeno de represión catabólica, en donde el producto final de la hidrólisis enzimática es el directo responsable de la
regulación negativa a nivel transcripcional. Este mecanismo evita que el hongo sintetice una cantidad excesiva de celulasas cuando existe disponibilidad de otras fuentes
más fácilmente asimilables. En los 3 modelos estudiados, T. reesei, A. niger/A. nidulans y N. crassa, los genes ortólogos cre1/creA son los responsables de dicha regulación
Conclusiones:
Los resultados de estas investigaciones muestran que los mecanismos de hidrólisis enzimática son muy
similares en estos microorganismos, no así los mecanismos de regulación, en los que se encuentran
similitudes y diferencias. Una de las mayores similitudes entre T. reesei y A. niger/A. nidulans es la presencia
de un factor transcripcional general (Xyr1/XlnR) responsable de la activación de la transcripción del sistema
bajo condiciones de inducción. Sin embargo, esta condición de inducción es diferente: mientras que en
Aspergillus la mayoría de celulasas son correguladas con las xilanasas a partir de una sola molécula inductora
(D-xilosa), en T. reesei la inducción se da por soforosa o celobiosa de una manera independiente de las
xilanasas. Además, en T. reesei se han identificado otros reguladores positivos, Ace2 y Bgl1, cuyos ortólogos
no han sido reportados en Aspergillus. Por otra parte, el ortólogo de xyr1/xlnR en N. crassa no es necesario
para la expresión de celulasas en este microorganismo lo que demuestra que las especies de hongos han
desarrollado diferentes mecanismos en respuesta a los mismos inductores.
BIBLIOGRAFÍA

- León L. Pellón F. Unda V. Anaya C. & Mendoza V. (2000), produccion de enzimas estracelulares
por bacterias aisladas de inveryebrados marinos
https://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/biologia/v07_n2/produc_enzi.htm
- Rosero B. (2014), Obtención industrial de enzimas especificas
https://es.slideshare.net/estevenPLB/obtencion-industrial-de-enzimas-especificas-presentacion
- Puig, R. P. (2019, 6 julio). Lipasa: características, estructura, tipos, funciones. Lifeder.
https://www.lifeder.com/lipasa/
- Las Lipasas : Aplicaciones en Biotecnología. (2019, 24 abril). Las Lipasas.
https://slidetodoc.com/las-lipasas-aplicaciones-en-biotecnologa-definicin-una-lipasa/
- Jorge León. F - Fabiola Pellón, Verónica Unda -
Producción de Enzimas (unmsm.edu.pe)
- Tena Aldave, M., & Jorrín Novo, J. V. (2019). Extracción y ensayo de la actividad invertasa
de levadura de panadería. En Procesos Biotecnológicos (31.a ed., Vol. 1, pp. 242–252).
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba.
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/31%20INVERTASA%20ENSAYO.pdf
- https://smbb.mx/congresos%20smbb/morelia07/TRABAJOS/Area_III/Carteles/CIII-24.pdf
- (S/f-b). Recuperado el 6 de octubre de 2021, de
http://file:///C:/Users/ASUS/Downloads/S1130140614000138%20(1).pdf