INSTITUTO POLITECNICO

NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERIA QUIMICA E INDUSTRIAS

EXTRACTIVAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA INDUSTRIAL

ACADEMIA DE QUIMICA ANALITICA

OPTATIVA 3

LABORATORIO TECNICAS DE SEPRACION

Práctica 6.- Preparación de fase móvil para ser usada en HPLC e

Influencia de
la cantidad del analito en la respuesta del equipo HPLC

Dr. Luis E. Camacho Camacho

Velazquez Aguilar Alan Ignacio

3IM78
OBJETIVOS

➢ Realizar la filtración de fase móvil para almacenarla en el reservorio

correspondiente.

➢ Inyectar diferentes cantidades de analito para observar cómo afecta las

respuestas del HPLC.

➢ Realizar una calibración con los datos obtenidos.

➢ Simular la cuantificación de un analito de una muestra problema

INTRODUCCIÓN
A. Las propiedades fisicoquímicas de la cafeína, sus usos industriales y
alimenticios (o en bebidas)

La cafeína es una sustancia química (un

alcaloide del grupo de las xantinas, a la que
también pertenecen la teofilina del té, la
teobromina del chocolate, la guaranina de la
guaraná, la mateína del mate y también la kola y
el yopo) cuyo consumo tiene efectos
estimulantes sobre el sistema nervioso central
(estimula el estado de vigilia y la resistencia al
cansancio) y sobre el corazón (provoca
vasoconstricción).

Resulta muy útil para el tratamiento de ciertos tipos de cefaleas, asma bronquial y
cólicos de la vesícula biliar, pero su abuso produce arritmia cardíaca, insomnio y
dolor de cabeza. No se considera una droga en sentido legal, ni tampoco una
sustancia psicotrópica, pero sí produce un síndrome de abstinencia y posee una
actividad unas diez veces menor que la cocaína. Es un ingrediente principal o
accesorio de numerosos medicamentos, y su tolerancia es muy alta y se establece
muy rápidamente.

En estado puro la cafeina es un polvo blanco de sabor amargo, su solubilidad a 25

ºC es de 21 mg/ml y aumenta conforme aumenta la temperatura, su peso moluecular
es de 194.19 g/mol.

Es un estimulante que actua sobre el sistema nervioso central, incrementa la

actividad motora, el rendimiendo intelectual y disminuye la fatiga y el sueño. }
A dosis altas pueden
producir ansiedad y
disforia, asi como
trastornos del sueño.
La principal fuente de
cafeína es el café, y ese
probablemente sea el
primer producto con el que
asocia esta sustancia.

Pero también se encuentra

en el cacao, en suplementos que se venden para perder
peso y mejorar el rendimiento deportivo, el té, los refrescos, las bebidas
energéticas y en helados, tortas y una variedad de dulces.

También se puede encontrar en algunas medicinas y en ciertos cosméticos.

Determinar la cantidad exacta de mg de cafeína que contiene un producto es difícil
porque varía en función de la empresa que lo elabora y del tipo de alimento.
Por ejemplo, la cafeína que hay en el té preparado directamente con hojas es
distinta a la que se encuentra en una taza que se hizo con una de las bolsitas que
se encuentran en el supermercado.

A continuación, la referencia de la EFSA con respecto a los mg que contienen

alimentos con cafeína:

Taza de café colado de 200 ml 90 mg

Lata de bebida energética de 250 ml 80 mg
Taza de café negro (espresso) de 60 ml 80 mg
Taza de té negro de 220 ml 50 mg
Lata de refresco de 355 ml 50 mg
Barra de chocolate de leche de 50 g 10 mg

B. Cómo se modifica la respuesta de un cromatógrafo con respecto a la

cantidad de analito inyectado.

La muestra inyectada, puede originar una deformación de la banda cromatográfica

por dos motivos: la inyección de una masa excesiva de muestra puede llevar a una
sobrecarga de la columna, con la consiguiente pérdida de capacidad de separación;
este motivo de distorsión no tiene otra solución que inyectar masas menores de
muestra. Un segundo motivo de deformación de las bandas que, por otra parte,
suele ser el caso más frecuente es el de que, aunque la masa inyectada no sea
suficiente para sobrecargar la columna, la inyección de un volumen excesivo
provoque una pérdida de la eficacia del sistema.

Cuando se inyecta un determinado volumen de muestra, ésta ocupará en la cabeza

de la columna una cierta longitud. En el caso de una columna ideal, que no
ensanchase los picos, la banda cromatográfica a la salida de la columna tendría la
misma anchura que la banda inyectada; este ancho de banda inicial ocasionado por
la inyección, nunca se reducirá a su paso por la columna, sino que por el contrario
se hará mayor. Es evidente, en consecuencia, la necesidad de inyectar volúmenes
adecuados, así como de utilizar métodos capaces de proporcionar inyecciones de
alta calidad.

C. Averiguar por qué el área y el altura de pico cromatográfico son buenas

medidas para calibrar un cromatógrafo

Una vez conocida el área o la altura del pico que se pretende cuantificar es posible
conocer su masa o su concentración en la muestra inyectada si se conoce la curva
de calibración que relaciona la respuesta del detector con la cantidad de compuesto
inyectada.

Las concentraciones de un analito que pueden ser medidas en cada caso dependen
del rango dinámico del detector, una característica de cada combinación
detector/analito, que se define como el rango de concentraciones de soluto entre
las cuales el detector produce una respuesta dependiente de la concentración de
soluto que llega a él; el valor mínimo de este rango se corresponde con la
sensibilidad del detector, y el máximo con la concentración de soluto a partir de la
cual la respuesta del detector es constante (saturación). Dado que casi todos los
detectores presentan curvas de respuesta de tipo sigmoide, debe tenerse en cuenta
que lo más conveniente es trabajar, siempre que sea posible, dentro del rango
dinámico lineal del detector, que se define como la zona del rango dinámico en la
que la respuesta del detector es lineal frente a la concentración de soluto; las
cuantificaciones realizadas fuera del rango dinámico lineal deberían ser evitadas
en lo posible, realizándose únicamente en caso de trabajar con concentraciones
muy próximas al límite de sensibilidad del detector.
Calibración con respuesta lineal Calibración con respuesta exponencial

D. Investigar las propiedades que debe cumplir un liquido para ser usado
como fase móvil en HPLC

Fase móvil: Los solventes utilizados para análisis de HPLC deben cumplir con las
siguientes especificaciones.

➢ Alto grado de pureza, solventes grado HPLC

➢ Debe ser desgasificado, no pueden haber burbujas en el sistema que afecten
➢ la separación.
➢ Debe solubilizar la muestra.
➢ Tener baja reactividad
➢ Compatible con el detector, no debe generar ningún tipo de señal
➢ No puede evaporarse a la temperatura de trabajo
➢ Debe tener baja viscosidad para que fluya por todo el sistema.
➢ Debe ser seguro para el trabajo en el laboratorio, es decir no deben ser
➢ inflamables, ni muy volátiles.

Las fases móviles se pueden preparar a partir de varios solventes pero estos deben
ser miscibles entre ellos, deben formar una sola fase, si se preparara una fase móvil
a partir de varios solventes se debe hacer en material volumétrico limpio, además
los solventes se deben pasar por un filtro de 0.22 µm y 0.45 µm para eliminar
partículas y bacterias respectivamente y desgasificar.

En HPLC la fase móvil es la que gobierna la separación y esta compite con la fase
estacionaria para sacar los compuestos de la columna y finalmente obtener los
compuestos puros. Con la fase móvil se puede trabajar en dos formas de
elución: isocrática, en la cual la fase móvil puede ser un solvente puro o una mezcla
de solventes y esta permanece constante durante toda la corrida cromatográfica,
un típico sistema isocrático.

El otro sistema se llama gradiente y como su nombre lo indica la fase móvil cambia
durante la corrida, este método es útil para muestras que contienen componentes
con polaridades diversas. Mientras se da la separación la fuerza del eluyente se
incrementa, es decir la fase móvil ofrece mayor competencia a la fase estacionaria,
esto obliga la elución del compuesto que está más fuertemente retenido a la fase
estacionaria. El sistema de elución por gradiente puede ser de alta o baja presión.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
A. Escribir la secuencia de pasos que se deben seguir para realizar la
filtración de la fase móvil

1. Es necesario que todos los líquidos que entren al HPLC sean filtrados a
2. través de un filtro de al menos 0.45 micras.
3. Se conecta la pieza de conexión a vacío sobre el matraz, se coloca el filtro
de membrana y sobre la misma la pieza cilíndrica que retiene el disolvente
antes de la filtración
4. Se alinean bien y se sujeta con la pinza metálica
5. Para que el disolvente pase a través del filtro se crea vacío conectando una
bomba de vacío.
6. Se produce la succión
7. Se pone una pequeña cantidad de disolvente en la parte superior
8. Una vez que ya paso todo el disolvente por el filtro se desconecta el matraz
de la bomba de vacío
9. Se retira con cuidado la parte superior
10. Se homogeniza el interior del matraz
11. Una vez filtrado todo el disolvente se sacude el matraz para desprender el
aire disuelto
12. El vacío ayuda a desgasificar los disolventes
13. Se desconecta la bomba de vacío y los lavados de disolvente se guardan en
un recipiente de confinamiento ya que la única fase móvil que se puede tirar
a la tarja es agua de HPLC
14. Se vuelve a verter el resto del disolvente se repiten los mismos pasos
15. Y la fase móvil se vierte en el reservorio ya que se necesita usarlo enseguida.
16. Se debe tener cuidado al momento de abrir el reservorio ya que el filtro que
tiene adentro no debe de salir del nivel del líquido para no generar burbujas
 B. Hacer referencia a la práctica anterior debido a que en ella se menciona
el procedimiento para realizar el Encendido del equipo Flexar

En la practica 5: Encendido y apagado de un equipo de cromatografía de líquidos

de alta resolución, HPLC. Se describen a detalle los pasos para el encendido
correcto del equipo Flexar, Perkin Elmer.

C. Creación de un método de análisis usando el programa Chromera.

1. Una vez hecha la purga del equipo se subió flujos a las condiciones a las que
se va a trabajar y se procede a crear un método de análisis.

2. Se aprieta el apartado método para poder editar un método ya existente o se

crea un nuevo método en donde se puede poner nombre al método,
guardarlo en una carpeta y añadir una descripción de cuáles son las
características que tiene ese método y las notas con los parámetros
necesarios.

3. Se edita el método, editando el detector, los datos que recibe desde el

cromatógrafo por segundo y el tiempo final de 6 minutos para que se pueda
hacer el análisis, la longitud de onda variable y los eventos que se pueden
programar en el detector.
4. Después de trabajar con el detector se trabaja con la bomba la cual puede
trabajar de forma isocrática o de gradiente de fase móvil

5. Tiempo de equilibrio inicial de 30 minutos en ajustarse

6. Se ponen los parámetros de seguridad de la bomba como el límite máximo

de trabajo que es de 6 mil psi y una presión de cero psi cuando hay fuga

7. Establecer 2 pasos, el del tiempo de equilibrio y la corrida o análisis,

colocando la composición de A = 70% y B = 30%.

8. Una vez instalado el método se guarda y se puede instalar regresando a

run time y se corre con el análisis único o corrida simple (un solo análisis)

9. Se busca el método que se acaba de crear y se selecciona aplicar método

en donde se establecen todos los parámetros cromatográficos para que el
aparato modifique todo para que alcance los setpoint establecidos

10.Aparece una ventana que dice que está en el tiempo de equilibrio y me

indique cuando ya puedo inyectar cuando llegue a su tiempo de equilibrio
aparece otra ventana en donde dice que ya se puede inyectar.
D. Escribir el diagrama de bloques de cómo se usa una jeringa de
cromatografía para ingresar la muestra en el equipo Flexar.
 E. Escribir el diagrama de bloques de cómo se usa el programa Chromera
para obtener los datos contenidos en un cromatograma.

F. Hacer referencia a la práctica anterior debido a que en ella se menciona

el procedimiento para realizar el Apagado del equipo

En la practica 5: Encendido y apagado de un equipo de cromatografía de líquidos

de alta resolución, HPLC. Se describen a detalle los pasos para el apagado correcto
del equipo Flexar, Perkin Elmer.
REULTADOS EXPERIMENTALES
Las unidades correctas de área de pico son uA.s (micro unidades de absorbancia-segundo)
en algunas partes dice minuto pero es un error de escritura, las unidades de altura de pico
son uA (micro unidades de absorbancia) por lo que las unidades de A/h son: segundos

concentración tR (minutos) A(µA.s) H (µA)

mg/L
10 3.356 361272 36852
30 3.371 1115532 122462
50 3.387 1689220 186764

ANALISIS DE RESULTADOS
A. Graficar concentración vs tiempo de retención para analizar la
tendencia de los datos y deducir la razón de ese comportamiento

Se puede observar que el tiempo de retención aumenta conforme va

aumentando la concentración de la cafeína ya que al aumentar la cantidad de
analito aumenta el tamaño del pico y de la banda haciéndose más alto y más
ancho. La diferencia entre los 3 tiempos de retención no varía más que de un
segundo o dos por lo que se puede decir que el tiempo de retención de un
compuesto siempre va a ser el mismo independiente de la cantidad de analito
que se agregue ya que no aumenta es casi insignificante.
B. Graficar concentración vs Área de pico para analizar la tendencia de los
datos y deducir la razón de ese comportamiento.

Se puede observar que el área del pico aumenta conforme aumentamos la

cantidad de analito agregado ya que la banda que se forma de ese compuesto
dentro de la columna cromatográfica es más grande debido a mayor número de
moléculas.

C. Graficar concentración vs altura de pico para analizar la tendencia de

los datos y deducir la razón de ese comportamiento

La altura igual aumenta conforme aumenta la concentración debido a que al ser

más grande la banda y al haber más cantidad de moléculas el pico crece y se
puede observar que si crece de manera significativa ya que los puntos en la
gráfica están muy separados, existe mucha separación entre los 3 picos
(alturas).
 D. Graficar concentración vs (área/altura) para analizar la tendencia de los
datos y deducir la razón de ese comportamiento

Si la relación área sobre altura es muy variable se podría decir que el pico se
modifica de tamaño y se pueda deformar y no se parezca a los demás y eso quiere
decir que no estamos dentro de la linealidad que debe de tener una calibración.

CALCULOS
A. Utilizar el método de estándar externo para realizar la calibración del
equipo usando área y altura

Muestra problema: Área = 817320 µA.s Vol. Inyectado = 20 µL

Hacer la regresión lineal en la gráfica de área vs concentración.
y = 33199x + 59380
817320 = 33199 * (x) +59380
X = 22.8302 mg /L -------------Concentración = 22.8302 mg/L

𝑴𝒂𝒔𝒂 = 𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊𝒐𝒏 ∗ 𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏

𝒎𝒈
𝑴𝒂𝒔𝒂 = (𝟐𝟐. 𝟖𝟑𝟎𝟐 ) ∗ (𝟎. 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟐𝑳) = 𝟎. 𝟎𝟎𝟎𝟒𝟓𝟔𝟔 𝒎𝒈
𝑳

Al hacer la regresión lineal en la gráfica de altura vs concentración:

y = 3747.8x + 2925.3
16932 = 3747.8 (x) + 2925.3
x= 3.7373 mg /L------------------ Concentración = 3.7373 mg/L

𝑴𝒂𝒔𝒂 = 𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊𝒐𝒏 ∗ 𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏

𝒎𝒈
𝑴𝒂𝒔𝒂 = (𝟑. 𝟕𝟑𝟕𝟑 ) ∗ (𝟎. 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟐𝑳) = 𝟎. 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟕𝟒𝟕𝟓 𝒎𝒈
𝑳
CONCLUSIONES Y RECOMNDACIONES
Se cumplieron los objetivos de la practica ya que se conoció el procedimiento para
hacer el filtrado de la fase móvil para ser almacenada en el reservorio para poder
usarla en el equipo de HPLC para hacer un análisis, además de inyectar diferentes
cantidades de analito para ver cómo afecta la respuesta del equipo con respecto al
aumento de concentraciones de un cierto analito, y con los datos obtenidos se
realizó la calibración por estándar externo usando la altura y el área del
cromatograma obtenido lo cual se ve en las gráficas en donde se vio como afecta
los diferentes parámetros como el tiempo de retención, altura, área, relación área
sobre altura y se hizo la cuantificación del analito en una muestra problema como
en este caso de la cafeína. Se hubiera podido apreciar mejor si lo hubiéramos hecho
la experimentación en persona ya que en videos no se puede apreciar de la manera
correcta como se hacen todos estos pasos a seguir en HPLC.

BIBLIOGRAFIA
Calibración de equipo HPLC y Filtración de fase Movil. (2020, 12 junio). [Vídeo].
https://www.youtube.com/watch?v=QEyA1i47yaM

Inyección manual en HPLC. (2016, 08 junio). [Vídeo].

https://www.youtube.com/watch?v=W9zVpcHPGnE

Filtrado de disolventes para HPLC (2016, 08 junio). [Vídeo].

https://www.youtube.com/watch?v=W9zVpcHPGnE