ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

VICERRECTORADO ACADÉMICO
DIRECCIÓN DE DESARROLLO ACADÉMICO

ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD: CIENCIAS
CARRERA: INGENIERÍA AMBIENTAL

GUÍA DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA AMBIENTAL

PRÁCTICA No 4

TEMA: DETERMINACIÓN DE PROTEINAS

1. DATOS GENERALES

NOMBRE(S): estudiante (s) CODIGO(S): estudiante (s)

Michael Steve Mosquera Lagos 62

GRUPO N°: ……

FECHA DE REALIZACIÓN: FECHA DE ENTREGA:

1 de diciembre de 2020 6 de diciembre de 2020

Riobamba- Ecuador

2020
PRÁCTICA No. 4: DETERMINACIÓN DE PROTEINAS

1. INTRODUCCIÓN

Las proteínas son biomoléculas formadas básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y

nitrógeno. Pueden además contener azufre y en algunos tipos de proteínas, fósforo, hierro,

magnesio y cobre entre otros elementos. Pueden considerarse polímeros de unas pequeñas

moléculas que reciben el nombre de aminoácidos y serían, por tanto, los monómeros unidad. Los

aminoácidos están unidos mediante enlaces peptídicos. La unión de un bajo número de

aminoácidos da lugar a un péptido; si el número de aminoácidos que forma la molécula no es

mayor de 10, se denomina oligopéptido, si es superior a 10 se llama polipéptido y si el número es

superior a 50 aminoácidos se habla ya de proteína. Por tanto, las proteínas son cadenas de

aminoácidos que se pliegan adquiriendo una estructura tridimensional que les permite llevar a

cabo miles de funciones. Las proteínas están codificadas en el material genético de cada

organismo, donde se especifica su secuencia de aminoácidos, y luego son sintetizadas por los

ribosomas. Las proteínas desempeñan un papel fundamental en los seres vivos y son las

biomoléculas más versátiles y más diversas. Realizan una enorme cantidad de funciones

diferentes, entre ellas funciones estructurales, enzimáticas, transportadora.

ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS:

Todas las proteínas poseen una misma estructura química central, que consiste en una cadena

lineal de aminoácidos. Lo que hace distinta a una proteína de otra es la secuencia de aminoácidos

de que está hecha, a tal secuencia se conoce como estructura primaria de la proteína. La

estructura primaria de una proteína es determinante en la función que cumplirá después, así las

proteínas estructurales (como aquellas que forman los tendones y cartílagos) poseen mayor

cantidad de aminoácidos rígidos y que establezcan enlaces químicos fuertes unos con otros para

dar dureza a la estructura que forman. Sin embargo, la secuencia lineal de aminoácidos puede
adoptar múltiples conformaciones en el espacio que se forma mediante el plegamiento del

polímero lineal. Tal plegamiento se desarrolla en parte espontáneamente, por la repulsión de los

aminoácidos hidrófobos por el agua, la atracción de aminoácidos cargados y la formación de

puentes disulfuro y también en parte es ayudado por otras proteínas. Así, la estructura primaria

viene determinada por la secuencia de aminoácidos en la cadena proteica, es decir, el número de

aminoácidos presentes y el orden en que están enlazados y la forma en que se pliega la cadena se

analiza en términos de estructura secundaria. Además las proteínas adoptan distintas posiciones

en el espacio, por lo que se describe una tercera estructura. La estructura terciaria, por tanto, es el

modo en que la cadena polipeptídica se pliega en el espacio, es decir, cómo se enrolla una

determinada proteína. Así mismo, las proteínas no se componen, en su mayoría, de una única

cadena de aminoácidos, sino que se suelen agrupar varias cadenas polipeptídicas (o monómeros)

para formar proteínas multiméricas mayores. A esto se llama estructura cuaternaria de las

proteínas, a la agrupación de varias cadenas de aminoácidos (o polipéptidos) en complejos

macromoleculares mayores.

Por tanto, podemos distinguir cuatro niveles de estructuración en las proteínas:

• estructura primaria

• estructura secundaria

• estructura terciaria

• estructura cuaternaria

Los enlaces que determinan la estructura primaria son covalentes (enlace amida o enlace

peptídico), mientras que la mayoría de los enlaces que determinan la conformación (estructuras

secundaria y terciaria) y la asociación (estructura cuaternaria y quinaria) son de tipo no

covalente.
2.- OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Determinar la presencia de proteínas en distintas muestras biológicas.

EQUIPOS Y MATERIALES

Materiales

 Leche

 Clara de huevo

 Jamón

 Semillas de papaya

 3 recipientes de vidrio

 Pipetas pasteur

 Servilletas de papel

 Papel de filtro o gasa

 Marcador permanente

 Baño María

 Reactivo de Biuret (CuSO4 1%)

 NaOH al 20%

 Ácido acético

3.- INSTRUCCIONES

Determinación de proteínas: Prueba de Biuret

1. Rotular 2 tubos de ensayo, uno como leche y el otro clara de huevo

2. Añade 1 ml de leche en el tubo correspondiente,

3. Añade 1 ml de clara de huevo al segundo tubo (clara de huevo), utilice diferentes pipetas

Pasteur para la toma de muestras.

4. Dispensar 1 ml de NaOH al 20%

5. Añadir de 4 a 5 gotas de CuSO4 al 1%.

6. Observe los resultados

Desnaturalización de proteínas

1. Rotular 1 tubo de ensayo, como clara de huevo

2. Añade 2 ml de clara de huevo en el tubo, utilice una pipeta Pasteur para la toma de la

muestra.

3. Agrega 5 gotas de ácido acético

4. Agite el tubo suavemente

5. Lleve la muestra a baño María a una temperatura de 90 ºC por 5 minutos, transcurrido

este tiempo observe los resultados.

Actividad enzimática

1. En un mortero macere las semillas de papaya, añada agua para facilitar el proceso.

2. Filtre la muestra en un vaso de precipitación usando una gasa

3. En un mortero macere el jamón, añada agua para facilitar el proceso. Presione la gasa para

extraer la mayor parte del líquido

4. Filtre la muestra en un vaso de precipitación usando una gasa. De esta manera se obtienen

una solución de proteínas.

 5. Añade 1 ml de la solución obtenida a partir del jamón en un tubo de ensayo. Utilice una

pipeta Pasteur para la toma de muestras.

6. Dispensar 1 ml de NaOH al 20% al tubo

7. Añadir de 4 a 5 gotas de CuSO4 al 1% al tubo

8. Observe los resultados

9. En otro tubo añada 2 ml de la solución obtenida a partir del jamón en un tubo de ensayo.

10. Añada 2 ml del extracto de papaya en el tubo de ensayo.

11. Agite la muestra y déjela actuar por 20 minutos

12. Repita la prueba de Biuret

13. Observe los resultados

5.- RESULTADOS OBTENIDOS

Las cadenas de proteínas presentes en la clara de huevo (Ovoalbumína) cuando fueron sometidas

al reactivo de Biuret, que en su composición tiene NaOH al 10% (el cual no participa de la

reacción pero es de fundamental importancia su presencia ya que proporciona el medio básico

necesario) junto con el CuSO4, se pudo apreciar que el sulfato cúprico reaccionó con la proteína

presente en la solución de albúmina de huevo, y esta se torna de color violeta lo que nos indica

que la reacción fue positiva.

La leche contiene cientos de tipos de proteínas, la mayoría de ellas en muy pequeñas cantidades.

Estas pueden ser clasificadas de varias formas, de acuerdo a sus propiedades físicas o químicas,

así como también a sus funciones biológicas. La antigua metodología consistió en agrupar a las

proteínas de la leche en caseína, albúminas y globulinas (que forman parte de las proteínas del

suero) y actualmente esta clasificación es adecuada. Por tal razón también observamos en el

video que esta se tiñe de violeta, aunque se nota menor contraste en comparación a la muestra de

huevo.
La desnaturalización de proteínas, en la clara de los huevo, se evidencia por acción del calor

formando una masa sólida intercomunicada. Esta misma desnaturalización puede producirse a

través de solventes orgánicos, por ejemplo por acción de alcohol etílico en ambos casos, ocurre

una desnaturalización irreversible, con formación de coágulos. En cuanto a las proteolasas, se

utilizan al jamón y las semillas de papaya, que son ricas en una enzima que degrada proteínas,

después observamos la coloración violeta que nos da como resultado positivo para proteína,

después de añadir la muestra de jamón con las semillas, se añade el reactivo, y se observa la

diferencia entre las proteínas con enzima y las que no, es por eso que Biuret da negativo.

6.- CUESTIONARIO
 ¿Por qué se utiliza el reactivo de Biuret en la identificación de proteínas?

El Reactivo de Biuret indica la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con

dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.

Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y

potasio (KNaC4O6·4H2O). El reactivo cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa

cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El hidróxido de potasio no participa en la

reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.

Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un método colorimétrico que permite determinar la

concentración de proteínas de una muestra

¿Por qué se añade NaOH a las muestras biológicas antes de añadir el CuSO4 al 1%.?

Esto se da debido a la necesidad de un medio alcalino, el reactivo de Biuret consiste en una

solución acuosa de sulfato cúprico (CuSO4) en medio alcalino (NaOH). Este reactivo da

un ensayo positivo con los enlaces peptídicos entre aminoácidos, cuando la solución
queda de color violeta. Esto se debe a que el cobre tiene la propiedad de formar iones

complejos, especialmente entre los enlaces peptídicos. Es de fundamental importancia su

presencia ya que proporciona el medio básico necesario

Explique el proceso de desnaturalización de proteínas

Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior

(secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero

estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija.

Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente disminuirá su

estabilidad en disolución y provocará la precipitación. Así, la desaparición total o parcial de la

envoltura acuosa, la neutralización de las cargas eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los

puentes de hidrógeno facilitará la agregación intermolecular y provocará la precipitación. La

precipitación suele ser consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización y se dice entonces

que la proteína se encuentra desnaturalizada

 Proceso de desnaturalización protéica

Describa las estructuras primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias de las proteínas

ESTRUCTURAS PRIMARIAS:
Las proteínas tiene múltiple niveles de estructura. La básica es la estructura primaria.

La estructura primaria de una proteína es simplemente el orden de sus aminoácidos. Por

convención el orden de escritura es siempre desde el grupo amino-terminal hasta el carboxilo

final.

Como consecuencia del establecimiento de enlaces peptídicos entre los distintos AA que forman

la proteína se origina una cadena principal o "esqueleto" a partir del cual emergen las cadenas

laterales de los aminoácidos -

Estructura primaria de la Insulina: consta de dos cadenas de AA enlazadas por puentes disulfuro

entre las cisteínas

ESTRUCTURA SECUNDARIA

La estructura secundaria de una proteína es la que adopta espacialmente. Existen ciertas

estructuras repetitivas encontradas en las proteínas que permiten clasificarlas en dos tipos: hélice

alfa y lámina beta.

Una hélice alfa es una apretada hélice formada por una cadena polipeptídica. La cadena

polipetídica principal forma la estructura central, y las cadenas laterales se extienden por fuera de

la hélice. El grupo carboxílo (CO) de un aminoácido n se une por puente hidrógeno al grupo

amino (NH) de otro aminoácido que está tres residuos mas allá ( n + 4 ). De esta manera cada

grupo CO y NH de la estructura central (columna vertebral o "backbone") se encuentra unido por

puente hidrógeno.

Existen tres modelos de alfa hélice. El primero muestra solo al carbono alfa de cada aminoácido.

El segundo muestra todos los átomos que forman la columna vertebral del polipéptido .
El tercero y mas completo modelo, muestra todos los puentes hidrógeno que mantienen la alfa-

hélice. Las hélices generalmente están formadas por aminoácidos hidrófobos, en razón que son,

generalmente, la máxima atracción posible entre dichos aminoácidos. Las hélices se observan, en

variada extensión, prácticamente en todas las proteínas.

B-Las láminas beta son el otro tipo de estructura secundaria. Pueden ser paralelas o antiparalelas.

Las anti-paralelas generalmente se ven así:

Y los giros que tienen en su estructura :

donde el aminoácido n se une por puente hidrógeno al aminoácido (n +3) .

Existe un tipo especial de modelo molecular para resaltar la estructura secundaria de las

proteínas. Este tipo de modelo de proteína representa los segmentos de lámina-beta como cintas

en flecha (ribbons) y las alfa hélices como como cintas en espiral.

  Prión en su forma PrPsc presenta gran proporción de láminas

beta (43% láminas beta, 30% hélices alfa).

El resto de la cadena polipeptídica se referencia como un espiral al azar ("random coil"), y se

dibuja como una fina línea. Por favor, note que espiral al azar o "random coil" es un nombre que

lleva a confusión, dado que las proteínas están altamente organizadas, pero esta región no tiene

una estructura secundaria con componentes difíciles de categorizar.

ESTRUCTURA TERCIARIA
La estructura terciaria es la estructura plegada y completa en tres dimensiones de la cadena

polipeptídica, la hexoquinasa que se usa como icono en esta página es una estructura

tridimensional completa.

A diferencia ded la estructura secundaria, la estrtuctura terciaria de la mayor parte de las

proteínas es específica de cada molécula, además, determina su función.

EL plegamiento terciario no es inmediato, primero se agrupan conjuntos de estructuras

denominadas dominios que luego se articulan para formar la estructura terciaria definitiva. Este

plegamiento está facilitado por uniones denominadas puentes disulfuro, -S-S- que se establecen

entre los átomos de azufre del aminoácido cisteína.

Existen, sin embargo dos tipos de estructuras terciarias básicas:

 proteínas fibrosas, insolubles en agua, como la alfa queratina o el colágeno y

 proteínas globulares, solubles en agua.

ESTRUCTURA CUATERNARIA

Solo está presente si hay mas de una cadena polipeptídica. Con varias cadenas polipeptídicas, la

estructura cuaternaria representa su interconexión y organización. Esta es la imagen de la

hemoglobina, una proteína con cuatro polipéptidos, dos alfa-globinas y dos beta globinas. En

rojo se representa al grupo hem (complejo pegado a la proteína que contiene hierro, y sirve para

transportar oxígeno).
  Los cuatro niveles estructurales de la hemoglobina

7.- CONCLUSIONES

para saber si una sustancia desconocida, es una proteína se utiliza el reactivo de Biuret es aquel

que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces

peptídicos en sustancias de composición desconocida. Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y

sulfato cúprico (CuSO4). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y

a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta.

8.- RECOMENDACIONES
No olvidar que la eficiencia y buenos resultados en la práctica de laboratorio, además de la

seguridad del personal que ejecuta la práctica dependen del cumplimiento de ciertas normas, que

aunque en su mayoría se derivan del sentido común, es necesario hacer nota para tenerlas

presentes.

• No dejar botellas abiertas y sin marcar, limpiar cualquier derrame, disponer de los desechos

químicos en las líneas de desecho apropiadas.

• Dejar el sitio de trabajo completamente limpio y ordenado, arrojando los desechos en los sitios

designados para ello

A parte de estos puntos dentro de la realización de la practica note importante el exprimir bien

las gasas para tener una mayor cantidad de muestra, en el caso apartado de la desnaturalización

de proteína y además de tener un correcto registro visual mas el control del tiempo

9. BIBLIOGRAFIA

ANEXOS E IMÁGENES:

 http://www.ehu.eus/biomoleculas/proteinas/desnaturalizacion.htm#:~:text=Se%20ll
ama%20desnaturalizaci%C3%B3n%20de%20las,sin%20ninguna%20estructura%
20tridimensional%20fija.

 http://www.biologia.edu.ar/macromoleculas/structup.htm

INFORMACION:

 Williams LB, Wilson K .1981. Capítulo 3: Técnicas cromatográficas. En: “Principios y

Técnicas de Bioquímica Experimental”. Ediciones Omega S.A. (Barcelona, España), pp

84-90.
VIDEO DE LA PRACTICA:

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR – UNISINU. (2020, Octubre 19). Laboratorio virtual No 10:
Determinación de Proteínas [Archivo de video]. Recuperado de
https://www.youtube.com/watch?v=k6-dknvzYpE