Manual Integrado Normativ Métods Deteccióny Med Organms Microbiol

MANUAL INTEGRADO DE LA NORMATIVIDAD Y MÉTODOS DE DETECCIÓN Y MEDICIÓN DE ORGANISMOS
MICROBIOLÓGICOS EN ALIMENTOS COMO VEGETALES Y FRUTAS FRESCAS, PRODUCTOS DEL MAR Y CÁRNICOS
DE ANIMALES TERRESTRES
MANUAL INTEGRADO DE LA
NORMATIVIDAD Y
MÉTODOS DE DETECCIÓN Y
MEDICIÓN DE ORGANISMOS
MICROBIOLÓGICOS EN
ALIMENTOS COMO
VEGETALES Y FRUTAS
FRESCAS, PRODUCTOS DEL
MAR Y CÁRNICOS DE
ANIMALES TERRESTRES
1
ÍNDICE
PREFACIO 3
INTRODUCCIÓN 5
ESTADO DEL ARTE 6
MARCO LEGAL 7
ACREDITACIÓN 9
ALCANCE 10
1. 1.NORMAS OFICIALES Y REGULACIONES NACIONALES E 11
INTERNACIONALES RELACIONADAS CON LOS MÉTODOS PARA EL
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS
2. 2.TÉRMINOS Y DEFINICIONES DE MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS 13
3. MÉTODOS NORMALIZADOS PARA DETECTAR BACTERIAS 18
ESPECÍFICAS
3.1.1 Detección de Escherichia coli, Coliformes, Escherichia coli O157 y productoras 18
de shiga toxinas.
3.1.2 Detección de Listeria monocytogenes 27
2.1.3 Detección de Staphylococcus aureus 32
3.1.4 Detección de Salmonella spp. 38
3.1.5 Detección de Vibrio cholerae, V. vulnificus, V. parahaemolyticus 43
3.2 COLECCIÓN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS 51
3.3 PREPARACIÓN DE DILUCIONES USANDO MEDIOS GRAVIMÉTRICOS 57
3.4 CÁLCULO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE 63
4.GLOSARIO DE MEDIOS DE CULTIVO Y OTROS REACTIVOS 106
4.1 Escherichia coli y Coliformes 108
4.2 Listeria spp. y L. monocytogenes 138
4.3 Staphylococcus aureus 160
4.4 Salmonella spp. 172
4.5 Vibrio 203
4.6 Colección y transporte de muestras. 224
4.7 Preparación de diluciones usando medios gravimétricos. 225
5.DESCRIPCIÓN DE BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO 229
5.1 INSTALACIONES 229
5.2 PERSONAL 231
5.3 MANEJO DE MUESTRAS 233
5.4 EQUIPO 236
5.5 MATERIALES 236
5.6 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 237
5.7 MANTENIMIENTO DE REGISTROS 239
BIBLIOGRAFÍA 240
2
PREFACIO
El presente manual de normatividad y métodos para la detección y medición de microorganismos
patógenos en alimentos fue integrado y compilado por el Centro Nacional de Metrología con el
apoyo del Proyecto Sectorial SAGARPA-CONACyT 2011-09-172352, Demanda Específica 6.
“Desarrollo de normatividad y métodos para detección y medición de organismos microbiológicos
en alimentos”, el cual fue realizado en colaboración con el Centro de Investigación en Alimentación
y Desarrollo, A.C. Unidad Culiacán y tuvo aportaciones honoríficas de distinguidos investigadores
y usuarios de México.
Centro Nacional de Metrología

Responsable Técnico: Dr. Yoshito Mitani Nakanishi
Responsable Administrativo: C.P. Guillermo Salomón Villalobos Castrejón
Director General del CENAM. Dr. Héctor Nava Jaimes
CENAM
Km 4.5 Carretera a los Cués,
Municipio El Marqués, Querétaro.
C.P. 76246 México Tel. (442) 2110500 al 04
Correo electrónico: meperez@cenam.mx
Compilado y escrito por:

Dra. Melina Pérez Urquiza. Coordinador Científico. Líder de la Demanda Específica 6
Dr. Aldo Amaro Reyes, profesor investigador de la UAQ, contratado por CENAM con fondos del
proyecto.
Dra. Nohelia Castro del Campo. CIAD Culiacán
Esta publicación ha sido revisada por:

Dra. Blanca García Almendarez profesor-investigador de la Universidad Autónoma de Querétaro
Q.A. Judith Sainz Uribe Coordinador Científico
®2013 por el Centro Nacional de Metrología

Secretaría de Economía
Primera Edición consta de 1000 ejemplares

Reservado todos los derechos
ISBN: 978-607-96162-6-7
Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida, almacenada en un sistema o

transmitida, en ninguna forma o en ningún medio, electrónico, mecánico, fotocopia, grabado, sin el
permiso de los copropietarios. Para simplificar la información, se han utilizado los nombres de los
productos comerciales. Este manual no pretende recomendar productos nombrados o ilustrados,
como tampoco existe una crítica implícita de productos similares que no se mencionan o ilustran.
3
Agradecimientos por su contribución en la elaboración del presente manual
CIAD Culiacán
Dr. Cristóbal Chaidez Quiroz
Dra. Josefina León Félix
Dr. Osvaldo López Cueva
Dra. Hilda Karina Ramírez Medina
QFB Célida Isabel Martínez Rodríguez
QFB Jesús Hector Carrillo Yáñez
Dra. Nohelia Castro del Campo
CIAD Mazatlán
Dr. Miguel Betancourt Lozano
M.C. Leobardo Montoya Rodriguez
M.C. Jesus Efren Astorga Rodriguez
IIA Blanca Erika Alvarez Nieves contratada por CENAM con fondos del proyecto.
Con el apoyo de los ayudantes de proyecto y tesistas de licenciatura:
p.IBQ Marycarmen Merino Sanchez . Instituto Tecnológico de Celaya
p.IBQ Alma Liliana Villarreal Cásares. Instituto Tecnológico de Durango
4
INTRODUCCIÓN
El Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) junto con la Secretaría de Agricultura,

Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA) conscientes de la necesidad de
contar con normas que establezcan métodos adecuados para el análisis de microorganismos
patógenos en alimentos, han confiado al Centro Nacional de Metrología (CENAM) la revisión de la
normatividad mexicana actual relacionada con la detección y medición de microorganismos
patógenos en alimentos tales como frutas, vegetales frescos, carne fresca de animales terrestres y
productos marinos, con la finalidad de generar propuestas de actualización y mejora, para optimizar
los procesos de evaluación de la conformidad y de esta manera coadyuvar a mejorar la agro
economía y la inocuidad y calidad agroalimentaria.
Este manual es un compendio de las Normas Oficiales Mexicanas (NOM) actuales relacionadas con
el análisis de microorganismos patógenos en alimentos y las normas internacionales equivalentes,
elaboradas por diferentes organismos tales como el Comité Europeo de Normalización, la Food and
Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos de América y las Normas Británicas (BS). Su
objetivo es ser un precedente de las Normas Oficiales Mexicanas y presentar métodos actualizados
para la detección y medición de microorganismos patógenos en alimentos.
5
ESTADO DEL ARTE
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) son un problema cada vez más importante a
nivel internacional debido al intercambio comercial y al constante traslado de las personas entre los
diferentes países. La mayoría de las infecciones transmitidas por los alimentos comúnmente
reconocidas son las ocasionadas por los géneros bacterianos Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae,
Escherichia coli O157, Listeria monocytogenes entre algunos otros (INFOSAN, 2009).
La importancia de garantizar la inocuidad de los alimentos estriba en que los alimentos pueden ser
causantes de enfermedades que merman la capacidad de los individuos enfermos y sus actividades
de desarrollo, lo que conlleva a afectar a su comunidad y desequilibrar el funcionamiento de las
organizaciones en donde participa (INFOSAN, 2009). En general, la calidad e inocuidad
alimentaria son factores claves de éxito en el comercio internacional agropecuario.
Las infecciones a menudo ocurren como brotes, sin embargo en América es más frecuente la
detección clínica de casos aislados y no siempre confirmados por el laboratorio y comúnmente
designados como “esporádicos”. Si dichos casos pudieran relacionarse entre si se lograría un mejor
control y prevención de las ETA (Pulsenet. Consultado el 15 de mayo de 2012.
http://fos.panalimentos.org/Default.aspx?alias=fos.panalimentos.org/pulsenet).
Un elemento clave para el reconocimiento y control de brotes es la capacidad de análisis de los

patógenos aislados de humanos y su identificación en las probables fuentes de contaminación, hasta
llegar, en lo posible a su reservorio y las vías de transmisión (Pulsenet. Consultado el 15 de mayo
de 2012.
http://fos.panalimentos.org/Default.aspx?alias=fos.panalimentos.org/pulsenet).
Los Estatutos de la Comisión del Codex Alimentarius tienen como propósito, entre otras cosas, la
protección de la salud de los consumidores, asegurar prácticas equitativas en el comercio de
alimentos y promocionar la coordinación de todas las normas alimentarias acordadas por las
organizaciones gubernamentales y no gubernamentales (FAO/OMS. Consultado el 15 de mayo de
2012. http://www.codexalimentarius.net/web/index_es.jsp). Estas recomendaciones del Codex son
utilizadas por los gobiernos para formular y ajustar las políticas y programas en el marco de su
sistema nacional de control de los alimentos (FAO-OMS, 2003).
En el presente documento se condensan y se abordan diferentes normas para asegurar la inocuidad

de los alimentos, descritas por diversas instituciones nacionales como internacionales, tales como
las Normas Oficiales Mexicanas descritas por la Secretaria de Salud de México, Normas ISO de la
Organización Internacional de estandarización (ISO), el Manual Analítico de Bacteriología de la
Administración de Drogas y Alimentos de Estados Unidos, la Guía de Laboratorio del
Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, por mencionar algunos, de manera que le
sirvan al productor como un manual o guía rápida, en donde encontrará aspectos técnicos para
asegurar y mantener la calidad microbiológica de sus alimentos.
6
MARCO LEGAL
Las Normas Oficiales Mexicanas que rigen los procedimientos para la preparación, dilución, toma,
manejo y transporte de muestras y los métodos analíticos para determinar los organismos
microbiológicos en alimentos tales como Listeria monocytogenes, Salmonella, Staphylococcus
aureus, Vibrio y Coliformes totales fueron publicadas por la Secretaría de Salud, en colaboración
con otros organismos entre los años de 1994 y 1997.
El objetivo general de las Normas es establecer métodos estándar para determinar los
microorganismos en alimentos.
En la actualidad existen en nuestro país ocho Normas Oficiales Mexicanas directamente

relacionadas con este fin.
NOM-109-SSA1-1994 Bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de

muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Establece los procedimientos que deben
seguirse para la toma de muestras, los cuales varían dependiendo del tipo de producto y la finalidad
del análisis (productos envasados con presentación comercial, envasados en recipientes grandes,
alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones). Asimismo propone prácticas que deben
adoptarse durante la toma de muestras (uso de bata, cofia, cubrebocas y guantes estériles; rapidez en
la toma de muestras; etiquetado e identificación de las muestras, etc.). Además propone condiciones
en las que las muestras deben ser transportadas e información que debe contener la muestra antes de
su entrada en el laboratorio.
NOM-110-SSA1-1994 Bienes y servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su

análisis microbiológico. Presenta el procedimiento para la dilución primaria y diluciones decimales
adicionales de muestras de alimentos: líquidas, sólidas y muestras congeladas. La dilución primaria
consiste en pesar una cantidad de la muestra y mezclarla con una cantidad de diluyente nueve veces
mayor en proporción. Mientras que la dilución decimal adicional es una solución obtenida al
mezclar un determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un
diluyente y por repetición de este procedimiento se obtiene una serie de diluciones decimales
adecuadas para la inoculación de medios de cultivo.
NOM-114-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la determinación de Salmonella en

alimentos. Establece el método para detectar la presencia de Salmonella en alimentos, el cual varía
dependiendo del alimento (huevo, fórmulas infantiles y mezclas preparadas en polvo, productos no
pasteurizados congelados de huevo, productos que contienen huevo en su formulación, ensaladas,
frutas frescas, crustáceos, pescado, leche en polvo, etc.). La norma divide el procedimiento de
detección del microorganismo en 5 pasos básicos: el preenriquecimiento, el enriquecimiento
selectivo, la selección en medios sólidos, la identificación bioquímica y la serotipificación.
NOM-115-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la determinación de Staphylococcus aureus

en alimentos. Aporta el método para la detección de Staphylococcus aureus en alimentos basado en
la cuenta directa de este microorganismo en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con
la confirmación mediante las pruebas de coagulasa y termonucleasa.
NOM-143-SSA1-1995 Bienes y servicios. Método de prueba microbiológico para alimentos.

Determinación de Listeria monocytogenes. El objetivo principal de esta norma es establecer el
método microbiológico para determinar la presencia de Listeria monocytogenes en alimentos. El
aislamiento y diferenciación de especies de Listeria spp. se basa en la fermentación de
7
carbohidratos y la actividad hemolítica característica del género. El método sugiere un

procedimiento en cuatro etapas: enriquecimiento, aislamiento, identificación y serología.
NOM-113-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la cuenta de microorganismos coliformes

totales en placa. Esta norma establece el método microbiológico para determinar el número de
microorganismos coliformes totales presentes en los productos alimenticios, el cual es un indicador
de prácticas higiénicas inadecuadas. El método se basa en la técnica de cuenta en placa en medio
selectivo.
NOM-112-SSA1-1994 Bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del

número más probable. En esta norma se describe el procedimiento para determinar las bacterias
coliformes mediante la técnica del número más propable (NMP). Esta técnica se fundamenta en la
capacidad que poseen estos microorganismos de fermentar la lactosa con la producción de ácidos y
gas que puede observarse en las campanas de fermentación. La técnica se divide en una prueba
presuntiva y una prueba confirmativa. La prueba presuntiva incluye la inoculación en un medio
diferencial que permite determinar si hay producción de gas. La prueba confirmativa requiere del
crecimiento de las cepas presuntivas en un medio selectivo.
NOM-242-SSA1-2009 Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados,

congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba. Esta NOM tiene por
objeto establecer los requisitos sanitarios para: las áreas de captura de moluscos bivalvos; los
establecimientos que procesan productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados,
incluyendo las embarcaciones de pesca y recolección; así como las especificaciones sanitarias que
deben cumplir dichos productos. En ella se incluye el método para la detección de Vibrio que se
basa en el crecimiento en medio selectivo salino y la diferenciación e identificación de cepas tanto
por pruebas bioquímicas, como pruebas serológicas de aglutinación.
Cabe mencionar que existen adicionalmente otras 9 normas sobre productos de la pesca y cárnicos,
en las cuales se menciona la detección de los microorganismos patógenos de interés en este manual.
8
ACREDITACIÓN
En México, la evaluación de la conformidad se realiza por las dependencias competentes o por los
organismos de certificación (OC), los laboratorios de pruebas (LP) o de calibración (LC) y por las
unidades de verificación (UV) acreditados y, en su caso, aprobados.
La acreditación de esos organismos, laboratorios y unidades es realizada por las entidades de

acreditación (EA) autorizadas, conforme lo establecen los artículos 68 y 69 de la Ley Federal de
Metrología y Normalización (LFMN). En México hasta ahora, la Entidad Mexicana de Acreditación
(EMA) es la única entidad que proporciona este servicio y de acuerdo a los lineamientos
internacionales se realiza tomando como base lo establecido en la norma NMX-EC-17025-IMNC-
2006 (ISO/IEC 17025:2005) Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo
y calibración, tras cumplir una auditoria.
En la Ley Federal sobre Metrología y Normalización (LFMN) Artículo 81 se instituye al Sistema

Nacional de Acreditamiento de Laboratorios de Pruebas con el objeto de contar con una red de
laboratorios acreditados que cuenten con equipo suficiente, personal técnico calificado y demás
requisitos que establezca el reglamento, para que presten servicios relacionados con la
normalización a que se refiere esta Ley (México, 1992). Actualmente se cuenta con laboratorios
acreditados en la detección de microorganismos patógenos en alimentos, mismos que participan en
ensayos de aptitud con proveedores extranjeros debido a que actualmente en México no contamos
con este servicio.
9
ALCANCE
El alcance del presente manual es proveer de una guía técnica comprensiva sobre las metodologías
microbiológicas a través de una recopilación de información relacionada con la normatividad
mexicana, normas internacionales de aplicación actual y metodología de detección rápida empleada
por las instituciones del país en materia de inocuidad de los alimentos y laboratorios de ensayo en
beneficio del sector productivo de cárnicos, frutas y vegetales y alimentos de origen acuático que
involucra la detección de microorganismos patógenos como Salmonella spp, Escherichia coli,
Listeria monocytogenes, Vibrio spp, Staphylococcus aureus y E. coli O157:H7 y productoras de
shiga toxinas.
10
1. NORMAS OFICIALES Y REGULACIONES NACIONALES E

INTERNACIONALES RELACIONADAS CON LOS MÉTODOS PARA EL
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS
Para la realización de este manual se consultaron las siguientes normas oficiales y regulaciones
nacionales e internacionales relacionadas con los métodos para el análisis microbiológico de
alimentos en productos para consumo humano incluidos productos frescos de vegetales, frutas,
carne de animales terrestres y productos del mar (Ver Tabla 1 y Tabla 2).
Tabla 1. Normatividad nacional e internacional que rige los procedimientos para la toma, manejo y
preparación de las muestras de alimentos revisada para la realización del manual.
Objeto y campo de
aplicación Normas aplicables
NOM 109-SSA1-1994
Procedimientos para la toma,
manejo y transporte de BAM Capítulo 1: Muestreo de alimentos y preparación de la
muestras muestra homogeneizada
BS 5763: Part 0: 1986
NOM-110-SSA1-1994
UNE/ISO 6887-1
UNE/ISO 6887-2
Preparación y dilución de UNE/ISO 6887-3
muestras UNE/ISO 6887-4
BAM Capítulo 1: Muestreo de alimentos y preparación de la
muestra homogeneizada
BS 5763: Part 0: 1986
NOM: Norma Oficial Mexicana, UNE/ISO: Comité Europeo de Normalización-Asociación Española de
Normalización y Certificación, BAM: Manual Analítico Bacteriológico, BS: Normas Británicas.
Tabla 2. Normatividad nacional e internacional revisada para la realización del manual para
determinar microorganismos patógenos en alimentos de consumo humano y animal.
Objeto y campo de
Normas aplicables
aplicación
NOM-112-SSA1-1994
NOM-113-SSA1-1994
UNE/ISO 16654:2002
Bacterias coliformes y BS 5763: Part 10: 1993
Escherichia coli
BS 5763: Part13: 1989
BAM Capítulo 4. Recuento de Escherichia coli y bacterias
coliformes
ISO 7251: 2005 (E)
Escherichia coli O157 BAM Capitulo 4A. Escherichia coli diarreogénica
Listeria spp. y L. NOM 143-SSA1-1995
11
monocytogenes UNE/ISO 11290-1:1997

UNE/ISO 11290-2:2000
BAM Capítulo 10. Detección y recuento de Listeria
monocytogenes en los alimentos; Protocolo: Confirmación
simultánea de especies aisladas de Listeria y L. monocytogenes por
PCR en tiempo real.
NOM-115-SSA1-1994
UNE/ISO 6888-1: 2000
UNE/ISO 6888-2:2000
Staphylococcus aureus UNE/ISO 6888-3:2003
BS 5763: Part 7: 1983
BAM Capítulo 12. Staphylococcus aureus
BAM Capítulo 12: Staphylococcus aureus (NMP)
NOM-114-SSA1-1994
Salmonella spp. UNE/ISO 6579:2003
BAM Capítulo 5. Salmonella
NOM-242-SSA1-2009
ISO/TS 21872-1:2007
Vibrio
BS 5763:Part14:1991
BAM Capítulo 9. Vibrio
NOM: Norma Oficial Mexicana, UNE/ISO: Comité Europeo de Normalización-Asociación Española de
Normalización y Certificación, BAM: Manual Analítico Bacteriológico, BS: Normas Británicas.
12
2. TÉRMINOS Y DEFINICIONES DE MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS
Asépticamente: forma de mantener la ausencia completa de microorganismos vivos en un medio.
ß-hemólisis: zona transparente alrededor de la colonia debida a la lisis total del eritrocito.
Bloque; pieza: muestra cuya composición y dimensiones (superficie y espesor, pero

particularmente espesor) permite tomar una muestra en profundidad bajo condiciones estériles
satisfactorias.
Canales; despieces: unidades (productos avícolas, carne de conejo) similares a las que se preparan
para su venta.
Coliformes: bacilos Gram negativos, no esporulados aerobios o anaerobios facultativos, que a 35

°C fermentan la lactosa con la producción de gas bajo las condiciones especificadas en la NOM-
112-SSA1-1994 o bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a
35 °C fermentan la lactosa con formación de ácido, ocasionando en las colonias desarrolladas el
vire del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitación de las sales biliares según lo
especificado en la NOM-113-SSA1-1994.
Detección de Salmonella: determinación de la presencia o ausencia de estos microorganismos en

una masa determinada de producto, cuando las pruebas se llevan a cabo de acuerdo con la NOM -
114-SSA1-1994 o determinación de la presencia o ausencia de Salmonella, en una masa o volumen
determinada de producto, cuando los análisis se realizan según la UNE-EN ISO 6579:2003.
Determinación del número de estafilococos coagulasa-positivos: determinación del número de

estafilococos coagulasa-positivos presentes por mililitro o por gramo de muestra cuando se realiza
el ensayo de acuerdo con el método especificado en esta parte de la norma ISO 6888.
Detección de Listeria monocytogenes: determinación de la presencia o ausencia de estos

microorganismos en una cantidad, peso o volumen dado de producto, cuando se realizan los
ensayos de esta parte de la norma ISO 11290.
Dilución primaria: es la disolución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una
cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de
diluyente.
Diluciones decimales adicionales: las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un

determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que
por repetición de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones
decimales adecuadas para la inoculación de medios de cultivo.
Diluciones decimales sucesivas: suspensiones o disoluciones obtenidas al mezclar un volumen

determinado de la suspensión inicial, con un volumen nueve veces superior de disolvente y
repitiendo esta operación con diluciones decimales sucesivas, hasta llegar a un nivel de dilución
adecuado para la inoculación del medio de cultivo.
Enterobacteriaceae: microorganismo que fermenta la glucosa y muestra reacción negativa a la

oxidasa cuando la prueba se lleva a cabo de acuerdo al método especificado.
13
Escherichia coli: bacteria que a 44 °C forma colonias indol positivas (color rosa), sobre membranas
de acetato de celulosa superpuestas en agar triptona bilis, bajo las condiciones descritas en BS 5763:
Part 13: 1989.
Escherichia coli O157; E.coli O157: microorganismos que forman colonias características en la
superficie del medio en placa, empleado en esta norma internacional y que producen indol y que
aglutinan específicamente con antisuero, frente al antígeno O157.
Estafilococos coagulasa-positivos: bacterias que forman colonias características y/o no

características sobre la superficie de un medio de cultivo selectivo y que dan resultados positivos a
la reacción de la coagulasa, cuando se realiza el ensayo siguiendo el método especificado en esta
parte de la norma ISO 6888.
Fecha de caducidad: fecha límite en que se considera que un producto, almacenado en las
condiciones sugeridas por el fabricante, conserva las características sanitarias que debe de reunir
para su consumo. Después de esta fecha no debe comercializarse ni consumirse.
Fragmento; viruta: muestra de carne congelada resultante de un corte profundo de una muestra de
superficie o una muestra tomada en profundidad del interior de la pieza para análisis mediante un
taladro eléctrico o manual, equipado con una broca para madera.
Loncha: corte de carne con las dos caras más o menos paralelas de algunos centímetros de espesor.
Listeria monocytogenes: bacilo corto, Gram positivo, no esporulado, móvil, aerobio, capaz de
crecer en condiciones de microaereofilia, catalasa positivo y oxidasa negativo. En agar sangre da
origen a colonias puntiformes, circulares, lisas y translúcidas de color azul grisáceo con una zona
discreta de ß-hemólisis o microorganismos que forman colonias típicas en medios sólidos selectivos
y que presentan las características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas descritas cuando se
llevan a cabo los ensayos de esta parte de la norma ISO 11290.
Método: es un proceso o camino sistemático establecido para realizar una tarea o trabajo con el fin
de alcanzar un objetivo predeterminado. Procedimiento científico seguido en la ciencia para hallar
la verdad. Un procedimiento que se usa para realizar una tarea específica en la clase o módulo.
Muestra para el laboratorio: muestra preparada para ser enviada al laboratorio y destinada a ser
utilizada para inspección o para análisis.
Muestra representativa: es un número de unidades tomadas de un lote, que han sido seleccionadas
en forma aleatoria y cuyas características son lo más similar posible a las del lote del que procede.
Muestra testigo: muestra que queda en poder del interesado y a disposición de la autoridad
competente.
Norma específica: Norma internacional o documento de apoyo que describe el análisis de un

producto determinado (o de un grupo de productos) para la detección o la determinación del número
de un microorganismo específico (o de un grupo de microorganismos).
Porción para análisis: muestra representativa medida (volumen o masa) tomada a partir de la
muestra para el laboratorio, para emplearse en la preparación de la suspensión inicial.
Presuntas Escherichia coli: bacteria que fermenta la lactosa con la producción de gas a 44 °C, y
que además produce indol a partir de triptofano, cuando el ensayo se realiza de acuerdo al método
especificado en la ISO 7251: 2005 (E).
14
Procedimiento: es un término que hace referencia a la acción que consiste en proceder de alguna
forma. El concepto, por otra parte, está vinculado a un método ó una manera de ejecutar algo. Un
procedimiento, en este sentido, consiste en seguir ciertas etapas predefinidas para desarrollar una
labor de manera eficaz.
Productos perecederos: grupo de alimentos que por su naturaleza biológica y físico-química, su

vida útil es de hasta 30 días, dando lugar al establecimiento de una fecha de caducidad, la cual debe
ostentarse en su etiqueta o envase.
Recuento de enterobacteriaceae: el número de Enterobacteriaceae encontrado por mililitro o por

gramo de la muestra examinada cuando la prueba se lleva a cabo de acuerdo al método
especificado.
Recuento de Listeria monocytogenes: determinación del número de unidades formadoras de

colonias (UFC) de Listeria monocytogenes en una cantidad determinada de producto, cuando el
análisis se realiza de acuerdo con esta parte de la norma ISO 11290.
Recuento de presuntas Escherichia coli: número más probable de E. coli por mililitro o por
gramo de la muestra cuando el ensayo se realiza de acuerdo al método especificado en esta norma
internacional.
Salmonella: microorganismo patógeno perteneciente al grupo de las Enterobacterias. Bacilo gram

negativo, aerobio, no esporulado que forman colonias típicas en medios selectivos sólidos y que
presentan además las características bioquímicas y serológicas descritas cuando los procedimientos
se efectúan de acuerdo con la NOM -114-SSA1-1994 o microorganismos que forman colonias
típicas o menos típicas en medios selectivos sólidos y que manifiestan las características
bioquímicas y serológicas descritas cuando los análisis se realizan según la UNE-EN ISO
6579:2003.
Staphylococcus aureus: microorganismo que forma colonias típicas y/o atípicas en la superficie de
un medio de cultivo selectivo y que muestra reacción de coagulasa fuertemente positiva o
microorganismo que se desarrolla en medios de cultivo selectivo y diferencial, que es capaz de dar
positiva la prueba de coagulasa y termonucleasa.
Suspensión inicial (dilución base): suspensión, disolución o emulsión obtenida cuando un peso o
volumen determinados del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a partir del
producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando que las
partículas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas.
Suspensión inicial (dilución primaria): suspensión, disolución o emulsión obtenida cuando un

peso o volumen determinados del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a
partir del producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando
que las partículas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas.
Toma de muestra: es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de
la totalidad del lote o partida.
Vibrio parahaemolyticus: microorganismo halófilo que forma colonias características en medio

sólido selectivo y que muestra las características bioquímicas descritas cuando las pruebas son
llevadas a cabo de acuerdo con la BS 5763: Part 14: 1991.
15
Vida útil o vida de anaquel: es el tiempo durante el cual un alimento es seguro y conserva un nivel
de calidad sanitaria aceptable para su consumo, bajo condiciones específicas de procesamiento,
envasado y almacenamiento.
16
Símbolos y abreviaturas
± más menos M molar
/ signo de división ml, mL mililitro
⁰C Celsius mm milímetro
% por ciento min minuto
1/d inversa de la dilución N normal
ATCC American Type Culture Collection NCTC National Culture Type Collection
ß beta NMP número más probable
cbp cuanto basta para p peso
CIP Culture International Production p. ejem. por ejemplo
cm centímetro pH potencial de hidrógeno
cm2 centímetro cuadrado PM peso molecular
g gramo RVBA agar-rojo-violeta-bilis-lactosa
h hora s segundo
kg kilogramo UFC unidades formadoras de colonias
l, L litro spp especies plurales
lb libras v volumen
μm micrómetro x signo de multiplicación
17
3. MÉTODOS NORMALIZADOS PARA DETECTAR BACTERIAS

ESPECÍFICAS
Datos Generales y requerimientos de métodos cualitativos
Los métodos de ensayo microbiológicos cualitativos, son aquellos en los que el resultado se expresa
en términos de detectado/no detectado y los procedimientos de confirmación e identificación, deben
ser validados estimando, cuando sea apropiado, su especificidad, exactitud relativa, desviación
positiva, desviación negativa, límite de detección, efecto matricial, repetibilidad y reproducibilidad.
Datos generales y requerimientos de métodos cuantitativos
En el caso de ensayos microbiológicos cuantitativos, debe considerarse la especificidad,

sensibilidad, exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, repetibilidad,
reproducibilidad y el límite de cuantificación dentro de una variabilidad establecida y en caso
necesario, determinar cuantitativamente estos parámetros. Las diferencias debidas a las matrices
deben tenerse en cuenta al analizar diferentes tipos de muestras. Los resultados deben evaluarse
utilizando métodos estadísticos apropiados.
3.1.1. Detección de Escherichia coli, Coliformes, Escherichia coli O157 y productoras de shiga
toxinas.
El denominado grupo de coliformes es utilizado como indicador de condiciones de higiene y

calidad general en los análisis de alimentos, se compone principalmenete de cepas de los géneros
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, entre otros, tales como Citrobacter, Salmonella y Shigella.
Los coliformes fermentan la lactosa a ácido y gas a 35 ºC–37 ºC dentro de 24 h -48 h (Anand y
Griffiths, 2011). Los coliformes también incluyen bacterias de origen no fecal por lo que no deben
ser exclusivos de indicadores de contaminación fecal u otros patógenos entéricos, generalmente se
diferencian los coliformes fecales de los no fecales con una incubación a (45 ± 0.2) ºC (Anand,
2011).
El género Escherichia coli se compone de bacilos Gram-negativos, anaerobios facultativos,

comúnmente habita el tracto gastrointestinal de mamíferos y pertenece a la familia
Enterobacteriaceae (Viazis y Diez-Gonzalez, 2011). Existen cepas patogénicas de E. coli
productoras de shiga toxinas las cuales son miembros de una familia de toxinas que se clasifican en
dos subgrupos: Stx1 y Stx2 (O'Brien y Holmes, 1987). Las toxinas son producidas por el patógeno
en el colon y pueden causar daño local, poseen la capacidad de viajar al riñón a través del torrente
sanguíneo, donde se cree que desempeñan un papel en la causa de colitis hemorrágica y síndrome
urémico hemolítico (Kaper, 2005).
A continuación se muestran de manera resumida algunos aspectos de las normas tales como el
objetivo y campo de aplicación, fundamento, procedimiento, reactivos y medios de cultivo,
materiales, aparatos e instrumentos, preparación de la muestra, expresión de los resultados, informe
de la prueba y concordancia con otras normas, con el fin de comparar de manera rápida estos
aspectos entre diferentes normas.
18
NOM-112-SSA1-1994
Objetivo y Estimar el número de coliformes presentes en productos alimenticios (agua

campo de potable, agua purificada, hielo y alimentos procesados térmicamente)por medio
aplicación: del cálculo del número más probable (NMP).
Fermentación de la lactosa por bacterias coliformes, incubadas a (35 ± 1) °C
Fundamento: durante (24 a 48) h, resultando una producción de ácidos y gas el cual se
manifiesta en las campanas de fermentación.
Para agua potable y hielo: Inoculación (caldo lactosado), incubación a 35 °C por
(24 a 48) h ± 2 h, prueba confirmativa (caldo lactosa lauril bilis verde brillante)
incubación a 35 °C por (24 a 48) h ± 2 h. Para alimentos: Prueba presuntiva
Procedimiento: (inoculación en medio de enriquecimiento, dilución, incubación a 35 °C por (24 a
48) ± 2 h, prueba confirmativa (de cada tubo que muestre formación de gas,
tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos con medio de
confirmación. Incubar a (35 ± 0.5) °C por (24 a 48) h.
Reactivos y Soluciones diluyentes (Disolución reguladora de fosfatos, agua peptonada).
medios de Medios de cultivo (Caldo lactosado, caldo lauril sulfato triptosa, caldo lactosa
cultivo: bilis verde brillante).
Aparatos e Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas de vidrio,
instrumentos: pHmetro.
Preparación de
Las muestras deben prepararse y diluirse de acuerdo a la NOM-110-SSA1-1994.
la muestra:
Expresión de
Número más probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de muestra.
resultados:
Informe de la Informar "Número más probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de
prueba: muestra". En caso de muestras de agua informar NMP/100 ml.
Concordancia
con normas Esta norma no tiene concordancia con normas internacionales.
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
NOM-113-SSA1-1994
Objetivo y Método microbiológico para determinar el número de microorganismos

campo de coliformes totales presentes en productos alimenticios por medio de la técnica de
aplicación: cuenta en placa.
Determinación del número de microorganismos coliformes presentes en una
muestra, utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se
Fundamento: desarrollan bacterias a 35 °C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la
producción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran el indicador de pH y
precipitan las sales biliares.
19
Dilución, inoculación en medio RVBA, incubación a 35 °C, durante (24 ± 2) h,

Procedimiento: contar colonias, seleccionar las placas que contengan entre 15 colonias y 150
colonias.
Reactivos y
Soluciones diluyentes (Disolución reguladora de fosfatos, agua peptonada).
medios de
Medio de cultivo agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (RVBA).
cultivo:
instrumentos: contador de colonias, licuadora, vasos para licuadora, microscopio, pHmetro.
Preparación de La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-

la muestra: 110-SSA1-1994.
Expresión de UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35 °C durante 24 h ±

resultados: 2 h.
UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35 °C durante 24 h ±
2 h. En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar
Informe de la
utilizando como referencia la dilución más baja utilizada, por ejemplo dilución
prueba:
10-1. En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no
desarrollo de coliformes por ml".
Concordancia
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
UNE-EN ISO 16654:2002
Objetivo y
Método horizontal para la detección de Escherichia coli serogrupo O157.
campo de
Aplicable a productos para consumo humano o animal.
aplicación:
Detección de Escherichia coli serogrupo O157 por enriquecimiento en caldo
triptona soya, separación y concentración mediante partículas inmunomagnéticas,
Fundamento:
aislamiento y confirmación mediante la producción de indol y aglutinación con el
suero anti E. coli O157.
Dilución, enriquecimiento, incubación (41.5 °C durante 6 h, 12 h y 18 h),
separación inmunomagnética (IMS) (inmunocaptura, separación), siembra en
Procedimiento: agares selectivos e identificación de colonias E. coli O157, confirmación
(confirmación de colonias, confirmación bioquímica por formación de indol,
identificación serológica).
Medio de enriquecimiento (caldo triptona soya modificado con novobiocina,
mTSB+N), primer medio selectivo (agar cefixima telurito sorbitol Mc Conkey
Reactivos y
agar, CT-SMAC), disolución de telurito potásico, disolución de cefixima, agar
medios de
nutritivo, medio triptona/triptófano, reactivo de indol de Kovac, partículas
cultivo:
inmunomagnéticas anti E. coli O157, tampón fosfato modificado (0.01 mol/l, pH
7.2), disolución salina normal, suero anti E.coli O157.
20
Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas de vidrio,

Aparatos e
mezclador rotatorio, vortex, separador magnético con gradilla magnética, baño de
instrumentos:
agua, microscopio, pHmetro.
Realizar de acuerdo con la norma internacional específica adecuada para el
Preparación de
producto. Si no existe una norma internacional específica, se recomienda que las
la muestra:
partes interesadas adopten un acuerdo sobre este asunto.
Expresión de
Presencia o ausencia de E. coli x gramo o por mililitro.
resultados:
Deberá especificar: información necesaria para la completa identificación de la
Informe de la muestra, método de muestreo empleado, método de ensayo empleado, haciendo
prueba: referencia a la norma ISO 6888, temperatura de incubación utilizada, detalles
operativos, resultados obtenidos.
Concordancia
con normas ISO 16654:2001.
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
BS 5763: Part 10: 1993
Objetivo y
campo de Productos para consumo humano y animal.
aplicación:
Cálculo del número más probable (NMP) después de incubación a (35 o 37 ) °C
Fundamento: en medio líquido; conteo de colonias en medio selectivo en placa incubando a (35
o 37) °C.
Dilución, NMP (inoculación e incubación, aislamiento en placa, selección de
Procedimiento: colonias y confirmación), conteo en placa (inoculación e incubación, conteo y
selección de colonias), confirmación (subcultivo, confirmación bioquímica).
Reactivos y
Caldo verde brillante bilis glucosa (Caldo E.E), agar rojo violeta bilis glucosa,
medios de
agar glucosa, agar nutritivo, reactivo de oxidasa.
cultivo:
instrumentos: asas, pHmetro.
Preparación de
Diluciones decimales.
la muestra:
Expresión de Tabla de número más probable (NMP), número de Enterobacteriaceae x gramo o

resultados: por mililitro.
Informe de la Reportar método, temperatura de incubación, resultados, condiciones de

prueba: operación no especificadas en la norma, incidentes, identificación de la muestra.
21
Concordancia
con normas ISO 7402-1985, ISO 7402-1993 (E).
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
BS 5763: Part 13: 1989
Objetivo y
aplicación:
Resucitación en membranas de acetato de celulosa cubiertas con agar modificado
glutamato mineral incubadas a 37 °C por 4 h, aislamiento: transferir las
Fundamento: membranas de la etapa de resucitación a agar bilis triptona, incubar 44 °C por (18
a 20) h, detección: demostración de la presencia de E. coli por la producción de
indol.
Dilución. Resucitación: colocar la membrana de acetato de celulosa sobre la
superficie de cajas Petri con agar mineral glutamato modificado, humedecer la
membrana con la muestra, incubar a (35 o 37) °C por 4 h. Transferir a medio
selectivo: Transferir las membranas de las placas Petri con agar mineral
glutamato modificado a cajas Petri con agar bilis triptona, incubar a 44 °C
Procedimiento: durante (18 a 24) h. Detección producción de indol por colonias en membranas:
Retirar las membranas de la superficie del agar y embeber las membranas en el
reactivo de detección de indol en la tapa de la caja Petri propia del ensayo,
colocar la membrana bajo una lámpara de luz ultravioleta durante 30 min, las
colonias indol-positivas desarrollarán color rosado. Conteo: contar las colonias
indol-positivas (color rosa) de la membrana.
Reactivos y Medio de resucitación: Agar mineral glutamato modificado, medio selectivo:
medios de Agar triptona bilis, reactivo de detección de indol (p-dimetilaminobenzaldehido,
cultivo: HCl).
Hornos, autoclaves, incubadoras, mezcladoras (mecánica, peristáltica), tubos,
Aparatos e
cajas Petri, membranas de acetato de celulosa, pipetas, varillas de vidrio, lámpara
instrumentos:
ultravioleta, pHmetro.
Preparación de
Dependiente de la muestra.
la muestra:
Expresión de
Número de E. coli x gramo o por mililitro.
resultados:

Concordancia
con normas ISO 6391.
internacionales:
22
Cepas de
No especifica.
referencia :
BAM Capítulo 4. Recuento de Escherichia coli y bacterias coliformes
Objetivo y
campo de Productos de consumo humano.
aplicación:
Fundamento: Fermentación de lactosa y cálculo del número más probable.
General: Dilución, NMP (inoculación e incubación, aislamiento en placa,
selección de colonias y confirmación), conteo en placa (inoculación e incubación,
Procedimiento:
conteo y selección de colonias), confirmación (subcultivo, confirmación
bioquímica). Confirmación en medio sólido y filtración por membrana.
Caldo verde brillante bilis lactosa (BGLB) (M25), caldo lauril triptosa
(LST)(M76), caldo EC (M49), azul Levin de metileno-eosina (L-EMB), agar
(M80), caldo triptona (triptofano) (M164), caldo MR-VP (M104), caldo citrato
de Koser (M72), agar para cuenta en placa método estándar (PCA) (M124), agua
Reactivos y
Butterfield de tampon de fosfatos (R11) o diluyente equivalente (excepto para
medios de
crustáceos), reactivo de Kovacs (R38), reactivo Voges-Proskauer (VP) (R89),
cultivo:
reactivos para tinción de Gram (R32), indicador rojo de metilo (R44), agar bilis
rojo violeta (VRBA) (M174), agar VRBA-MUG (M175), medio EC-MUG
(M50), caldo lauril triptosa MUG (LST-MUG) (M77), diluyente de peptona, 0.1
% (R56).
instrumentos: asas, pHmetro, contador de colonia, licuadora, frascos de dilución, lámpara UV.
Preparación de
Diluciones decimales.
la muestra:
Expresión de Tabla del número más probable (NMP), número de Enterobacteriaceae x gramo
resultados: o por mililitro.
Informe de la
No especifica.
prueba:
Concordancia
con normas No especifica.
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
23
BAM: Capítulo 4A. Escherichia coli diarreogénica.
Objetivo y
Identificar y aislar cepas patógenas de E. coli en base a sus propiedades únicas de
campo de
virulencia en los alimentos para consumo humano.
aplicación:
Enriquecimiento en medio líquido, selección de cepas fermentadoras de lactosa,
caracterización primaria y secundaria por pruebas bioquímicas, pruebas mediante
Fundamento: cultivo de tejidos, sondas de ADN, PCR en tiempo real de enterotoxigénicidad,
enteroinvasividad, enteropatógenicidad, detección sistemática de E. coli serotipo
O157:H7.
A. Enriquecimiento de cepas patógenas de E. coli. Caldo BHI, caldo de doble
fuerza TP incubar 20 h a 44.0 °C ± 0.2 °C. Plaquear en medio selectivo, incubar
20 h a 35 °C. B. Selección. Características fenotípicas en medio selectivo. C.
Análisis e identificación bioquímica. Primera y segunda inspección con pruebas
bioquímicas tradicionales o como alternativa, API20E o el ensayo de pruebas
bioquímicas automatizado VITEK. D. Pruebas de E. coli enterotoxigénica
(ETEC), por análisis de hibridación de colonias con sondas de ADN, cultivo de
tejidos, prueba del ratón lactante, pruebas comerciales de RPLA y ELISA para
detectar toxinas, ensayos de PCR. E. Pruebas de E. coli enteroinvasiva (EIEC),
por la prueba de Sereny o el ensayo queratoconjuntivitis con cobayos, ensayo de
tejido de células HeLa, técnica de tinción en vitro usando naranja de acridina,
sondas de ADN y PCR. F. Pruebas de Escherichia coli enteropatógena (EPEC),
por cultivo de tejidos, PCR y sondas. G. Detección de E. coli serotipo O157: H7.
Procedimiento:
Medio de enriquecimiento, medio sólido selectivo, identificación fenotípica,
serología y la prueba de genes de la Shiga toxina por PCR y PCR en tiempo real.
H. Preparación de la muestra, enriquecimeinto. I. Análisis de PCR en tiempo real.
Preparación del ADN molde, controles de PCR positivo y negativo, protocolo de
la reacción del Smart Cycler II y análisis de datos. J. Análisis y detección de los
cultivos aislados. De positivos por el ensayo de PCR en tiempo real. Proceso de
aislamiento. Diluir y crecer en medio sólido selectivo y agar cromógeno,
identificar fenotípicamente, pruebas de antígenos, ensayar en medio selectivo y
pruebas bioquímicas, pruebas confirmatorias (bioquímicas, con antígenos,
antisueros comerciales, PCR tiempo real). K. Métodos de análisis para cepas
STECno-O157. Enriquecimiento, aislamiento en medio selectivo, pruebas
confirmatorias de los aislados por API20E o VITEK, PCR, electroforesis en gel
en campos pulsados.
Caldo triptona fosfato (TP) (M162), caldo infusión cerebro corazón (BHI) (M24),
agar azul Levine azul de eosina-metileno (L-EMB) (M80), agar MacConkey
(M91), agar triple azúcar hierro (TSI) (M149), agar base sangre (BAB) (M21),
caldo triptona (triptofano) (M164), caldo púrpura de bromocresol (M26)
suplementado individualmente con 0.5 % (w/v) de cada uno de los azúcares:
glucosa, adonitol, celobiosa, sorbitol, arabinosa, manitol y lactosa, caldo urea
Reactivos y
(M171), caldo Falkow lisina decarboxilasa (M87), caldo cianida de potasio
medios de
(KCN) (M126), caldo MR-VP (M104), medio indol nitrito (nitrato triptico)
cultivo:
(M66), agar acetato (M3), caldo mucato (M105), caldo mucato control (M106),
caldo malonato (M92), caldo citrato de Koser (M72), disolución acuosa de
bicarbonato de sodio 10 % (R70), discos de ONPG (o-nitrofenil-β-D-
galactopiranosido) (R53), disolución salina amortiguador de fosfatos (PBS)
(R60), agua diluyente de Butterfield amortiguador de fosfatos (BPBW) (R11),
reactivo de Kovac (R38), reactivo VP (R89), reactivo de prueba de oxidasa
24
(R54), reactivo de detección de nitritos (R48), acite mineral pesado (R46),

reactivos de tinción de Gram (R32). Para pruebas en PCR tiempo real: Agua
peptonada amortiguada con piruvato (mBPWp) y suplemento de acriflavin-
Cefsulodin-Vancomicina (ACV) (M192a), oligonucleótidos iniciadores y sondas
para STEC/O157 específicos para la plataforma de PCR en tiempo real,
OmniMix-HS o SmartMix HM reactivos de esferas para PCR (Cepheid o Fisher),
LightCycler FastStart ADN Master Hybridization Probes M-Grade (Roche
Applied Science, Catalog #3 383 393), agar MacConkey telurito cefixima-
sorbitol (TC-SMAC) (M194), agar cromogénico selectivo: Agar E. coli O157:H7
R&F® agar (R&F Laboratories), agar Rainbow® O157 (BIOLOG), agar Levin
azul de eosin-metileno (L-EMB) (M80) (solo sección R), agar tripticasa de soya
con extracto de levadura (TSAYE) (M153), amortiguador de fosfato Butterfield
(R11) (pH 7.2 ± 0.2), agua destilada, agua grado molecular, disolución
fisiológica salina (0.85 % NaCl), ColiComplete Discs - conteniendo sustrato
fluorogénico MUG para GUD y X-gal cromogénico para GAL (BioControl),
reactivo anti-O157 y anti-H7 latex (Remel), API20E o VITEK GNI
(BioMerieux).
licuadora, estomaquer, mezclador rotatorio, vortex, separador magnético con
Aparatos e
gradilla magnética, baño de agua, microscopio, pHmetro, microcentrífuga,
instrumentos:
termociclador Smart Cycler II, tubos para PCR, instrumento LightCycler 2.0
PCR tiempo real, capilares LightCycler para PCR tiempo real.
Refrigere las muestras inmediatamente después de su recepción. No congelar,
excepto para mantener los productos congelados hasta justo antes del análisis.
Analizar las muestras tan pronto como sea posible. Si el recuento lo requiere,
preparar un homogeneizado de 25 g en 225 ml de PBS o BPBW. Realizar
diluciones decimales (en PBS o BPBW) de la placa de homogeneizado e inocular
en cajas directo en agar MacConkey para obtener colonias aisladas. Después de
incubar las placas durante 20 horas a 35 °C, realizar levantamiento de las
colonias y pruebas de hibridación con sondas genéticas específicas para los genes
de virulencia. Pruebas con sondas y PCR: Productos con hojas - añade un peso
igual de amortiguador fosfato de Butterfield a por lo menos 200 g de producto en
un recipiente estéril o bolsa resellable de plástico y agitar suavemente durante 5
minutos. Pesar 125 g del producto enjuagado en 125 ml de (2X) mBPWp doble
Preparación de
fuerza. Jugo, leche u otras muestras de bebidas turbias - asépticamente
la muestra:
centrifugar 200 ml de muestra a 10.000 x g durante 10 min. Después de decantar
el sobrenadante, resuspender el material precipitado en 225 ml de mBPWp. Agua
embotellada u otros líquidos no turbios - pesar 125 ml en 125 ml de mBPWp 2X.
También seguir este procedimiento con líquidos en el que no sea visible un
precipitado después de la centrifugación. Todos los demás alimentos - pesar 25 g
de alimento en 225 ml de mBPWp. Licuar o mezclar con un stomaquer según sea
necesario. Preparación del ADN molde: Enriquecer la cepa durante una noche,
centrifugar, resuspender el precipitado en NaCl al 0.85 %, centrifugar,
resuspender el precipitado en agua estéril, mantener a 100 °C durante 10 min,
centrifugar, retirar y guardar el sobrenadante como ADN molde (Esto puede ser
congelado, mínimo a -20 ° C, para las futuras pruebas de PCR), hacer una
dilución 1:10 de este molde.
Expresión de
Número de E. coli por gramo o por mililitro.
resultados:
25
Informe de la
No especifica.
prueba:
Concordancia
internacionales:
E. coli 465-97 USDA (stx1-, stx2- uidA+), ATCC43890 (stx1+, stx2-, uidA+),
Cepas de
ATCC 43888 (stx1-, stx2- uidA+) o equivalente, ATCC 43895 (EDL 933) o
referencia :
ATCC 43894 (stx1+, stx2+ y uidA+).
ISO 7251: 2005 (E)
Objetivo y Detectar y cuantificar presuntas colonias de Escherichia coli en productos para

campo de consumo humano, animal y muestras ambientales del área de manejo y
aplicación: producción de alimentos.
Cálculo del número más probable (NMP) después del crecimiento en cultivo
Fundamento:
líquido en medio selectivo.
Método de detección: Porción de la muestra y dilución inicial (ver ISO 6887 o
ISO 8261 dependiendo del producto). Incubar en medio selectivo de
enriquecimiento (37 °C 24 h- 48 h). Inoculación e incubación en medio selectivo
(44 °C 24 h -48 h). Inoculación e incubación en agua peptonada. Prueba
Procedimiento: confirmatoria (indol). Método de recuento: Porción de la muestra y dilución
inicial (ISO 6887 o 8261). Inoculación e incubación en medio de enriquecimiento
selectivo (37 °C 24 h-48 h). Subcultivo e incubación en medio selectivo (44 °C
24 h-48 h). Inoculación e incubación en agua peptonada (44 °C 48 h). Prueba
confirmatoria (producción de indol). Interpretación.
Reactivos y Medio diluyente: En general ver norma ISO 6887-1, para productos lácteos ver
medios de ISO 8261. Medio de enriquecimiento selectivo: Caldo lauril sulfato, caldo EC,
cultivo: agua peptonada libre de indol, reactivo de indol (reactivo de Kovac).
Aparatos e Horno, autoclave, incubadoras, baños de agua, tubos de ensayo, asas, campanas
instrumentos: Durham, potenciómetro.
Preparación de
la muestra:
Método de detección: Presencia o ausencia de presuntas E. coli en la porción de
Expresión de
la muestra en gramos o mililitros. Método de recuento: NMP de E. coli por
resultados:
gramo.
Identificación de la muestra, el método de muestreo utilizado, el método del
Informe de la ensayo, todos los detalles operacionales no especificados u opcionales en el
prueba: estándar internacional junto con aquellos incidentes que pudieron haber influído
en el resultado de la prueba, los resultados obtenidos.
Concordancia
internacionales:
26
Cepas de
No especifica.
referencia :
3.1.2 Detección de Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes es una bacteria que vive de manera natural en el suelo como saprófito, pero
es capaz de hacer su transición como patógeno en el hombre y los animales después de su ingestión
a través de los alimentos (Freitag et al., 2009). L. monocytogenes es una bacteria Gram positiva,
intracelular, que se caracteriza por tolerar temperaturas de refrigeración, pH ácido, alta
concentración de sal y formar biopelículas, lo cual favorece su presencia y proliferación en los
alimentos y el ambiente (Gandhi y Chikindas, 2007). L. monocytogenes se clasifica con base a sus
antígenos somáticos y flagelares, en 13 serotipos; 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4ab, 4b, 4d, 4e
y 7, los cuales son considerados potencialmente patógenos (Seeliger y Höhne, 1979). L.
monocytogenes es el agente causal de la listeriosis, la cual se manifiesta en graves enfermedades
(meningitis, septicemia, aborto y gastroenteritis), con una alta tasa de mortalidad entre 20 % a 30 %,
y afecta principalmente a la población en riesgo, como niños, mujeres embarazadas, ancianos y
personas inmunocomprometidas (Mead et al., 1999).
L. monocytogenes es un contaminante frecuente en alimentos, estando presente en 2 % a 4 % de los

suministros de leche cruda y también comúnmente aislada de carne cruda, pollo y mariscos, así
como también de numerosos productos procesados como, carne, pescado y mariscos.
A continuación se muestra de manera resumida algunos aspectos de las normas tales como el
de la prueba y concordancia con otras normas con el fin de comparar de manera rápida estos
NOM-143-SSA1-1995
Objetivo y
Método microbiológico para determinar la presencia de Listeria monocytogenes
campo de
en alimentos.
aplicación:
Se basa en el aislamiento y la diferenciación de especies de Listeria spp.,
Fundamento: principalmente por la fermentación de carbohidratos y la actividad hemolítica de
los miembros de este género.
Enriquecimiento (inoculación en medio EB e incubación por 48 h a 35 °C).
Aislamiento (resembrar en medios LMP y OXA, incubar a 30 °C por 24 h a 48 h
y 35 °C respectivamente). Identificación (seleccionar colonias típicas y sembrar
en medio ASTEL. Incubar a 35 °C por 24 h). Prueba de movilidad en fresco.
Procedimiento: Prueba de catalasa. Tinción de Gram. Prueba de hemólisis. Prueba de reducción
de nitratos. Prueba de movilidad en agar. Prueba de utilización de carbohidratos.
Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP). Serología (la determinación
de los tipos serológicos de Listeria se aplica cuando las consideraciones
epidemiológicas sean cruciales.
Reactivos (Reactivos para Tinción de Gram, reactivos para la determinación de
Reactivos y
nitritos), medios de cultivo (Caldo soya tripticaseína con 0.6 % de extracto de
medios de
levadura (CSTEL), caldo de enriquecimiento (EB) pH 7.3, medio de cloruro de
cultivo:
litio feniletanol-moxolactam (LMP), medio Oxford, agar soya tripticaseína con
27
0.6 % de extracto de levadura (ASTEL), agar sangre de carnero, caldo nitratos),

medios para la prueba de movilidad (medio de SIM, medio MTM), caldo púrpura
para fermentación de carbohidratos.
Aparatos e Hornos, autoclaves, incubadoras, lámpara de luz blanca, microscopio, tubos,
instrumentos: cajas Petri, pipetas, varillas de vidrio.
Preparación de
Para la preparación de la muestra seguir la NOM-110-SSA1-1994.
la muestra:
Expresión de
Para L. monocytogenes informar la presencia en 25 g o 25 ml de muestra.
resultados:
Cuando los resultados sean positivos para L. monocytogenes informar la
Informe de la
presencia en 25 g o 25 ml de muestra. Si los resultados son negativos informar
prueba:
ausencia en 25 g o 25 ml de muestra.
Concordancia
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
UNE-EN ISO 11290-1:1997
Objetivo y
Método horizontal para la detección de Listeria monocytogenes, aplicable a
campo de
productos destinados al consumo humano o a la alimentación animal.
aplicación:
Detección de L. monocytogenes en cuatro etapas consecutivas: enriquecimiento
Fundamento: primario en un medio líquido de enriquecimiento selectivo, enriquecimiento
secundario en medio líquido, aislamiento e identificación, confirmación.
Dilución. Enriquecimiento primario. Incubación a 30 °C por 24 h.
Enriquecimiento secundario. Incubación a 35 °C o 37 °C por 48 h. Aislamiento e
identificación (sembrar en medio OXFORD y PALCAM). Confirmación de
Listeria spp.(selección de colonias, reacción de la catalasa, tinción de Gram,
Procedimiento:
prueba de motilidad). Confirmación de L. monocytogenes (ensayo de hemólisis,
utilización de carbohidratos, ensayo de CAMP). Interpretación de las propiedades
morfológicas y fisiológicas y de las reacciones bioquímicas. Confirmación
definitiva. Cultivos control.
Medio de enriquecimiento selectivo primario (Caldo Fraser de media
concentración), medio de enriquecimiento selectivo secundario con agentes
selectivos (caldo Fraser), medios de cultivo sólidos selectivos (agar OXFORD,
Reactivos y
agar PALCAM), medio de cultivo agar triptona soya - extracto de levadura
medios de
(TSYEA), medio de cultivo caldo triptona soya - extracto de levadura (TSYEB),
cultivo:
agar sangre de cordero, caldo de utilización de carbohidratos (ramnosa y xilosa),
caldo motilidad, medio CAMP y cepas para ensayo, disolución de peróxido de
hidrógeno, disolución de tampón de fosfato salino (PBS).
28

Preparación de
la muestra:
Expresión de
Para L. monocytogenes registrar la presencia o ausencia en g o ml de muestra.
resultados:
Informe de la muestra, método de muestreo empleado, método de ensayo empleado haciendo
prueba: referencia a la Norma ISO 11290, temperatura de incubación utilizada, detalles
Concordancia
con normas ISO 11290-1:1997.
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
UNE-EN ISO 11290-2:2000
Objetivo y Método horizontal para la detección de Listeria monocytogenes, aplicable a

campo de productos destinados al consumo humano o preparados alimenticios para
aplicación: animales.
Recuento de L. monocytogenes en seis etapas consecutivas: preparación de la
Fundamento: suspensión inicial, re-verificación, aplicación en placa, incubación, confirmación,
cálculo del número de L. monocytogenes por gramo o mililitro.
Suspensión inicial. Dilución. Inoculación (placas de agar PALCAM). Incubación
a 35 °C o 37 °C durante 24 h a 48 h. Recuento de colonias características.
Confirmación de las especies de Listeria (selección de colonias para la
confirmación, reacción de catalasa, tinción de Gram, ensayo de movilidad).
Procedimiento:
Confirmación de L. monocytogenes (ensayo de hemólisis, utilización de
carbohidratos, ensayo de CAMP). Interpretación de las propiedades
morfológicas y fisiológicas y de las reacciones bioqúimicas. Confirmación
definitiva.
Reactivos y
medios de Véase Norma ISO 7218.
cultivo:
Preparación de
la muestra:
Expresión de
Número de L. monocytogenes por g o ml de muestra.
resultados:
Informe de la
muestra, método de muestreo empleado, método de ensayo empleado haciendo
prueba:
referencia a la Norma ISO 11290, temperatura de incubación utilizada, detalles
29
Concordancia
con normas ISO 11290-2:2000.
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
BAM Capítulo 10: Listeria monocytogenes
Objetivo y
campo de Productos para consumo humano.
aplicación:
Procedimientos de muestreo y de enriquecimiento, procedimiento de aislamiento,
procedimiento de identificación (PCR tiempo real, Kits), subtipificación de
Fundamento:
aislados de L. monocytogenes, prueba de patogenicidad del ratón
inmunodeficiente, interpretación de los datos de las pruebas, recuento.
1. Procedimientos de muestreo y de enriquecimiento: Tratamiento de la muestra,
pre-enriquecimiento y enriquecimiento, enriquecimiento con conteo, métodos
alternativos prescritos para el cribado de las muestras enriquecidas. 2.
Procedimiento de aislamiento: medios selectivos. 3. Procedimiento de
identificación: Morfología, tinción de Gram, prueba de catalasa, fermentación de
Procedimiento: carbohidratos, medio selectivo, prueba de reducción de nitrato, pruebas de
movilidad, pruebas con kits, PCR en tiempo real, métodos rápidos alternativos,
prueba de CAMP. 4. Subtipificación de aislados de L. monocytogenes
(obligatorio): serológica y genéticamente. 5. Prueba de patogenicidad del ratón
inmunodeficiente (opcional). 6. Interpretación de los datos de las pruebas. 7.
Recuento (requerido).
Ácido acético 5 N, monohidroclorido de acriflavina, agar, N-(1-naftil) etilen
diamina (R48), reactivo α-Naftol (R48), agar base sangre No. 2, cicloheximida,
natamicina, sangre de cordero defibrinado, etanol absoluto, tampón de anticuerpo
fluorescente, glicina anhidra, kit de tinción de Gram, disolución de peróxido de
hidrógeno 3 % para prueba de catalasa (R12), disolución de KOH 40 % (R65),
juego será Listeria-typing, agar cloruro de litio feniletanol moxalactam (LPM)
(M81) con esculina y hierro (M82), ácido nalidíxico (sal de sodio), medio de
reducción de nitrato (M108) y reactivo de detección de nitrato (R48), caldo
Reactivos y
nutritivo (M114), disolución salina fisiológica 0.85 % (R63), caldo base
medios de
fermentación carbohidrato púrpura (M130) conteniendo soluciones 0.5 % de
cultivo:
dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol, y xilosa, medio SIM (M137) o
medio de prueba de movilidad (M103), reactivo de ácido sulfanílico (R48), agar
tripticasa de soya con 0.6 % de extracto de levadura (TSAye) (M153), caldo
tripticasa de soya con 0.6 % extracto de levadura (TSBye) (M157), medio Oxford
(OXA) (M118), caldo de enriquecimiento amortiguado para Listeria (BLEB)
(M52), agar PALCAM (M118a), carragenina, agar BCM (M17a), agar MOX
(M103a), agar ALOA (M10a), agar Listeria cromogénico (M40b), rapid L'mono
(M131a), CHROMagar Listeria (M40a), agar y caldo triptosa (M167).
30
instrumentos: microscopio de contraste de fases, licuadora o mezcladora peristáltica.
Tratamiento de la muestra. Refrigerar la muestra a 4 °C. Muestras compuesta.
Una muestra de un lote de alimento debe constar de 10 sub-muestras, porciones
de 50 g o ml de cada sub-muestra se utilizan para hacer dos muestras compuestas
Preparación de (250 g cada una) con mezcladoras peristálticas y medio de enriquecimiento sin
la muestra: agentes selectivos. Muestras no compuestas. Si no se requieren muestras
compuestas porciones analíticas simples de 25 g se mezclan con 225 ml de medio
basal de pre-enriquecimiento/enriquecimiento BLEB en una licuadora o
mezcladora peristáltica.
Expresión de
UFC por gramo o por mL.
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
Concordancia AOAC 992.18. 2000, AOAC 992.19. 2000, AOAC 993.09. 2000, AOAC 993.12.
con normas 2000, AOAC 994.03. 2000, AOAC 995.22. 2000, AOAC 996.14. 2000, AOAC
internacionales: 997.03. 2000, AOAC 999.06. 2000, AOAC 2003.12. 2005.
Cepas de
No especifica.
referencia :
BAM Capítulo 10: Listeria monocytogenes. BAM Protocolo: Confirmación simultánea de

especies aisladas de Listeria y L. monocytogenes por PCR en tiempo real
Objetivo y
aplicación:
Identificación de especies de Listeria monocytogenes y Listeria específicamente
por PCR en tiempo real. Un ensayo de PCR en tiempo real 5'-nucleasa de
Fundamento:
diferentes regiones del gen iap para detectar L. monocytogenes, así como las
especies de Listeria, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri y L. welshimeri.
1. Preparación del templado: crecimiento de la bacteria aislada por 20 h-24 h a 35
°C, aislamiento de ADN por el método de agua hirviendo. 2. Preparación de
controles: positivo (cepa de referencia) y negativo (agua sin templado). 3. Ensayo
Procedimiento:
de PCR en tiempo real (ensamble de la reacción, corrida en SmartCycler II,
ánalisis de datos cuantitativos, interpretación de los resultados del PCR en tiempo
real).
Reactivos y Agua estéril de grado molecular, OmniMix-HS PCR reactivo en soporte sólido,
medios de Iniciadores y sondas del gen iap para las especies de Listeria y L.
cultivo: monocytogenes.
31
Aparatos e Equipo PCR en tiempo real (SmartCycler II) y material propio de ensayos de
instrumentos: PCR en tiempo real.
Crecer aislados bacterianos en caldo de infusión cerebro corazón (BHI) de 20 h -
Preparación de 24 h 35 °C o suspender una colonia cultivada en placa de agar en disolución
la muestra: salina al 0.85 %, centrifugar, resuspender pastilla, someter a ebullición,
centrifugar y conservar sobrenadante (templado).
Expresión de
UFC por gramo o por mL.
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
Concordancia
internacionales:
Cepas de Listeria monocytogenes ATCC 19115, Listeria innocua ATCC 33090, Listeria
referencia : seeligeri ATCC 35967, Listeria ivanovii ATCC 19119.
3.1.3 Detección de Staphylococcus aureus
Staphyloccocus aureus es un coco Gram-positivo, catalasa positivo, oxidasa negativo, anaerobio

facultativo, mesófilo que crece en un rango de temperatura de 7 °C a 48°C con una temperatura
óptima de crecimiento de 37 °C (Valero et al., 2009). El intervalo de pH óptimo al que se desarrolla
es de 6 a 7. Se desarrolla adecuadamente en medios que contienen de un 5 % a un 7 % de NaCl y
actividades de agua de 0.86 (Ewald y Notermans, 1988). Su resistencia a inhibidores que se
encuentran en los alimentos le permite desarrollarse bajo condiciones en las que otros patógenos no
se desarrollan. Por lo tanto, alimentos con altas concentraciones de sal y baja actividad de agua se
ven implicados en brotes. El Staphyloccocus aureus produce enterotoxinas termoestables (serotipos
A-E) causantes de intoxicaciones en humanos (Anand, 2011).
A continuación se muestran de manera resumida algunos aspectos de las normas tales como el
de la prueba y concordancia con otras normas, con el fin de comparar de manera rápida estos
32
NOM-115-SSA1-1994
Objetivo y
Cuenta de Staphylococcus aureus presente en alimentos nacionales o de
campo de
importación.
aplicación:
Estimación del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos, se efectúa
directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la
Fundamento: confirmación mediante las pruebas de coagulasa y termonucleasa.
Este método es adecuado para el análisis de alimentos en los cuales se esperen
más de 100 células de Staphylococcus aureus por g.
Dilución, inoculación, incubación por 45 h -48 h a 35 °C, conteo y colecta de
Procedimiento:
colonias presuntivas, prueba de coagulasa, prueba termonucleasa
Soluciones diluyentes (disolución reguladora de fosfatos, agua peptonada), medio
de Baird-Parker (medio base de Baird-Parker, disolución de telurito, emulsión de
Reactivos y yema de huevo, disolución salina isotónica), caldo de infusión cerebro-corazón
medios de (BHI), ácido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera (Disolución de
cultivo: cloruro de calcio anhidro 0.01 M, disolución de azul de toluidina 0.1 M,
disolución amortiguadora 0.05 M Tris-(hidroximetilaminometano) (Tris pH 9)
reactivo biológico: plasma de conejo.
Aparatos e
Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas de vidrio.
instrumentos:
Preparación de Realizar de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994 "Preparación y

la muestra: dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico".
Expresión de
UFC/gramo.
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
Concordancia
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
UNE-EN ISO 6888-1: 2000
Objetivo y
Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos en productos destinados al
campo de
consumo humano o a la alimentación de los animales.
aplicación:
Método horizontal para el recuento de Staphylococcus coagulasa positivos en
productos destinados al consumo humano o a la alimentación de animales,
Fundamento:
mediante el recuento de las colonias obtenidas en un medio sólido (medio Baird-
Parker) tras la incubación en condiciones aeróbicas a 35 °C o a 37 °C.
33
Dilución, inoculación, incubación por 24 h ± 2 h a 35 °C a 37 °C, conteo y

Procedimiento:
selección de colonias, prueba de coagulasa.
Reactivos y Diluyentes (véase la Norma ISO 6887-1), medio de agar Baird- Parker (medio
medios de base, disolución de telurito potásico, emulsión de yema de huevo, disolución de
cultivo: sulfametacina), infución de cerebro y corazón, plasma de conejo.
Aparatos e
instrumentos:
Preparación de
la muestra:
Expresión de
Número de colonias x gramo o por mL.
resultados:
prueba: referencia a la Norma ISO 6888, temperatura de incubación utilizada, detalles
Concordancia
con normas ISO-6888-1:1999.
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
UNE-EN ISO 6888-2:2000
Objetivo y
Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos en productos destinados al
campo de
consumo humano o a la alimentación de los animales.
aplicación:
Método horizontal para el recuento de Staphylococcus coagulasa positivos en
productos destinados al consumo humano o a la alimentación de animales,
Fundamento: mediante el recuento de las colonias obtenidas en un medio sólido (medio de
plasma de conejo y fibrinógeno) tras la incubación en condiciones aeróbicas a 35
°C o a 37 °C..
Dilución, inoculación, incubación por 18 h a 24 h a 35 °C a 37 °C, conteo y
Procedimiento:
selección de colonias, prueba de coagulasa.
Diluyentes (véase la Norma ISO 6887-1), medio de agar de plasma de conejo y
Reactivos y
de fibrinógeno, soluciones (medio base, disolución de telurito potásico,
medios de
disolución de fibrinógeno bovino, disolución de plasma de conejo y del inhibidor
cultivo:
de tripsina).
Aparatos e
instrumentos:
Preparación de
la muestra:
34
Expresión de
resultados:
Concordancia
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
UNE-EN ISO 6888-3:2003
Objetivo y Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos en productos destinados al

campo de consumo humano o animal y muestras ambientales en el área de producción y
aplicación: manipulación de alimentos.
Método horizontal para el recuento de Staphylococcus coagulasa positivos,
empleando la técnica del número más probable (NMP) en productos destinados al
consumo humano o animal y muestras ambientales en el área de producción y
Fundamento:
manipulación de alimentos. Se recomienda este método para alimentos en los que
los estafilococos están sometidos a tensión y en número bajo, como en productos
deshidratados.
Preparación de suspensión inicial (caldo Giolitti y Cantoni), enriquecimiento
(incubación por 24 h ± 2 h a 37 °C), subcultivo de tubos (agar de Baird - Parker o
Procedimiento: agar de plasma de conejo y fibrinógeno), incubación por 24 h y 48 h a 37 °C,
dilución, inoculación, incubación por 24 h a 37 °C, selección de colonias,
interpretación.
Diluyentes (véase la Norma ISO 6887 o la Norma ISO 8621), caldo Giolitti y
Reactivos y
Cantoni modificado (medio base, disolución de telurito potásico), medio de agar
medios de
Baird-Parker, medio de agar de plasma de conejo y fibrinógeno, caldo infusión
cultivo:
de cerebro y corazón, plasma de conejo.
instrumentos: frasco anaeróbico.
Se preparan de acuerdo con la parte apropiada de la norma ISO 6887, o de la
Preparación de norma ISO 8621, o con la norma internacional específica adecuada para el
la muestra: producto. Si no existe una norma internacional específica, se recomienda que las
Método de detección (se informa la presencia o ausencia de estafilococos
Expresión de
coagulasa positivos por gramo o mL), método de recuento (cálculos de acuerdo a
resultados:
la norma ISO 7218:1996 apartado 9.4).
35
Concordancia
internacionales:
Staphylococcus auerus ATCC 6538P o Staphylococcus auerus ATCC 25923, E.
Cepas de
referencia : coli ATCC 8732 o 25922.
BS 5763: Part 7: 1983
Objetivo y
aplicación:
Inoculación en medio selectivo en placa (por duplicado), inoculación usando
diluciones seriadas, incubación de las placas a 35 °C o 37 °C durante 24 h a 48 h,
Fundamento:
prueba de coagulasa confirmatoria, cálculo de número de colonias por ml o por
mg de producto.
Procedimiento: Dilución, inoculación, incubación, platos selectivos, prueba confirmatoria.
Reactivos y Medio base Baird-Parker adicionado con telurito, sulfamazatina, piruvato de

medios de sodio y emulsión de yema de huevo; caldo infusión cerebro corazón, plasma de
cultivo: conejo.
Aparatos e
instrumentos:
Preparación de
la muestra:
Expresión de
resultados:

Concordancia
con normas ISO 6888-1983.
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
BAM Capítulo 12: Staphylococcus aureus
Objetivo y
aplicación:
Alimentos donde se espera un elevado número de Staphylococcus. Aislamiento y
Fundamento: recuento de S. aureus, prueba de coagulasa, pruebas complementarias,
identificación de alguna característica típica de 2 cepas de S. aureus, S.
36
epidermidis, y Micrococci.
Dilución, inoculación, incubación por 45 h -48 h a 35 °C, conteo y colecta de

colonias presuntivas, prueba de coagulasa, prueba de catalasa, utilización
Procedimiento: anaeróbica de glucosa, utilización anaeróbica de manitol, sensibilidad a
lisostafina, producción de nucleasa termoestable, identificación de alguna
característica típica de 2 cepas de S. aureus, S. epidermidis, y Micrococci.
Medio Baird-Parker (M17), agar tripticasa soya (TSA) (M152), caldo infusión
Reactivos y cerebro corazón (M24), agar plasma (conejo) coagulasa con EDTA toluidina
medios de azul-ADN (M148), agar lisostafina triptona extracto de levadura (M165), aceite
cultivo: de parafina, tampón salino de fosfato 0.02 M (R61) conteniendo 1 % NaCl,
prueba de catalasa (R12).
Aparatos e
instrumentos:
Preparación de
la muestra:
Expresión de
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
Concordancia
con normas AOAC 975.55.
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
Objetivo y
aplicación:
Detección de Satphylococcus spp. Por el método del número más probable
Fundamento: (NMP) en muestras con un número bajo esperado de Staphylococcus y contenido
de especies competitivas.
Determinación del NMP. dilución, inoculación en medio selectivo líquido, medio
selectivo sólido, aislar en medio selectivo sólido, transferir a medio selectivo
líquido para recuento, identificación y confirmación de S. aureus por prueba de
Procedimiento: coagulasa, prueba de catalasa, utilización anaeróbica de glucosa, utilización
anaeróbica de manitol, sensibilidad a lisostafina, producción de nucleasa
termoestable, identificación de alguna característica típica de 2 cepas de S.
aureus, S. epidermidis, y Micrococci. Reportar de acuerdo a tablas de NMP.
37
Medio Baird-Parker (M17), agar tripticasa soya (TSA) (M152), caldo infusión
cerebro corazón (M24), agar plasma (conejo) coagulasa con EDTA toluidina
Reactivos y
azul-ADN (M148), agar lisostafina triptona extracto de levadura (M165), aceite
medios de
de parafina, tampón salino de fosfato 0.02 M (R61) conteniendo 1 % NaCl,
cultivo:
prueba de catalasa (R12), caldo tripticasa de soya (TSB) conteniendo 10 % NaCl
y 1 % piruvato de sodio (M154a).
Aparatos e
instrumentos:
Preparación de
la muestra:
Expresión de
NMP x gramo o por mL.
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
Concordancia
con normas AOAC 987.09.
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
3.1.4Detección de Salmonella spp.
Todos los miembros del genero Salmonella son bacilos Gram (-), de 0.7 µm a 1.5 µm de diámetro y
de 2 µm a 5 µm de longitud, su temperatura de crecimiento oscila entre 7 °C y 48 °C. La mayoría
son bacterias móviles por la presencia de abundantes flagelos perítricos, a excepción de S. pullorum
y S. gallinarum. Son bacterias anaerobias facultativas, no encapsuladas y no esporuladas que se
caracterizan por ser el grupo más complejo, por su gran diversidad bioquímica y serológica (Doyle
et al., 1997). El género Salmonella se divide en dos especies: Salmonella enterica (se subdivide en
seis subespecies que son designados por nombres o números romanos) y Salmonella bongori,
designada originalmente S. enterica subespecie V; desde entonces se ha designado como una
especie separada de Salmonella, sin embargo, por simplicidad y conveniencia, se sigue
denominando "subespecie V" (CDC, 2008).
NOM-114-SSA1-1994
38
Objetivo y
campo de Método general para la determinación de Salmonella en alimentos.
aplicación:
Detección de Salmonella en alimentos en un esquema general de 5 pasos:
Fundamento: Preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, selección en medios sólidos,
identificación bioquímica, serotipificación.
Preparación de la muestra. Incubar de 18 h a 24 h a 35 °C o para alimentos
fuertemente contaminados a 42 °C. Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y
estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una
tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico
Hektoen, agar sulfito de bismuto o agar SS). Incubar las placas por 24 h ± 2 h a
35 ºC. Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de
Salmonella. Identificación bioquímica (Seleccionar al menos dos colonias típicas
Procedimiento: de cada medio selectivo, inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro
(TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), Incubar por (24 ± 2) h a 35 °C.
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias de Salmonella.
Prueba de ureasa (prueba de ureasa convencional y rápida). Identificación
serológica (ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella). Pruebas
bioquímicas complementarias (Agar citrato Simmons, medio SIM, caldo RM-VP,
prueba de Voges-Proskauer (VP), prueba de rojo de metilo (RM), caldo
malonato, caldo manitol).
Medios de preenriquecimiento (agua peptonada tamponada, caldo lactosado,
caldo de enriquecimiento, caldo selenito-cistina, caldo tetrationato, Vassiliadis-
Rappaport, caldo de soya tripticasa, leche descremada reconstituida, caldo de
soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de potasio), medios de aislamiento
(Agar verde brillante (VB), agar con sulfito de bismuto, agar xilosa lisina
desoxicolato (XLD), agar para Salmonella y Shigella (SS), agar entérico
Reactivos y
Hektoen), medios para pruebas bioquímicas (Agar de tres azúcares y hierro
medios de
(TSI), agar de hierro y lisina (LIA), agar nutritivo, medio de SIM (para sulfuro,
cultivo:
indol y movilidad), agar citrato de Simmons, caldo manitol, caldo malonato,
caldo urea, caldo de urea rápido, caldo infusión cerebro corazón), soluciones
(Disolución verde brillante al 0.1 %, disolución de yodo-yoduro, disolución
salina al 0.85 %, disolución salina formalizada, reactivo de Kovac, disolución de
alfa-naftol al 5 %, disolución de rojo de metilo, disolución de hidróxido de
potasio al 40 %, disolución de gelatinasa al 5 %, antisueros.
Aparatos e Hornos, autoclaves, incubadoras, licuadora, microscopio, tubos, cajas Petri,
instrumentos: pipetas, varillas de vidrio.
Procedimiento general para la preparación de muestras: pesar asépticamente 25 g
de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en
homogeneizador peristáltico (stomaquer). Adicionar 225 ml del medio de
preenriquecimiento estéril (generalmente caldo lactosado) y licuar si es necesario
durante un min. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un
Preparación de
recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a
la muestra:
temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el
pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6.8 ± 0.2 con
hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el
recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar 24 h ± 2 h a 35 ºC. Este
procedimiento puede variar dependiendo el tipo de muestra.
39
Expresión de
Presencia o ausencia de Salmonella en g o ml de muestra.
resultados:
Informe de la
Informar presencia o ausencia de Salmonella en g o ml de muestra.
prueba:
Concordancia
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
UNE-EN ISO 6579:2003
Objetivo y
Método horizontal para la detección de Salmonella, incluyendo S. typhi y S.
campo de
paratyphi. Aplicable a los productos para consumo humano o animal.
aplicación:
Detección de Salmonella en cuatro etapas sucesivas: preenriquecimiento en
Fundamento: medio líquido no selectivo, enriquecimiento en medio líquido selectivo, siembra
en placa e identificación, confirmación de identidad.
Preparación de la muestra. Preenriquecimiento no selectivo. Incubación a 37 °C
por 18 h. Enriquecimiento selectivo. Incubación a 41.5 °C durante 24 h. Siembra
en placa e identificación. Confirmación (selección de colonias para
confirmación), confirmación bioquímica (Agar TSI, agar urea, medio para la
descarboxilación de la L-lisina, detección de la β-galactosidasa, medio para la
Procedimiento:
reacción de Voges-Proskauer, medio para la reacción del indol). Interpretación de
las pruebas bioquímicas. Confirmación serológica y serotipado (eliminación de
las cepas autoaglutinables, comprobación de los antígenos O, comprobación de
los antígenos Vi, comprobación de los antígenos H). Interpretación de las
reacciones bioquímicas y serológicas. Confirmación definitiva.
Medio de preenriquecimiento no selectivo (agua de peptona tamponada), primer
medio de enriquecimiento selectivo (medio de Rappaport-Vassiliadis con soya),
segundo medio de enriquecimiento selectivo: caldo de Muller - Kauffmann
Reactivos y
tetrationato novobiocina), medios sólidos selectivos en placa (agar xilosa lisina
medios de
desoxicolato, XLD), agar nutritivo, agar triple azúcar hierro (TSI), agar urea,
cultivo:
medio para la descarboxilación de la L-lisina, reactivo para la detección de la β-
galactosidasa, reactivos para la reacción de Voges-Proskauer, reactivos para la
reacción del indol, agar nutritivo semisólido, disolución salina fisiológica, sueros.
Aparatos e Hornos, autoclaves, incubadoras, baños de agua, tubos, cajas Petri, pipetas,
instrumentos: varillas de vidrio.
Preparación de
la muestra:
Expresión de
Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml de producto.
resultados:
40
Deberá especificar: método de toma de muestra empleado, cualquier desviación

en el medio de enriquecimiento empleado o en las condiciones de incubación,
Informe de la
todos los detalles operativos no especificados en esta norma internacional junto
prueba:
con los detalles de todo tipo de incidencias que pudieran haber afectado a los
resultados, resultados obtenidos.
Concordancia
con normas ISO 6579:2002.
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
Objetivo y
aplicación:
Preparación de la muestra, aislamiento de cepas con medios selectivos,
Fundamento:
identificación de cepas con pruebas bioquímicas y serológicas.
1. Aislamiento de la muestra: Mezclar suavemente la dilución con muestra,
inocular en medio selectivo RV, TT o SC por 24 h a 35 °C , 42 °C o 43 °C
dependiendo de la muestra. A partir del inóculo anterior, sembrar en agar BS,
XLD y HE e incubar 24 h ± 2 h a 35 °C. Examinar morfología típica y atípica.
Inocular colonias presuntivas en agar selectivo TSI y LIA e incubar a 24 h ± 2 h
a 35 °C. A los cultivos que viren alcalino el medio, ensayar las pruebas
bioquímicas. 2. Identificación de Salmonella: Para mezcla de cultivos (inocular
en agar MacConkey, agar HE, o agar XLD, incubar las cajas durante (24 ± 2) h a
35 °C. Cultivos puros (prueba de ureasa convencional o rápida). Prueba
serológica olivalente flagelar. Prueba serológica Spicer-Edwards. Prueba para
Procedimiento:
muestras ureasa negativa (caldo lisina decarboxilasa, caldo fenol rojo dulcitol o
caldo base púrpura con 0.5 % dulcitol. Caldo triptona (caldo cianida de potasio,
caldo malonato, prueba de indol, prueba serológica flagelar (H) para Salmonella).
Prueba serológica somática (O) para Salmonella (prueba somática polivalente O,
prueba de grupo somática O). Pruebas bioquímicas adicionales caldo lactosa rojo
fenol lactosa o caldo púrpura lactosa. Caldo rojo fenol sacarosa o caldo púrpura
sacarosa, caldo MR-VP. Agar citrato de Simons. Clasificación de cultivos.
Identificación genérica presuntiva de Salmonella (kits de pruebas bioquímicas
miniaturizadas). Tratamiento de cultivos negativos a la prueba flagelar (H).
Envío de cultivos para serotipificación a las oficinas de la FDA.
Caldo lactosa (M74), leche en polvo descremada (reconstituida) (M111), caldo
selenito cistina (SC) (M134), caldo tetrationato (TT) (M145), medio Rappaport-
Vassiliadis (RV) (M132). NOTA: Medio RV debe ser preparado de ingredientes
individuales. Formulaciones comerciales no son aceptables, agar xilosa lisina
Reactivos y desoxicolato (XLD) (M179), agar Hektoen enterico (HE) (M61), agar sulfato de
medios de bismuto (BS) (M19), agar triple azúcar hierro (TSI) (M149), caldo triptona
cultivo: (triptofano) (M164), caldo tripticasa de soya (M154), caldo tripticasa de soya con
sulfato de hierro (M186), caldo tripticasa triptosa de soya (M160), caldo MR-VP
(M104), agar citrato de Simmons (M138), caldo urea (M171), caldo urea (rápido)
(M172), caldo malonato (M92), agar lisina hierro (LIA) (M89), caldo lisina
decarboxilasa (M87), prueba en medio de movilidad (semisólido) (M103), caldo
41
cianidina de potasio (KCN) (M126), caldo fenol rojo carbohidrato (M121), caldo
púrpura carbohidrato (M130), agar MacConkey (M91), caldo nutriente (M114),
caldo infusión cerebro corazón (BHI) (M24), disolución de papaina 5 % (M56a),
disolución de celulasa 1 % (M187), agar base triptosa sangre (M166), caldo
universal de preenriquecimiento (M188), caldo universal de preenriquecimiento
(sin citrato amónico de hierro) (M188a), agua peptonada amortiguada (M192),
caldo Dey-Engley (M193), sulfito de potasio anhídrido, disolución de cloro, 200
ppm, conteniendo 0.1 % dodecil sulfato de sodio (R12a), etanol, 70 % (R23),
reactivo de Kovacs (R38), reactivo de prueba Voges-Proskauer (VP) (R89),
cristales de fosfato de creatina, disolución de hidróxido de potasio, 40 % (R65),
disolución hidróxido de sodio (R73), ácido clorhídrico 1 N (R36), disolución de
tinción verde brillante, 1 % (R8), disolución de tinción púrpura de bromocresol,
0.2 % (R9), indicador rojo de metilo (R44), agua destilada estéril, tergitol
aniónico 7 (R78), triton X-100 (R86), disolución salina fisiológica, 0.85 % (R63),
disolución salina fisiológica formalinizada (R27), antisuero Salmonella (O)
somático polivalente, antisuero Salmonella (H) flagelar polivalente, antisuero
Salmonella grupo somático (O): A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F, G,
H, I, Vi, y otros grupos apropiados, antisuero Salmonella Spicer-Edwards
flagelar (H).
instrumentos: pipetas, varillas de vidrio, pH metro.
Los siguientes métodos se basan en el análisis de una unidad analítica de 25 g en
relación 1:9 muestra: caldo. Dependiendo de la composición, añadir caldo
suficiente para mantener esta relación 1:9 a menos que se indique lo contrario.
Para las muestras analizadas en una base de peso no exacto, por ejemplo, ancas
de rana, seguir las instrucciones particulares. Éstas existen para los siguientes
productos: Yema de huevo, clara de huevo secos, huevos enteros secos, leche
líquida (leche descremada, 2 % de grasa de leche, leche entera y suero de leche),
mezclas preparadas en polvo (pasteles, galletas, donas, galletas y pan), leche
maternizada, y alimentación por vía oral o un tubo que contiene huevo. Huevos
en diferentes presentaciones. Leche en polvo. Leche entera en polvo. Caseína.
Harina de soya. Productos que contienen huevo (fideos, rollos de huevo,
macarrones, espaguetis), queso, pasta, ensaladas preparadas (jamón, huevo, pollo,
Preparación de
atún, pavo), frutas y verduras frescas, congeladas o secas, carnes de frutos secos,
la muestra:
crustáceos (camarones, cangrejo, cigalas, langostinos, langosta), y pescado.
Levadura seca (levadura activa e inactiva). Coberturas para helado. Especias.
Revestimiento de dulces y golosinas (incluido el chocolate). Coco. Colorantes de
los alimentos y sustancias alimenticias para colorear. Gelatina. Carnes, sustitutos
de carne, subproductos de la carne, sustancias de origen animal, productos
glandulares y harinas (pescado, carne, hueso). Las ancas de rana. Esqueleto o
carcasas de conejo. Goma guar. Jugo de naranja (pasteurizado y no pasteurizado),
sidra de manzana (pasteurizada y no pasteurizada), jugo de manzana
(pasteurizada). Orejas de cerdo y otros tipos de alimento para perro. Melones.
Mangos. Tomates. Ensayos ambientales. Semillas de alfalfa y frijol. Pulpa de
mamey. Vegetales de hojas verdes y hierbas (espinaca, lechuga romana, cilantro,
perejil rizado, perejil italiano, culantro, repollo y albahaca).
Expresión de
Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml de producto.
resultados:
42
Informe de la
No especifica.
prueba:
Concordancia
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
3.1.5 Detección de Vibrio cholerae, V. vulnificus, V. parahaemolyticus
Vibrio spp. son bacilos Gram negativos que pueden ser rectos, ligeramente curvos, curvos o en
forma de coma de (0.5-0.8) μm x (1.4-2.6) μm, móviles, anaerobios facultativos capaces de utilizar
metabolismo fermentativo y respiratorio, fermentan la glucosa a ácido generalmente sin formación
de gas y algunas especies producen acetoina y acetil metil carbinol (Imhoff, 2005). Se reconocen 73
diferentes especies del género Vibrio, de las cuales 13 se consideran patógenas para los humanos,
tres de las cuales estan asociadas principalmente con enfermedades transmitidas por alimentos:
Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus o Vibrio vulnificus, las cuales generan mayores
repercusiones en la salud pública y en el comercio de pescados y mariscos (Oliver y Kaper, 1997,
Drake et al., 2007). Algunas especies como V. cholerae y V. parahaemolyticus se asocian con
enfermedades gastrointestinales, mientras que V. vulnificus se relaciona con enfermedades
extraintestinales, como la septicemia (Morris, 2003).
NOM-242-SSA1-2009
Establecer los requisitos sanitarios para: las áreas de captura de moluscos

bivalvos; los establecimientos que procesan productos de la pesca frescos,
refrigerados, congelados y procesados, incluyendo las embarcaciones de pesca y
Objetivo y
recolección, así como las especificaciones sanitarias que deben cumplir dichos
campo de
productos. Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el
aplicación:
territorio nacional para las personas físicas o morales que se dediquen a la
captura, extracción, procesamiento, conservación, almacenamiento, distribución,
transporte, venta o importación de productos de la pesca.
Crecimiento en medio selectivo salino, diferenciación e identificación mediante
Fundamento:
pruebas bioquímicas y pruebas serológicas de aglutinación.
Preparación de la muestra (agua peptonada y diluciones seriadas), siembra en
medio sólido selectivo, caracterización morfológica, pruebas bioquímicas
Procedimiento:
selectivas, identificación y confirmación (pruebas bioquímicas previas, tinción de
Gram, pruebas bioquímicas, prueba serológica de alutinación).
Agua peptonada alcalina (APW), agar tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa
Reactivos y (TCBS), agar modificado con celobiosa, polimixina B y colistina (mCPC), agar
medios de T1N1 (Agar triptona y sal), agar gelatina (GA), agar gelatina con sal (GS), caldo
cultivo: glucosa de Hugh-Leifson, medio base de descarboxilasa (Arginina, lisina y
ornitina), caldo triptona y caldos triptona sal T1N0,T1N1,T1N3 y T1N6,T1N8 y
43
T1N10, caldo soya tripticasa (TSB), agar soya tripticasa (TSA), agar de hierro
Kligler (KIA), agar arginina glucosa inclinado (AGS), agar triple azúcar y hierro
(TSI), agar de hierro y lisina (LIA), caldo rojo de metilo y Vogues Proskauer
(RM-VP), medio para prueba de movilidad (Semisólida), prueba de rojo de
metilo, prueba de Vogues-Proskauer, prueba de oxidasa, reactivo de Kovac.
Licuadora y vasos de licuadora estériles, frascos de vidrio de boca ancha con tapa
de rosca, varilla de vidrio, balanza granataria y analítica, incubadoras, cucharas
estériles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de alimentos,
Aparatos e cajas Petri estériles de plástico, pipetas estériles, azas bacteriológicas, tubos de
instrumentos: cultivo o de ensayo,tubos para bioquímicas o ensaye, tijeras y pinzas estériles,
lámpara (para observar reacciones serológicas), mecheros, papel pH,
potenciómetro, bolsas de polietileno con tapa resellable, aparato de filtración y
membranas de 0.45 micras.
Las submuestras de pescado ahumado en filete deben analizarse individualmente.
1. Incubación de las muestras a 35 °C -37 °C. De cada submuestra tomar 25 g,
cortar en piezas pequeñas e introducirlas en un vaso de licuadora de 500 ml de
capacidad que contenga 225 ml de agua peptonada alcalina (APW) y
homogeneizar por 2 min a la máxima velocidad. Esta es la dilución 1:10. De esta
dilución preparar la dilución 1:100 y 1:1000, en 9 o 90 ml de agua peptonada
alcalina. Incubar las tres diluciones de 35 °C a 37 °C. 2. Incubación de las
Preparación de
muestras de 35 °C -37 °C y 42 °C. Si se van a incubar los enriquecimientos a dos
la muestra:
temperaturas para una muestra, homogeneizar una porción de 50 g de cada
submuestra en 450 ml de agua peptonada alcalina (APW). Esto hace la dilución
1:10. Verter 250 ml (g) de la dilución 1:10 a un segundo recipiente estéril.
Prepare dos series de diluciones de 1:100 y 1:1000. Por lo tanto tenemos dos
series de 3 diluciones.
Incubar una serie de 35 °C a 37 °C y la otra a 42 °C. Proseguir con el paso de
resiembra marcado en la NOM-031-SSA1-1993.
Expresión de
Presencia o ausencia en la porción de la muestra en gramos o mililitros
resultados:
Informe de la
No especifica
prueba:
Codex Alimentarius. ALINORM 01/18. Apéndice V. Anteproyecto de código
internacional recomendado de prácticas para el pescado y los productos
pesqueros, Codex Alimentarius. ALINORM 01/18. Apéndice III. Anteproyecto
de enmienda a la norma de sardinas y productos análogos en conserva, Codex
Alimentarius. ALINORM 01/18. Apéndice VI. Anteproyecto de norma para el
arenque del atlántico salado y el espadín salado, Codex Alimentarius. ALINORM
95/18. Apéndice VII. Proyecto de norma revisada para barritas, porciones y
Concordancia
filetes de pescado empanados o rebozados congelados rápidamente, Codex
con normas
Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice IX. Proyecto de norma revisada para
internacionales:
la carne de cangrejo en conserva, Codex Alimentarius. ALINORM 95/18.
Apéndice X. Proyecto de norma revisada para pescados en conserva, Codex
Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice XI. Proyecto de norma revisada para
el salmón en conserva, Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice XII.
Proyecto de norma revisada para las sardinas y productos análogos en conserva,
Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice XIII. Proyecto de norma
revisada para los camarones en conserva, Codex Alimentarius. ALINORM
44
95/18. Apéndice XIV. Proyecto de norma revisada para el atún y el bonito en

conserva., Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice XV. Proyecto de
norma revisada para pescado salado y pescado seco salado de la familia Gadidae.
Cepas de
No especifica
referencia :
ISO/TS 21872-1:2007
Objetivo y Dirigida a detectar cepas patógenes de V. parahaemolyticus y V. cholerae.

campo de Productos para consumo humano y alimentación animal, muestras ambientales en
aplicación: el área de manejo y producción de alimentos.
Crecimiento en dos medios líquidos de enriquecimiento y selectivos, aislamiento
Fundamento: e identificación en placas de agar selectivo, confirmación con pruebas
bioquímicas.
Porción de prueba y suspensión inicial con medio de enriquecimiento, primer
medio selectivo de enriqueciomiento e incubar 37 °C o 41.5 °C por 6 h, segundo
medio selectivo de enriquecimiento e incubar a 41.5 °C por 18 h, aislamiento en
Procedimiento: medio sólido selectivo 37 °C por 24 h, identificación presuntiva por kits
comerciales que usen medios selectivos similares a los descritos en la norma,
pruebas de oxidasa, observación microscópica, pruebas bioquímicas para
selección, confirmación por puebas bioquímicas.
Medio de enriquecimiento: Agua peptonada salina alcalina (ASPW), agar
sacarosa, tiosulfato, citrato y billis (TCBS), opcional: Agar soya peptona trifenil
cloro de tetrazolio (TSAT), agar nutriente salino (SNA), reactivo para detección
Reactivos y
de oxidasa, agar triple azúcar salino hierro (TSI), medio salino para la detección
medios de
de ornitina descarboxilasa (ODC), medio salino para detección de lisina
cultivo:
descarboxilasa (LDC), medio salino para detección de arginina dihidrolasa
(ADH), reactivo para detección de β-galactosidasa, medio salino para detección
de indol, agua peptonada salina, disolución de cloruro de sodio.
Aparatos e
Hornos, autoclaves, incubadoras, baños de agua, material de vidrio básico.
instrumentos:
Preparación de Preparar la muestra de acuerdo a la parte correspondiente de ISO 6887 y/o ISO
la muestra: 8261 y cualquier estándar internacional concerniente al producto examinado.
Presencia o ausencia de Vibrio spp. potencialmente enteropatogénico en una
Expresión de
porción en gramos o mililitros del producto especificando el nombre de las
resultados:
especies relevantes.
Identificación de la muestra, el método de muestreo utilizado, caulquier
desviación respecto a las condiciones del medio de enriquecimiento o las
condiciones de incubación, todos los detalles operacionales no especificados u
Informe de la
opcionales en el estándar internacional ISO/TS 21872 junto con aquellos
prueba:
incidentes que pudieron haber influído en el resultado de la prueba, los resultados
obtenidos y en particular si fue confirmada la patogenicidad de la+AC14s cepas
aisladas.
Concordancia
con normas No especifica
internacionales:
Cepas de No especifica
45
referencia :
BS 5763: Part 14: 1991
Objetivo y
campo de Productos para consumo humano y animal. Vibrio parahaemolyticus.
aplicación:
Enriquecimiento en medio selectivo líquido incubación a 35 °C o 37 °C durante 7
Fundamento: h u 8 h ; inoculación en medio selectivo en placa a 35 °C o 37 °C durante 18 h,
24 h a 48 h; pruebas confirmatorias bioquímicas.
Dilución, enriquecimiento, platos selectivos e identificación, prueba
Procedimiento:
confirmatoria.
Medio enriquecimiento caldo sal-polimixina B, agua peptonada salina alcalina,
medio de cultivo salino de glucosa con dodecil sulfato de sodio. Medio de
plaqueo: Agar tiosulfato citrato bilis sacarosa bilis (TCBS); agar cloruro de
trifeniltetrazolio triptona de soya (TSAT); agar nutriente salino. Medio de
Reactivos y
indentificación: Agar salino triple azúcar hierro; agar salino carne levadura;
medios de
medio salino para detección de lisina descarboxilasa; medio y reactivos para
cultivo:
detección de indol (Medio salino triptona triptofano, reactivo de Kovacs);
reactivo para detectar oxidasa; reactivo para detección de β-galactosidasa
(disolución ONPG, disolución tampón, reactivo completo); disolución de cloruro
de sodio; polvo de zinc.
instrumentos: pipetas, varillas de vidrio.
Preparación de
la muestra:
Expresión de
Presencia o ausencia x gramo o por mL.
resultados:

Concordancia
con normas ISO 8914-1990.
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
BAM Chapter 9. V. cholerae
Objetivo y
aplicación:
Crecimiento en medio selectivo salino, pruebas bioquímicas, kit de diagnóstico
Fundamento:
rápido API 20E, identificación por medio de sondas de ADN, identificación por
46
medio de PCR.
Enriquecimiento y siembra, detección y confirmación, pruebas bioquímicas,

diferenciación de biotipos el Tor y clásico, determinación de enterotoxigenicidad,
Procedimiento:
detección genotípica del gen de la toxina del cólera mediante la reacción en
cadena de la polimerasa.
Agua peptonada alcalina (APW) (M10), Medio AKI (M7), placas de arginina
glucosa (AGS) (M16), agar sangre (M20), caldo de extracto de levadura
casaminoácidos (CAYE) (M34), agar modificado celobiosa polimixina colistina
(mCPC) (M98), agar celobiosa colistina (CC) (M189), medio de prueba de
movilidad-1 % NaCl (M103), reactivo de oxidasa (N,N,N,N'-tetrametil-p-
fenilenediamina-HCl en dH2O) (R54), diluyente peptona-Tween-sal (PTS) (90),
tampón salino de fosfatos (PBS) (R59), discos de polimixina B (50 U Difco o
equivalente) (R64), disolución salina 0.85 % en dH2O (R63), disolución NaCl al
Reactivos y
2 % (R71), desoxicolato de sodo - 0.5 % en dH2O (R91), agar tiosulfato citrato
medios de
sales biliares sacarosa (TCBS) (M147), agar T1N1 y T1N3 (1 % triptona y 1 % o
cultivo:
3 % NaCl respectivamente) (M163), caldo T1N0, T1N3, T1N6, T1N8, T1N10
(M161), agar tripti soya sulfato de magnesio – 3 % NaCl (TSAMS) (32), caldo y
agar tripticasa de soya (TSB) (TSA) (M152) (con NaCl, 2 %), TSB-1 % NaCl-24
% glicerol, caldo urea (M171) o agar urea Christensen (M40) con NaCl (2 %)
(R71), anti suero V. cholerae polivalente O1 y O139, kit de detección de
enterotoxina VET-RPLA TD920A (Oxoid, Inc.), agar sacarosa Vibrio
parahaemolyticus (VPSA) (M191), agar Vibrio vulnificus (VVA) (M190),
reactivos y tiras reactivas de diagnóstico API 20E (BioMerieux).
asa, microscopio, pHmetro, microondas, incubadoras con agitación, filtros,
Aparatos e
membranas de nylon, pantallas de malla de fibra de vidrio, palillos, soluciones
instrumentos:
extracción de proteínas y ácidos nucleicos, agentes bloqueadores, reactivos para
inmunuensayos.
La muestra debe ser enfriada inmediatamente después de ser colectada (alrededor
de 7 °C a 10 °C), las muestras deben ser analizadas tan pronto como sea posible.
Se debe evitar el contacto directo con el hielo para maximizar la supervivencia y
Preparación de
la recuperación de los vibrios. Los vibrios pueden ser dañados por el
la muestra:
enfriamiento rápido, pero crecen rápidamente en productos del mar a temperatura
ambiente. De ser necesario, se recomienda congelar las muestras a una
temperatura de -80 °C.
Expresión de
Resultado positivo o negativo.
resultados:
Informe de la El informe final para V. cholerae debe incluir la identificación bioquímica y

prueba: serológica de la cepa y los resultados enterotoxicidad.
Concordancia
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
47
BAM Chapter 9. V. parahaemolycus
Objetivo y
aplicación:
Fundamento: rápido API 20E, identificación por medio de sondas de ADN, identificación por
medio de PCR.
1. Enriquecimiento, aislamiento y enumeración, 2. Detección y confirmación
(identificación bioquímica de los aislados, procedimiento de cuenta por filtración
Procedimiento: en membrana hidrofóbica (HGMF), tipificación serológica), 3. Determinación de
patogenicidad (detección genotípica de los genes de hemolisina de V.
parahaemolyticus).
Agua peptonada alcalina (APW) (M10), medio AKI (M7), placas de arginina
Reactivos y
medios de
cultivo:
% glicerol, caldo urea (M171) o agar urea Christensen (M40) con NaCl (2 %)
Materiales, asa, microscopio, pHmetro, microondas, incubadoras con agitación, filtros,
aparatos e membranas de naylon, pantallas de malla de fibra de vidrio, palillos, soluciones
instrumentos: de extracción de proteínas y ácidos nucleicos, agentes bloqueadores, reactivos
para inmunoensayos.
Preparación de
la muestra:
Expresión de
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
48
Concordancia
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
BAM Chapter 9. V. vulnificus
Objetivo y
campo de Productos para consumo humano de origen marino.
aplicación:
Fundamento: rápido API 20E, identificación por medio de sondas de ADN, identificación por
medio de PCR.
Método de identificación y recuento: 1. Enriquecimiento, aislamiento y cuenta, 2.
Identificación bioquímica de los aislados, 3. Identificación del gen específico de
Procedimiento: especies específicas del gen citolisina vvhA por medio de sonda de ADN, 4.
Recuento de V. vulnificus por sondas de ADN, 5. Confirmación de V. vulnificus
por reacción en cadena de polimerasa.
Agua peptonada alcalina (APW) (M10), medio AKI (M7), placas de arginina
Reactivos y
medios de
cultivo:
% glicerol, caldo urea (M171) o agar urea Christensen (M40) con NaCl (2%)
Materiales, asa, microscopio, pHmetro, microondas, incubadoras con agitación, filtros,
aparatos e membranas de naylon, pantallas de malla de fibra de vidrio, palillos, soluciones
instrumentos: para extracción de proteínas y ácidos nucleicos, agentes bloqueadores, reactivos
para inmunoensayos.
Preparación de
la muestra:
49
Expresión de
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
Concordancia
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
50
3.2 COLECCIÓN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS
NOM-109-SSA1-1994
Objetivo y
Establece los procedimientos para la toma, transporte y manejo de muestras de
campo de
alimentos para su análisis microbiológico.
aplicación:
Fundamento: No especifíca.
Obtención (La toma de muestra de productos envasados con presentación
comercial para venta al menudeo se llevará a cabo en forma aleatoria y no
aséptica, tomándose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus análisis.
Tratándose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir éstos
y extraer la muestra en condiciones asépticas Los alimentos expuestos al aire
libre y a otras contaminaciones, no requieren precauciones estrictamente
Procedimiento: asépticas. En el caso de alimentos líquidos o semilíquidos se deberá agitar o
mezclar hasta conseguir homogeneizar y después efectuar la toma de la muestra
en diferentes niveles). Identificación de la muestra. Conservación y transporte (El
manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se
impida su ruptura, alteración o contaminación, evitando su exposición a la luz
solar directa). Para la conservación, durante el transporte de las muestras no está
permitido el empleo de sustancias químicas.
Reactivos y
medios de Etanol o isopropanol al 70 %, agua clorada, tiosulfato de sodio.
cultivo:
Materiales,
Autoclave, horno, licuadora, tubos, pipetas, varillas de vidrio, frascos, material
aparatos e
para toma de muestra.
instrumentos:
Todo el material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la toma, manejo
y transporte de muestras, que van a estar en contacto directo con el alimento,
debe estar limpio, estéril y libre de sustancias que pudieran afectar la viabilidad
de los microorganismos. El material que se utilice para la toma de muestra debe
Preparación de
ser esterilizado. Una vez esterilizado el material debe ser protegido para evitar
la muestra:
contaminación posterior. De ser necesario, si se requiere mayor número de
utensilios, limpiar los que hayan sido usados y empaparlos con etanol o
isopropanol al 70 %, posteriormente flamearlos y colocarlos en recipientes
estériles para evitar su contaminación o inmediatamente utilizarlos.
Expresión de
No especifica.
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
Concordancia
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
51
BAM Capítulo 1. Muestreo de alimentos y preparación de la muestra homogeneizada
Objetivo y
Procedimiento para el muestreo de alimentos y preparación de una muestra
campo de
homogeneizada.
aplicación:
La adecuación y estado de la muestra o espécimen recibido para su evaluación
son de importancia primordial. Si las muestras no son colectadas o manipuladas
adecuadamente o no son representativas del lote objeto de muestreo, los
Fundamento: resultados de laboratorio no tendrá ningún sentido. Una muestra representativa es
esencial cuando los patógenos o toxinas están escasamente distribuidos dentro de
la comida o cuando la eliminación de un cargamento de alimentos depende del
contenido bacteriano demostrado, en base con una norma jurídica.
Recepción de muestras. 1. La muestra oficial de los alimentos es recolectada por
el inspector de la FDA o el investigador. El analista debe tener en cuenta su
condición física general. Si la muestra no puede ser analizada inmediatamente,
debe ser almacenada como se describe más adelante. 2. Condiciones del
recipiente de muestreo. Revise de graves defectos físicos a los contenedores de
muestras, de fugas, agujeros, marcas de pinchazos, fracturas, tapas sueltas.
Cualquier contaminación cruzada como resultado de uno o más de los defectos
anteriores invalidaría la muestra. 3. Etiquetado y registros. Asegúrese de que
cada muestra se acompaña de una copia completa del informe de la colecta
(Formulario FD-464), que se encuentra sellado con la cinta oficial (FD-415a),
que lleva el número de la muestra, el nombre del oficial que tomó la muestra y la
fecha. Asigne a cada unidad de muestra un número de unidad individual y
analizar como una unidad discreta a menos que la muestra sea compuesta como
se describió anteriormente en este capítulo. 4. La adherencia al plan de muestreo.
La mayoría de los alimentos se recogen con un plan de muestreo diseñado
específicamente. Los alimentos que se examinaron para Salmonella se muestrean
de acuerdo con un plan de muestreo con base estadística diseñada exclusivamente
para su uso con este patógeno. Dependiendo de la comida y el tipo de análisis a
realizar, determinar si se han tomado muestras del alimento de acuerdo con el
Procedimiento:
plan de muestreo adecuado. 5. Almacenamiento. Examinar las muestras
inmediatamente después de recibirla. Si el análisis debe ser pospuesto, almacenar
las muestras congeladas a -20 °C hasta su análisis. Refrigerar las muestras
perecederas descongeladas a 0 °C -4 °C por no más de 36 h. Los productos no
perecederos, alimentos enlatados o de baja humedad, serán almacenados a
temperatura ambiente hasta su análisis. 6. Notificación al departamento de toma
de muestra. Si una muestra no cumple con los criterios anteriores y por tanto no
se analizó, notificar al departamento de toma de muestra para que una muestra
válida pueda obtenerse. C. Descongelación. Manipule asépticamente el producto.
Antes de la manipulación o el análisis de la muestra, limpiar las áreas de trabajo
y sus alrededores con una torunda impregnada con agente germicida comercial.
Preferentemente, no descongelar las muestras congeladas antes del análisis. Si es
necesario templar una muestra congelada para obtener una porción analítica,
descongelarlo en el envase original o en el recipiente en el que fue recibido en el
laboratorio. Evite la transferencia de la muestra a un segundo recipiente para la
descongelación. Normalmente, una muestra puede ser descongelada a (2 – 5) °C
durante 18 horas. Si se desea una descongelación rápida, descongelar la muestra
a menos de 45 °C durante no más de 15 min. Cuando se descongele una muestra
a temperatura elevada, agitar continuamente la muestra en un baño de agua
52
controlado termostáticamente. D. Mezclado. Agitar fuertemente las muestras

líquidas y mezclar las muestras secas con cucharas u otros utensilios
esterilizados, antes de tomar la unidad de análisis de la muestra de 100 g o más.
Utilice una unidad de análisis de 50 g de líquido o alimento seco para determinar
el recuento en placa de bacterias aeróbicas y el número más probable de
coliformes. Pueden ser recomendados otros tamaños de las unidades de análisis
(por ejemplo, 25 g de Salmonella), en función de un análisis específico a realizar.
Use el tamaño de la unidad de análisis y el volumen de diluyente recomendado
para el método que se utiliza. Si el contenido del paquete no es homogéneo (por
ejemplo, una comida congelada), macerar todo el contenido del paquete y retirar
la unidad de análisis, o analizar cada porción de comida diferente por separado,
dependiendo del propósito de la prueba. E. Pesado. Tarar el vaso de la licuadora,
luego asépticamente y con precisión (± 0.1 g) pesar los alimentos sin descongelar
(si está congelado) en el vaso. Si la muestra entera pesa menos de la cantidad
requerida, pesar la porción equivalente a la mitad de la muestra y ajustar la
cantidad de diluyente o caldo. El volumen total en la licuadora debe cubrir
completamente las cuchillas. F. La mezcla y dilución de las muestras que
requieren recuento de microorganismos. 1. Todos los alimentos que no sean
nueces enteras o comida con nueces. Añadir 450 ml de agua diluyente Butterfield
amortiguador de fosfato al vaso de la licuadora que contiene 50 g de unidad
analítica y mezclar durante 2 min, resultando una dilución de 10-1. Sin demorar
hacer diluciones del homogeneizado original. Usar las capacidades adecuadas de
las pipetas. Preparar todas las diluciones decimales con 90 ml de diluyente estéril
más 10 ml de dilución previa, a menos que se especifique lo contrario. Agitar
enérgicamente todas las diluciones 25 veces en forma de un arco de 30 cm (1 pie)
en 7 s. No deberá transcurrir más de 15 min entre la mezcla de la muestra y la
preparación de todas las diluciones. 2. Nueces en mitad y pedazos más grandes.
Asépticamente pesar una unidad analítica de 50 g en un frasco estéril con tapón
de rosca. Añadir 50 ml de diluyente (G-1, arriba) y agitar vigorosamente 50 veces
en forma de arco de 30 cm para obtener una dilución 100. Dejar reposar de 3 min
a 5 min y agitar 5 veces en forma de arco de 30 cm para volver a suspender justo
antes de hacer las diluciones seriadas y las inoculaciones. Comida con nueces.
Asépticamente pesar una unidad analítica de 10 g un un frasco estéril con tapón
de rosca. Añadir 90 ml de diluyente (Gl, arriba) y agitar vigorosamente 50 veces
en forma de arco de 30 cm para obtener una dilución 100. Dejar reposar de 3 min
a 5 min y agitar 5 veces en forma de arco de 30 cm para volver a suspender justo
antes de hacer las diluciones seriadas y las inoculaciones.
Reactivos y
medios de Hielo, agua diluyente Butterfield amortiguador de fosfatos (Rll).
cultivo:
Licuadora mecánica con frasco de vidrio o metal esterilizable con tapa, balanza
de 2 000 g de capacidad, sensibilidad de 0.1 g, vasos estériles, pipetas graduadas,
botellas, cuchillos, tenedores, espátulas, pinzas, tijeras, cucharas, abate lengua,
Materiales, cinta adhesiva, horno, autoclave, recipientes limpios, secos, a prueba de fugas,
aparatos e de boca ancha, estériles y de un tamaño adecuado para las muestras del producto,
instrumentos: contenedores, tales como frascos de plástico o latas de metal pueden ser cerrados
herméticamente, cajas estériles de metal, latas, bolsas o paquetes con cierres
adecuados, bolsas de plástico estériles (para materiales secos, sin congelar
solamente) o botellas de plástico, cinta adhesiva.
53
Planes de muestreo. 1. Especies de Salmonella; a) Colecta de la muestra, la

asignación a una categoría de muestreo de los alimentos depende de 1) la
sensibilidad del grupo de consumidores (por ejemplo, los ancianos, los enfermos
y los niños), 2) la posibilidad de que los alimentos pueden haber sufrido un paso
que pueda ser letal para Salmonella durante el proceso de manufactura o en el
hogar, y 3) la historia de la comida. Clasificación de los alimentos I. - Los
alimentos que normalmente no serían sometidos a un proceso letal para
Salmonella entre el momento de la extracción y el consumo y que están
destinados para el consumo de los ancianos, los enfermos y los niños.
Clasificación de los alimentos II. - Los alimentos que normalmente no serían
sometidos a un proceso letal para Salmonella entre el momento de la extracción y
el consumo. Clasificación de los alimentos III. - Alimentos que normalmente se
someten a un proceso letal para Salmonella entre el tiempo de muestreo y el
consumo. Una unidad de muestra se compone de un mínimo de 100 g y es
generalmente un recipiente del tamaño de la porción de consumo. Tome las
unidades de muestreo al azar para asegurar una muestra representativa del lote.
Cuando se utilizan envases para la muestra, deberá presentar un control que
consiste en un recipiente con la muestra vacía que será expuesta a las mismas
condiciones que aquellas en que se recolectó la muestra. Tomar más de una
unidad de muestra de los recipientes a granel de mayor tamaño o cuando el
número de unidades de muestra requeridas excede el número de contenedores en
el lote. Una unidad de muestra consistirá en más de un contenedor cuando los
envases son más pequeños que 100 g (por ejemplo, cuatro recipientes de 25 g
podría constituir una unidad de muestra). El número de unidades de muestra que
Preparación de han de recogerse en cada categoría de alimentos son los siguientes: Clasificación
la muestra: de los alimentos I, 60 unidades de la muestra; alimentos categoría II, 30 unidades
de la muestra; alimentos categoría III, 15 unidades de la muestra. Enviar todas las
muestras recogidas al laboratorio para su análisis. Avisar al laboratorio antes del
envío de muestras perecederas. b) Análisis de la muestra, tomar una unidad al
azar de 25 g de cada unidad de muestra de 100 g para su análisis. Cuando una
unidad de muestra conste de más de un contenedor, mezclar asépticamente los
contenidos de cada recipiente antes de tomar los 25 g de unidad analítica. Para
reducir la carga de trabajo analítico, las unidades de análisis pueden ser
compuestas. El tamaño máximo de una unidad compuesta es de 375 g ó 15
unidades de análisis. El número mínimo de unidades compuestas para ser
analizadas para cada categoría de alimentos es el siguiente: Clasificación de los
alimentos I, 4 unidades compuestas; alimentos categoría II, 2 unidades
compuestas; alimentos categoría III, una unidad compuesta. Para cada muestra
compuesta de 375 g, la cantidad total de 375 g se analizá para Salmonella.
Conservar el resto de la unidad de muestra en un recipiente estéril. El lote objeto
de muestreo es aceptable sólo si todas las unidades de análisis son negativas para
Salmonella. Si una o más unidades de compuestos son positivos para Salmonella,
el lote es rechazado, siempre que el control analítico sea negativo para
Salmonella. Un lote no se vuelve a muestrear a menos que el control ambiental
para Salmonella sea positivo. Para todas las muestras positivas a Salmonella,
determinar el grupo somático. c) Importaciones. Estos planes se aplican a los
productos alimenticios importados destinados al consumo humano. d)
Clasificación de los productos alimentarios para la obtención de muestras. Los
alimentos que se hayan clasificado en las 3 categorías descritas anteriormente
para la toma de muestras se enumeran en las categorías de acuerdo a la
54
nomenclatura y código de producto de la industria. Clasificación de los alimentos

I. - Los alimentos que normalmente no serían sometidos a un proceso letal para
Salmonella entre el momento de la extracción y consumo, y están destinados para
el consumo de los ancianos, los enfermos y los niños. Clasificación de los
alimentos II. - Los alimentos que normalmente no serían sometidos a un proceso
letal para Salmonella entre el momento de la extracción y el consumo. Alimentos
categoría III: Los alimentos que normalmente se someten a un proceso letal para
Salmonella entre el momento de la toma de muestras y el consumo. 2. Mesófilos
aerobios, coliformes totales, coliformes fecales, Escherichia coli (incluyendo
cepas enteropatógenas), Staphylococcus spp., Vibrio spp, Shigella spp.,
Campylobacter spp, Yersinia spp, Bacillus cereus y Clostridium perfringens. a)
Toma de muestras, de cualquier lote de alimentos, recoger diez submuestras de 8
onzas (o los paquetes de menudeo) al azar. No romper o cortar grandes paquetes
de menudeo para obtener una submuestra de 8-oz. Recoger la unidad intacta de
menudeo como la sub-muestra, incluso si es mayor de 8 oz. b) Análisis de las
muestras. Analizar las muestras como se indica en los programas actuales.
Expresión de
No especifica.
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
Concordancia
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
BS 5763: Part 0: 1986
Esta norma internacional provee las instrucciones generales para llevar a a cabo
Objetivo y exámenes microbiológicos de acuerdo a estándares específicos. Además ayuda a
campo de asegurar la validez de los exámenes llevados a cabo, a que las técnicas generales
aplicación: usadas sean las mismas en todos los laboratorios y que contribuyan a la
protección de la salud del personal involucrado.
Buenas prácticas de laboratorio. Sugerencias para el correcto procesamiento y
Fundamento:
manipulación de la muestra. Buen uso del material y equipo de laboratorio.
1. Muestreo. Llevar a acabo el muestreo de acuerdo a las apropiadas normas
internacionales específicas. Mantener el producto a muestrear bajo condiciones
que eviten cualquier cambio en el número de microorganismos presentes. 2.
Procedimiento:
Porción a examinar, suspensión y dilución inicial. Cuidar la contaminación
cruzada y ambiental en la toma de las muestras. Para las diluciones seguir ISO
6887.
Reactivos y
medios de Etanol 70 % (v/v).
cultivo:
Materiales, Baños de agua, balanza de 2 000 g de capacidad, sensibilidad de 0.1 g, vasos
aparatos e estériles, pipetas graduadas, botellas, cuchillos, tenedores, espátulas, pinzas,
instrumentos: tijeras, cucharas, abate lengua, cinta adhesiva, horno, autoclave, recipientes
55
limpios, secos, a prueba de fugas, de boca ancha, estériles y de un tamaño

adecuado para las muestras del producto, contenedores, tales como frascos de
plástico o latas de metal, pueden ser cerrados herméticamente, cajas estériles de
metal, latas, bolsas o paquetes con cierres adecuados, bolsas de plástico estériles
(para materiales secos, sin congelar solamente) o botellas de plástico, cinta
adhesiva.
Etiquetar las muestras, contenedores, bolsas plásticas, botellas, tubos, cajas de
Petri, etc. para su fácil identificación. Manipular las muestras bajo las siguientes
Preparación de
recomendacions: a) Productos empacados, limpiar el exterior del empaque en el
la muestra:
lugar donde será abierto con etanol 70 % (v/v). Flamear de ser posible. b)
Cualquier instrumento usado para abrir el empaque deberá estar estéril.
Expresión de
No especifica.
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
Concordancia
Esta norma es técnicamente equivalente a la norma ISO 7218-1985. También
con normas
hace referencia a la norma internacional ISO 6887.
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
56
3.3 PREPARACIÓN DE DILUCIONES USANDO MEDIOS GRAVIMÉTRICOS
NOM-110-SSA1-1994
Objetivo y
Procedimiento para la preparación de diluciones para el análisis microbiológico
campo de
de productos alimenticios.
aplicación:
Se basa en la preparación de diluciones primarias, para obtener una distribución
Fundamento: lo más uniforme posible de los microorganismos presentes en la porción de la
muestra.
Preparación de las diluciones decimales adicionales. El criterio para seleccionar
las diluciones a preparar de acuerdo con el número de microorganismos esperado
es: Para la técnica del número más probable utilizar tres tubos: donde sea posible
demostrar el microorganismo en 10 ml de la dilución más alta. Para la técnica de
cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 colonias a
Procedimiento: 250 colonias, en un mínimo de una de tres diluciones en el método de cuenta de
bacterias aerobias en placa. En el caso de otros grupos microbianos, considerar el
número especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana correspondiente.
Las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del
análisis y éstas deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los
20 minutos posteriores a su preparación.
Reactivos y
Disolución de hidróxido de sodio 1.0 N, soluciones diluyentes (Disolución
medios de
reguladora de fosfatos, agua peptonada).
cultivo:
Materiales,
aparatos e Licuadora, tubos, pipetas, varillas de vidrio, frascos.
instrumentos:
Preparación de la dilución primaria (A partir de muestras líquidas: Agitar la
muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9
ml del diluyente, el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta,
Preparación de
evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. A partir de muestras sólidas o
la muestra:
semisólidas: Pesar una cantidad de 10 g u 11 g de la muestra, adicionar un
volumen de 90 ml a 99 ml del diluyente, licuar y homogenizar, permitir que las
partículas grandes se sedimenten y transferir la cantidad deseada tomando de las
capas superiores de la suspensión).
Expresión de
No especifica.
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
Concordancia
con normas Esta norma es técnicamente equivalente a la norma ISO 6887-1983.
internacionales:
Cepas de
No especifica.
referencia :
57
-EN ISO 6887-1:2000
Objetivo y Define las reglas generales para la preparación en condiciones aeróbicas de la

campo de suspensión inicial y de las diluciones decimales para los análisis microbiológicos
aplicación: de los productos destinados al consumo humano o a la alimentación animal.
Preparación de la suspensión inicial de manera que se obtenga una distribución,
tan homogénea como sea posible, de los microorganismos presentes en la
fracción de ensayo. Preparación de diluciones decimales destinadas a reducir el
Fundamento:
número de microorganismos por unidad de volumen que permita, tras la
incubación, la observación de su crecimiento o la falta de él o el recuento de
colonias, según se establece en cada norma específica.
Dilución base (pesar en un recipiente estéril o en una bolsa de plástico estéril una
masa o medir un volumen que sean representativos de la muestra de ensayo.
Añadir una cantidad de disolvente igual, esta cantidad se determinará
preferiblemente en relación a la masa con una precisión del ± 5 %, o en relación
al volumen, con una precisión del ± 5 %. Homogeneizar la mezcla de acuerdo
con las recomendaciones de la norma ISO 7218. Dejar sedimentar las partículas
grandes, durante un tiempo de hasta 15 min. Diluciones decimales sucesivas
Procedimiento:
(introducir, utilizando una pipeta de 1 ml de la suspensión inicial en un tubo que
contenga 9 ml de disolvente estéril a la temperatura adecuada, mezclar, si es
necesario repetir estas operaciones utilizando la dilución de 10-2 y las diluciones
sucesivas utilizando una pipeta estéril nueva en cada paso de dilución). Duración
del proceso (el tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la
suspensión inicial y el instante en el que el inóculo entra en contacto con el
medio de cultivo no deberá ser superior a los 45 min).
Reactivos y
medios de Disolventes (disolución salina de peptona, disolución tamponada de peptona).
cultivo:
Materiales,
Autoclave, horno, agitador magnético, pHmetro, tubos, pipetas, varillas de vidrio,
aparatos e
frascos.
instrumentos:
Consúltese la norma específica correspondiente al producto en estudio. Si no
Preparación de
existe una norma específica, se recomienda que las partes interesadas adopten un
la muestra:
acuerdo sobre este punto.
Expresión de
No especifica.
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
Concordancia Esta norma es la versión oficial, en español, de la norma europea EN ISO 6887-1
con normas de febrero 1999, que a su vez adopta íntegramente la norma internacional ISO
internacionales: 6887-1:1999.
Cepas de
No especifica.
referencia :
58
UNE-EN ISO 6887-2:2004
Especifica las reglas para la preparación de muestras de carne y productos

cárnicos y sus suspensiones para su examen microbiológico, cuando estas
muestras necesiten una preparación diferente a la del método descrito en la
norma ISO 6887-1. La norma ISO 6887-1 define las reglas generales para la
Objetivo y preparación de la suspensión inicial y las diluciones decimales para el examen
campo de microbiológico. Esta parte de la norma ISO 6887 es aplicable a las siguientes
aplicación: carnes frescas, crudas y elaboradas y a las carnes de ave y sus productos:
refrigerados o congelados; curados o fermentados; picados o triturados;
productos de charcutería; comidas precocinadas o comidas a base de ave; carnes
deshidratadas y ahumadas con diversos grados de deshidratación; extractos de
carne concentrados.
Se prepara una suspensión inicial para obtener una distribución tan uniforme
como sea posible de los microorganismos contenidos en la muestra para análisis.
Se prepara de la misma forma una suspensión de pre-enriquecimiento o de
enriquecimiento, empleando el medio recomendado por el método de análisis
Fundamento: concerniente. Se preparan diluciones decimales, si fuera necesario, para reducir el
número de microorganismos por unidad de volumen y permitir, después de la
incubación, la observación de cualquier crecimiento (en el caso de medios
líquidos) o colonias (en el caso de placas de agar), como se establece en cada
norma específica.
Tipos de muestras a enviar al laboratorio: La carne y los productos cárnicos son
de los siguientes tipos: unidades de carne o productos cárnicos, preparados o
elaborados y de dimensiones diversas; cortes de carne tomados de unidades con
una masa inferior a 2 kg; cortes de muestras de carne tomados de canales o cortes
de carne con una masa superior a 2 kg. El estado físico de las muestras recibidas
pueden variar según los siguientes factores: la temperatura (refrigerados,
congelados o ultracongelados), actividad de agua (aw) (no tratados, productos
cárnicos parcialmente deshidratados cuya reducción en el contenido de agua
Procedimiento:
inhibe la multiplicación microbiana). Alimentos con alto contenido en materia
grasa (más del 20 % de materia grasa de la masa total), el empleo de un diluyente
con un contenido entre 1 g/L y 10 g/L de monooleato de sorbitol añadido (Tween
80) puede mejorar la emulsificación durante la suspensión. Propósito del análisis:
el análisis microbiológico puede tener por objeto la detección o el recuento de la
flora microbiana profunda, la flora microbiana superficial, la flora microbiana
superficial y profunda (total). La preparación de la muestra para análisis debe
tener en cuenta la finalidad del análisis y la naturaleza de la muestra.
Reactivos y Diluyentes para uso general (Disolución salina de peptona, agua de peptona
medios de tamponada). Diluyentes para casos especiales (Disolución salina de peptona con
cultivo: púrpura de bromocresol).
Bandeja estéril, tijeras estériles, picadora mecánica de carne, equipo de
Materiales, cauterización de superficie de carnes, plantilla para muestreo de superficie,
aparatos e equipo para recoger una muestra congelada por el laboratorio (Taladro eléctrico
instrumentos: de velocidad variable, broca para madera estéril para taladro eléctrico, martillo o
mazo de plástico).
Productos congelados (Los productos que se almacenan congelados se deberían
Preparación de llevar a una consistencia que permita el muestreo; es decir almacenándolos entre
la muestra: 18 °C y 27 °C durante 3 h como máximo, ó 2 °C ± 2 °C durante 24 h como
máximo. Las muestras deberían ser analizadas lo más rápidamente posible tras
59
esto. Si el producto está aún congelado en el momento de su corte, se puede

utilizar diluyente a temperatura del laboratorio para facilitar la descongelación.
Productos duros y desecados (no hay que homogeneizar en un homogeneizador
rotatorio durante más de 2.5 min seguidos). Para los productos secos y duros o
heterogéneos, puede ser necesario picar o moler la muestra de laboratorio no más
de 1 min. Productos líquidos y no viscosos (la muestra para análisis debería
tomarse después de haber agitado con la mano o por medios mecánicos para
asegurarse que los microorganismos están distribuidos uniformemente).
Productos heterogéneos (el muestreo se debería realizar tomando alícuotas de
cada componente representativo de sus proporciones en el producto inicial).
También es posible homogeneizar toda la muestra para el laboratorio para
permitir el muestreo de una muestra para análisis homogeneizada.
Expresión de
No especifica.
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
con normas de julio de 2003 que a su vez adopta íntegramente la norma internacional ISO
Cepas de
No especifica.
referencia :
UNE-EN ISO 6887-3:2004
Esta parte de la norma ISO 6887 especifica las reglas para la preparación de
muestras de pescados y productos de la pesca y sus suspensiones para su examen
microbiológico, cuando estas muestras necesiten una preparación diferente a la
del método descrito en la norma ISO 6887-1. La norma ISO 6887-1 define las
Objetivo y reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y las diluciones
campo de decimales para el examen microbiológico. Esta parte de la norma ISO 6887
aplicación: describe únicamente los métodos de preparación que son aplicables a varios
microorganismos simultáneamente. Excluye las preparaciones que sólo se aplican
a la detección o recuento de un único microorganismo para las cuales los
métodos de preparación estén descritos en la correspondiente norma internacional
concerniente a ese microorganismo.
concerniente. Se preparan diluciones decimales para reducir el número de
microorganismos por unidad de volumen y permitir, después de la incubación, la
Fundamento:
observación de cualquier crecimiento (en el caso de medios líquidos) o colonias
(en el caso de placas de agar). Para restringir el ámbito del recuento a un
intervalo dado, o si se prevén un alto número de microorganismos, es posible
sembrar sólo las disoluciones decimales necesarias (al menos dos diluciones
consecutivas) para poder efectuar el recuento según los cálculos descritos en la
norma ISO 7218.
60
Todas las preparaciones y manipulaciones deberían realizarse según las técnicas

asépticas apropiadas y con un equipamiento estéril para prevenir la
contaminación microbiana de las muestras por fuentes externas. Productos
ácidos: cuando se realice una suspensión de productos ácidos, es importante
asegurarse que el pH se lleve a la neutralidad. El empleo de diluyente con un
indicador de pH añadido puede evitar la necesidad de emplear y esterilizar
sondas de pH; se añade hidróxido sódico (NaOH) para revirar la coloración de la
suspensión hasta que el indicador empieza a cambiar. En el caso del empleo de
Procedimiento: diluyentes tamponados, la adición de NaOH es a menudo necesaria para
incrementar la capacidad tamponadora del componente alcalino. La
concentración del NaOH añadido depende de la acidez del producto. La
concentración más adaptada es aquella que está todavía próxima a la proporción
de 1 en 9 de diluyente. Alimentos con alto contenido en materia grasa (por
ejemplo por encima del 20 % de materia grasa de la masa total). El empleo de un
diluyente con un contenido entre 1 g/L y 10 g/L de monooleato de sorbitol
(Tween 80) añadido, correspondiente aproximadamente a niveles de materias
grasas puede mejorar la emulsificación durante la suspensión.
Reactivos y Diluyentes para uso general (disolución salina de peptona, agua de peptona
medios de tamponada). Diluyentes para casos especiales (disolución salina de peptona con
Materiales,
Homogenizador, tijeras estériles, cuchillos, tenedores para marisco, bisturís y
aparatos e
cuchillos de carnicero grandes estériles, cepillo duro, taladro eléctrico, pinzas.
instrumentos:
Productos congelados (los productos que se almacenan congelados) se deberían
llevar a una consistencia que permita el muestreo; es decir almacenándolos entre
(18 y 27) °C durante 3 h como máximo, ó (2 ± 2) °C durante 24 h como máximo.
Las muestras deberían ser analizadas lo más rápidamente posible tras esto. Si el
producto está aún congelado en el momento de su corte, se puede utilizar
diluyente a temperatura del laboratorio para facilitar la descongelación.
Preparación de rotatorio durante más de 2.5 min seguidos). Para los productos secos y duros o
la muestra: heterogéneos, puede ser necesario picar o moler la muestra del laboratorio no
más de 1 min). Productos líquidos y no viscosos (la muestra para análisis debería
asegurarse que los microorganismos están distribuidos uniformemente).
Productos heterogéneos (el muestreo se debería realizar tomando alícuotas de
cada componente representativo de sus proporciones en el producto inicial).
También es posible homogeneizar toda la muestra para el laboratorio para
permitir el muestreo de una muestra para análisis homogeneizada.
Expresión de
No especifica.
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
con normas de agosto de 2003, que a su vez adopta íntegramente la norma internacional ISO
Cepas de No especifica.
61
referencia :
UNE-EN ISO 6887-4:2004
Esta parte de la Norma ISO 6887 especifica las reglas para la preparación de
muestras y diluciones decimales para el examen microbiológico de productos
alimentarios que no son cubiertos por las otras partes de la Norma ISO 6887. La
norma ISO 6887-1 define las reglas generales para la preparación de la
Objetivo y
suspensión inicial y las diluciones decimales para el examen microbiológico. Esta
campo de
parte de la norma ISO 6887 describe únicamente los métodos de preparación que
aplicación:
son aplicables a varios microorganismos simultáneamente. Excluye las
preparaciones que sólo aplican a la detección o recuento de un único
microorganismo para el cual los métodos de preparación estén descritos en la
correspondiente norma internacional concerniente a ese microorganismo.
concerniente. Se preparan diluciones decimales si fuera necesario para reducir el
número de microorganismos por unidad de volumen y permitir, después de la
Fundamento: incubación, la observación de cualquier crecimiento (en el caso de medios
líquidos) o colonias (en el caso de placas de agar), como se establece en cada
norma específica.
Para restringir el ámbito del recuento a un intervalo dado, o si se prevén un alto
número de microorganismos, es posible sembrar sólo las disoluciones decimales
necesarias (al menos dos diluciones consecutivas) para poder efectuar el recuento
según los cálculos descritos en la norma ISO 7218.
Todas las preparaciones y manipulaciones deberían realizarse según las técnicas
asépticas apropiadas y con un equipamiento estéril para prevenir la
contaminación microbiana de las muestras por fuentes externas. Productos
ácidos: cuando se realice una suspensión de productos ácidos, es importante
asegurar que el pH se lleve a la neutralidad. El empleo de diluyente con un
indicador de pH añadido puede evitar la necesidad de emplear y esterilizar
sondas de pH; se añade hidróxido sódico (NaOH) para revirar la coloración de la
suspensión hasta que el indicador empieza a cambiar. En el caso del empleo de
Procedimiento: diluyentes tamponados, la adición de NaOH es a menudo necesaria para
incrementar la capacidad tamponadora del componente alcalino. La
concentración del NaOH añadido depende de la acidez del producto. La
concentración más adaptada es aquella que está todavía próxima a la proporción
de 1 en 9 de diluyente. Alimentos con alto contenido en materia grasa (por
ejemplo por encima del 20 % de materia grasa de la masa total).
El empleo de un diluyente con un contenido entre 1 g/L y 10 g/L de monooleato
de sorbitol (Tween 80) añadido, correspondiente aproximadamente a niveles de
materias grasas puede mejorar la emulsificación durante la suspensión.
Reactivos y Diluyentes para uso general (disolución salina de peptona, agua de peptona
medios de tamponada). Diluyentes para casos especiales (disolución salina de peptona con
62
Materiales,
Homogenizador, tijeras estériles, cuchillos, tenedores para marisco, bisturís y
aparatos e
cuchillos de carnicero grandes estériles, espátulas, martillo, pinzas.
instrumentos:
Productos congelados (Los productos que se almacenan congelados se deberían
llevar a una consistencia que permita el muestreo; es decir almacenándolos entre
(18 y 27) °C durante 3 h como máximo, ó (2 ± 2) °C durante 24 h como máximo.
Las muestras deberían ser analizadas lo más rápidamente posible tras esto. Si el
producto está aún congelado en el momento de su corte, se puede utilizar
diluyente a temperatura del laboratorio para facilitar la descongelación.
Preparación de rotatorio durante más de 2.5 min seguidos. Para los productos secos y duros o
la muestra: heterogéneos, puede ser necesario picar o moler la muestra de laboratorio no más
de 1 min). Productos líquidos y no viscosos (la muestra para análisis debería
asegurarse que los microorganismos están distribuidos uniformemente. Productos
heterogéneos (el muestreo se debería realizar tomando alícuotas de cada
componente representativo de sus proporciones en el producto inicial). También
es posible homogeneizar toda la muestra para el laboratorio, para permitir el
muestreo de una muestra para análisis homogeneizada.
Expresión de
No especifica.
resultados:
Informe de la
No especifica.
prueba:
con normas de agosto de 2003, que a su vez adopta íntegramente la norma internacional ISO
Cepas de
No especifica.
referencia :
3.4 CÁLCULO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
NOM-112-SSA1-1994
Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del periodo de
incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.
La tabla 3 muestra algunos ejemplos que se pueden presentar.
Ejemplos: Ejemplo 1. Cuando sólo una dilución muestra tres tubos positivos, elegir ésta y las
diluciones mayores posteriores.
Ejemplo 2. Cuando más de una dilución muestra tres tubos positivos y la última da menos de tres,
elegir esta última y las dos diluciones anteriores más bajas.
Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y éstos se encuentran en más de
tres diluciones, seleccionar las dos diluciones mayores positivas y la siguiente.
63
Ejemplos 4 y 5. Cuando los tubos positivos sólo se encuentran en la muestra sin diluir (10 ml o 1 g)
y en la primera dilución (1 ml o 10-1 g), seleccionar las tres primeras diluciones para el cálculo del
número más probable.
En cada caso se obtiene un número de tres cifras, lo cual es representado en las tablas 4 a la 7,
según corresponda. En la columna que indica el número de tubos positivos se busca el índice del
NMP.
La técnica de NMP puede admitir gran cantidad de variaciones. Los resultados obtenidos con esta
técnica deben ser utilizados con precaución. Los límites de confianza están representados en las
tablas 3 a la 7. Por ejemplo, para una muestra sólida con un NMP de 70 coliformes por gramo, los
límites de confianza en el 95 % de los casos variarán de 10 a 230 coliformes por gramo (ejemplo 3
de la tabla 3) y en un producto con 24 de NMP de coliformes por gramo, los límites de confianza
son de 3.6 a 130 coliformes por gramo (ejemplo 2 tabla 3).
Tabla 3. Ejemplos de la selección de resultados positivos para el cálculo del NMP.
Número de tubos positivos obtenidos de tres NMPb tubos incubados, para las siguientes cantidades
de muestra inoculada por tuboa
mayor dilución = menor concentración
Producto
líquido 10 1 10-1 10-2 10-3
Producto Otros
(ml)
líquido productos
Otros
ml-1 g-1
productos 1 10-1 10-2 10-3 10-4
(g)
1 3 3 2 1 0 15 (5)* 150 (6)*
2 3 3 3 0 24 (5)* 240 (6)*
3 2 2 1 1 0 7 (6)* 70 (7)*
4 3 3 0 0 0 2.4 (4)* 24 (5)*
5 2 2 0 1 0 0.21 (4)* 2.1 (5)*
Tabla 4. Índice del NMP y límites de confianza al 95 % para varias combinaciones de

resultados positivos cuando son usados varios números de tubos. (Diluciones 10, 1.0 y 0.1 g)a.
3 tubos por dilución 5 tubos por dilución
Límites de confianza al Límites de confianza al

95 % 95 %
Combinación Índice del Bajo Alto Índice del Bajo Alto

de positivos NMP por NMP por
64
g g
0-0-0 <0.03 <0.005 <0.09 <0.02 <0.005 <0.07
0-0-1 0.03 <0.005 <0.09 0.02 <0.005 0.07
0-1-0 0.03 <0.005 0.13 0.02 <0.005 0.07
0-2-0 -- -- -- 0.04 <0.005 0.11
1-0-0 0.04 <0.005 0.20 0.02 <0.005 0.07
1-0-1 0.07 0.01 0.21 0.04 <0.005 0.11
1-1-0 0.07 0.01 0.23 0.04 <0.005 0.11
1-1-1 0.11 0.03 0.36 0.06 <0.005 0.15
1-2-0 0.11 0.03 0.36 0.06 <0.005 0.15
2-0-0 0.09 0.01 0.36 0.05 <0.005 0.13
2-0-1 0.14 0.03 0.37 0.07 0.01 0.17
2-1-0 0.15 0.03 0.44 0.07 0.01 0.17
2-1-1 0.20 0.07 0.89 0.09 0.02 0.21
2-2-0 0.21 0.04 0.,47 0.09 0.02 0.21
2-2-1 0.28 0.10 1.50 -- -- --
2-3-0 -- -- -- 0.12 0.03 0.28
3-0-0 0.23 0.04 1.20 0.08 0.01 0.19
3-0-1 0.39 0.07 1.3 0.11 0.02 0.25
3-0-2 0.64 0.15 3.80 -- -- --
3-1-0 0.43 0.07 2.1 0.11 0.02 0.25
3-1-1 0.75 0.14 2.3 0.14 0.04 0.34
3-1-2 1.,20 0.30 3.8 -- -- --
3-2-0 0.93 0.15 3.80 0.14 0.04 0.34
3-2-1 1.,50 0.30 4.40 0.17 0.05 0.46
3-2-2 2.10 0.35 4.70 -- -- --
3-3-0 2.40 0.36 13.0 -- -- --
3-3-1 4.60 0.71 24.0 -- -- --
65
3-3-2 11.0 1.50 48.0 -- -- --
3-3-3 >11.0 >1.50 >48.0 -- -- --
4-0-0 -- -- -- 0.13 0.03 0.31
4-0-1 -- -- -- 0.17 0.05 0.46
4-1-0 -- -- -- 0.17 0.05 0.46
4-1-1 -- -- -- 0.21 0.07 0.63
4-1-2 -- -- -- 0.26 0.09 0.78
4-2-0 -- -- -- 0.22 0.07 0.67
4-2-1 -- -- -- 0.26 0.09 0.78
4-3-0 -- -- -- 0.27 0.09 0.80
4-3-1 -- -- -- 0.33 0.11 0.93
4-4-0 -- -- -- 0.34 0.12 0.93
5-0-0 -- -- -- 0.23 0.07 0.70
5-0-1 -- -- -- 0.31 0.11 0.89
5-0-2 -- -- -- 0.43 0.15 1.14
5-1-0 -- -- -- 0.33 0.11 0.93
5-1-1 -- -- -- 0.46 0.16 1.2
5-1-2 -- -- -- 0.63 0.21 1.5
5-2-0 -- -- -- 0.49 0.,17 1.3
5-2-1 -- -- -- 0.70 0.23 1.70
5-2-2 -- -- -- 0.94 0.28 2.2
5-3-0 -- -- -- 0.79 0.25 1.9
5-3-1 -- -- -- 1.10 0.31 2.5
5-3-2 -- -- -- 1.4 0.37 3.4
5-3-3 -- -- -- 1.80 0.44 5.0
5-4-0 -- -- -- 1.30 0.35 3.0
5-4-1 -- -- -- 1.70 0.43 4.9
5-4-2 -- -- -- 2.20 0.57 7.0
66
5-4-3 -- -- -- 2.80 0.90 8.5
5-4-4 -- -- -- 3.50 1.20 10.,0
5-5-0 -- -- -- 2.40 0.68 7.5
5-5-1 -- -- -- 3.50 1.60 10.0
5-5-2 -- -- -- 5.40 1.80 14.0
5-5-3 -- -- -- 9.20 3.0 32.0
5-5-4 -- -- -- 16.09 6.40 58.0
5-5-5 -- -- -- -- -- --

resultados positivos cuando son usados varios números de tubos. (Diluciones 1.0, 0.1 y 0.01 g)a.

95 % 95 %

g g
0-0-0 <0.3 <0.05 <0.9 <0.2 <0.05 <0.7
0-0-1 0.3 <0.05 <0.9 0.2 <0.05 0.7
0-1-0 0.3 <0.05 1.3 0.2 <0.05 0.7
0-2-0 -- -- -- 0.4 <0.05 0.11
1-0-0 0.4 <0.05 2.0 0.2 <0.05 0.7
1-0-1 0.7 0.1 2.0 0.4 <0.05 1.1
1-1-0 0.7 0.1 2.3 0.4 <0.05 1.1
1-1-1 1.1 0.3 3.6 0.6 <0.05 1.5
1-2-0 1.1 0.3 3.6 0.6 <0.05 1.5
2-0-0 0.9 0.1 3.6 0.5 <0.05 1.3
2-0-1 1.4 0.3 3.7 0.7 0.1 1.7
2-1-0 1.5 0.3 4.4 0.7 0.1 1.7
67
2-1-1 2.0 0.7 8.9 0.9 0.2 2.1
2-2-0 2.1 0.4 4.7 0.9 0.2 2.1
2-2-1 2.8 1.0 15.0 -- -- --
2-3-0 -- -- -- 1.2 0.3 2.8
3-0-0 2.3 0.4 12.0 0.8 0.1 1.9
3-0-1 3.9 0.7 13.0 1.1 0.2 2.5
3-0-2 6.4 1.5 38.0 -- -- --
3-1-0 4.3 0.7 21.0 1.1 0.2 2.5
3-1-1 7.5 1.4 23.0 1.4 0.4 3.4
3-1-2 12.0 3.0 38.0 -- -- --
3-2-0 9.3 1.5 38.0 1.4 0.4 3.4
3-2-1 15.0 3.0 44.0 1.7 0.5 4.6
3-2-2 21.0 3.5 47.0 -- -- --
3-3-0 24.0 3.6 130.0 -- -- --
3-3-1 46.0 7.1 240.0 -- -- --
3-3-2 110.0 15.0 480.0 -- -- --
3-3-3 >110.0 >15.0 >480.0 -- -- --
4-0-0 -- -- -- 1.3 0.3 3.1
4-0-1 -- -- -- 1.7 0.5 4.6
4-1-0 -- -- -- 1.7 0.5 4.6
4-1-1 -- -- -- 2.1 0.7 6.3
4-1-2 -- -- -- 2.6 0.9 7.8
4-2-0 -- -- -- 2.2 0.7 6.7
4-2-1 -- -- -- 2.6 0.9 7.8
4-3-0 -- -- -- 2.7 0.9 8.0
4-3-1 -- -- -- 3.3 1.1 9.,3
4-4-0 -- -- -- 3.4 1.2 9.3
5-0-0 -- -- -- 2.3 0.7 7.0
68
5-0-1 -- -- -- 3.1 1.1 8.9
5-0-2 -- -- -- 4.3 1.5 11.4
5-1-0 -- -- -- 3.3 1.1 9.3
5-1-1 -- -- -- 4.6 1.6 12.,0
5-1-2 -- -- -- 6.3 2.1 15.0
5-2-0 -- -- -- 4.9 1.7 13.0
5-2-1 -- -- -- 7.0 2.,3 17.0
5-2-2 -- -- -- 9.4 2.8 22.0
5-3-0 -- -- -- 7.9 2.5 19.0
5-3-1 -- -- -- 11.0 3.1 25.0
5-3-2 -- -- -- 14.0 3.7 34.0
5-3-3 -- -- -- 18.0 4.4 50.0
5-4-0 -- -- -- 13.0 3.5 30.0
5-4-1 -- -- -- 17.0 4.3 49.0
5-4-2 -- -- -- 22.0 5.7 70.0
5-4-3 -- -- -- 28.0 9.0 85.0
5-4-4 -- -- -- 35.0 12.0 100.0
5-5-0 -- -- -- 24.0 6.8 75.0
5-5-1 -- -- -- 35.0 12.0 100.0
5-5-2 -- -- -- 54.0 18.0 140.0
5-5-3 -- -- -- 92.0 30.0 320.0
5-5-4 -- -- -- 161.0 64.0 580.0
5-5-5 -- -- -- >161.0 >64.0 >580,0

resultados positivos cuando son usados varios números de tubos. (Diluciones 0.1, 0.01 y 0.001
g)a.
69

95 % 95 %

g g
0-0-0 <3 <0.5 <9 <2 <0.5 <7
0-0-1 3 <0.5 9 2 <0.5 7
0-1-0 3 <0.5 13 2 <0.5 7
0-2-0 -- -- -- 4 <0.5 11
1-0-0 4 <0.5 20 2 <0.5 7
1-0-1 7 1 21 4 <0.5 11
1-1-0 7 1 23 4 <0.5 11
1-1-1 11 3 36 6 <0.5 15
1-2-0 11 3 36 6 <0.5 15
2-0-0 9 1 36 5 <0.5 13
2-0-1 14 3 37 7 1.0 17
2-1-0 15 3 44 7 1.0 17
2-1-1 20 7 89 9 2.0 21
2-2-0 21 4 47 9 2.0 21
2-2-1 28 10 150 -- -- --
2-3-0 -- -- -- 12 3.0 28
3-0-0 23 4 120 8 1.0 19
3-0-1 39 7 13 11 2.0 25
3-0-2 64 15 380 -- -- --
3-1-0 43 7 210 11 2.0 25
3-1-1 75 14 230 14 4.0 34
3-1-2 120 30 380 -- -- --
3-2-0 93 15 380 14 4.0 34
3-2-1 150 30 440 17 5.0 46
70
3-2-2 210 35 470 -- -- --
3-3-0 240 36 130 -- -- --
3-3-1 460 71 240 -- -- --
3-3-2 1100 150 480 -- -- --
3-3-3 >1100 >150 >480 -- -- --
4-0-0 -- -- -- 13 3.0 31
4-0-1 -- -- -- 17 5.0 46
4-1-0 -- -- -- 17 5.0 46
4-1-1 -- -- -- 21 7.0 63
4-1-2 -- -- -- 26 9.0 78
4-2-0 -- -- -- 22 7.0 67
4-2-1 -- -- -- 26 9.0 78
4-3-0 -- -- -- 27 9.0 80
4-3-1 -- -- -- 33 11.0 93
4-4-0 -- -- -- 34 12.0 93
5-0-0 -- -- -- 23 7.0 70
5-0-1 -- -- -- 31 11.0 89
5-0-2 -- -- -- 43 15.0 114
5-1-0 -- -- -- 33 11.0 93
5-1-1 -- -- -- 46 16.0 120
5-1-2 -- -- -- 63 21.0 150
5-2-0 -- -- -- 49 17.0 130
5-2-1 -- -- -- 70 23.0 170
5-2-2 -- -- -- 94 28.0 220
5-3-0 -- -- -- 79 25.0 190
5-3-1 -- -- -- 110 31.0 250
5-3-2 -- -- -- 140 37.0 340
5-3-3 -- -- -- 180 44.0 500
71
5-4-0 -- -- -- 130 35.0 300
5-4-1 -- -- -- 170 43.0 490
5-4-2 -- -- -- 220 57.0 700
5-4-3 -- -- -- 280 90.0 850
5-4-4 -- -- -- 350 120.0 1000
5-5-0 -- -- -- 240 68.0 750
5-5-1 -- -- -- 350 120.0 1000
5-5-2 -- -- -- 540 180.0 1400
5-5-3 -- -- -- 920 300.0 3200
5-5-4 -- -- -- 1600 640.0 5800
5-5-5 -- -- -- >1600 >640.0 >5800

resultados positivos cuando son usados varios números de tubos. (Diluciones 0.01, 0.001 y
0.0001 g)a.

95 % 95 %

de positivos NMP por NMP por g
g
0-0-0 <30 <5 <90 <20 <5 <70
0-0-1 30 <5 <90 20 <5 70
0-1-0 30 <5 130 20 <5 70
0-2-0 -- -- -- 40 <5 110
1-0-0 40 <5 200 20 <5 70
1-0-1 70 10 210 40 <5 110
1-1-0 70 10 230 40 <5 110
1-1-1 110 30 360 60 <5 150
1-2-0 110 30 360 60 <5 150
72
2-0-0 90 10 360 50 <5 130
2-0-1 140 30 370 70 10 170
2-1-0 150 30 440 70 10 170
2-1-1 200 70 890 90 20 210
2-2-0 210 40 470 90 20 210
2-2-1 280 100 1 500 -- -- --
2-3-0 -- -- -- 120 30 280
3-0-0 230 40 1 200 80 10 190
3-0-1 390 70 1 300 110 20 250
3-0-2 640 150 3 800 -- -- --
3-1-0 430 70 2 100 110 20 250
3-1-1 750 140 2 300 140 40 340
3-1-2 1 200 300 3 800 -- -- --
3-2-0 930 150 3 800 140 40 340
3-2-1 1 500 300 4 400 170 50 460
3-2-2 2 100 350 4 700 -- -- --
3-3-0 2 400 360 13 000 -- -- --
3-3-1 4 600 710 24 000 -- -- --
3-3-2 11 000 1 500 48 000 -- -- --
3-3-3 >11 000 >1 500 >48 000 -- -- --
4-0-0 -- -- -- 130 30 310
4-0-1 -- -- -- 170 50 460
4-1-0 -- -- -- 170 50 460
4-1-1 -- -- -- 210 70 630
4-1-2 -- -- -- 260 90 780
4-2-0 -- -- -- 220 70 670
4-2-1 -- -- -- 260 90 780
4-3-0 -- -- -- 270 90 800
73
4-3-1 -- -- -- 330 110 930
4-4-0 -- -- -- 340 120 930
5-0-0 -- -- -- 230 70 700
5-0-1 -- -- -- 310 110 890
5-0-2 -- -- -- 430 150 1 140
5-1-0 -- -- -- 330 110 930
5-1-1 -- -- -- 460 160 1 200
5-1-2 -- -- -- 630 210 1 500
5-2-0 -- -- -- 490 170 1 300
5-2-1 -- -- -- 700 230 1 700
5-2-2 -- -- -- 940 280 2 200
5-3-0 -- -- -- 790 250 1 900
5-3-1 -- -- -- 1 100 310 2 500
5-3-2 -- -- -- 1 400 370 3 400
5-3-3 -- -- -- 1 800 440 5 000
5-4-0 -- -- -- 1 300 350 3 000
5-4-1 -- -- -- 1 700 430 4 900
5-4-2 -- -- -- 2 200 570 7 000
5-4-3 -- -- -- 2 800 900 8 500
5-4-4 -- -- -- 3 500 1 200 10 000
5-5-0 -- -- -- 2 400 680 7 500
5-5-1 -- -- -- 3 500 1 200 10 000
5-5-2 -- -- -- 5 400 1 800 14 000
5-5-3 -- -- -- 9 200 3 000 32 000
5-5-4 -- -- -- 16 000 6 400 58 000
5-5-5 -- -- -- >16 000 >6 400 >58 000
74
Informe de la prueba: Informar "Número más probable (NMP) de coliformes por gramo o
mililitro de muestra". En caso de muestras de agua informar NMP/100 ml.
Concordancia con normas internacionales: Esta norma no tiene concordancia con normas
internacionales.
UNE-EN ISO 7218
Determinación de los valores de NMP
Hay tres posibilidades distintas de determinar el valor de NMP: el cálculo mediante fórmulas
matemáticas, la consulta de tablas de NMP o el empleo de programas informáticos específicos.
Siempre que se basen en las mismas consideraciones estadísticas, las tres son igualmente válidas.
Estos tres métodos se detallan a continuación.
1. Fórmulas matemáticas
1.1. Fórmula aproximada para todos los casos
Los valores aproximados de NMP para cualquier número de diluciones y de tubos en paralelo se
obtienen aplicando la siguiente ecuación (adaptada de Thomas, 1942):
Donde:
Zp es el número de tubos positivos;
mr es la masa de referencia de la muestra, en gramos;
ms es la masa total de la muestra en todos los tubos que han presentado reacciones negativas, en
gramos;
mt es la masa total de muestra en todos los tubos, en gramos.
El NMP se expresa por masa de referencia de la muestra, en gramos (generalmente 1 g, en

ocasiones 100 g).
1.2 Disolución “exacta” para una serie de tubos
El valor de NMP para una serie única de tubos viene dado por la fórmula:
* +
donde:
mm es la masa de muestra en cada tubo de la serie, en gramos;
75
ln es el logaritmo natural;
n es el número de tubos de la serie;
zp es el número de tubos con reacción positiva.
1.3. Estimación de la precisión en análisis de dilución única
Los límites de confianza al 95 % de la estimación del NMP pueden calcularse de forma aproximada
mediante la ecuación:
√ ( )
[ ]
Donde:
x es el límite superior o inferior del intervalo de confianza al 95 %;
mm es la masa de la muestra en cada tubo de la serie, en gramos;
ln es el logaritmo natural;
n es el número de tubos de la serie;
zn es el número de tubos con reacción negativa.
El signo más está relacionado con el límite inferior y el signo menos con el límite superior. La
aproximación no es muy buena cuando la mayoría de los tubos son negativos (estériles) pero mejora
al aumentar el número de tubos positivos.
1.4. Estimación de la precisión en análisis de dilución múltiple simétricos
El logaritmo decimal de la incertidumbre estándar para un sistema de NMP de dilución múltiple

simétrico puede obtenerse mediante la aproximación de la ecuación de Cochran (1950):
Donde:
SE es el error estándar del log10 NMP;
f es el factor de dilución entre dos diluciones consecutivas (en la mayoría de los casos, 10);
n es el número de tubos para cada dilución;
Los límites superior e inferior del intervalo de confianza al 95 % pueden aproximarse

respectivamente multiplicando y dividiendo la estimación del NMP por el antilogaritmo de 2 x SE.
Este procedimiento tiende a exagerar el límite de confianza superior.
76
2. Tablas de NMP
2.1. Tablas para sistemas de dilución única
Las tablas de la 8 a la 11 muestran los valores de NMP y los intervalos de confianza al 95 % por
porción de análisis para series de 10, 15, 20 y 25 tubos en paralelo [cada tubo se inocula con la
misma (única) dilución].
Para expresar el resultado por masa de referencia de la muestra (o de volumen para las muestras
líquidas), se multiplican los valores de NMP y de los límites al 95 % por la relación (masa de
referencia)/(masa de la porción de análisis).
La incertidumbre estándar logarítmica no se multiplica. La masa de referencia en microbiología de

los alimentos suele ser de 1 g. La masa de la porción de análisis corresponde a la cantidad de
muestra (en gramos) presente en el volumen utilizado para inocular los tubos, es decir, 0.1 g, si se
ha utilizado 1 ml de un homogenizado de 10-1.
2.2. Tablas para sistemas de diluciones múltiples: tres diluciones consecutivas
En los sistemas simétricos, es una práctica habitual utilizar tres diluciones sucesivas con tres (Tabla
12) o cinco (Tabla 14) réplicas. Se registra el número de resultados positivos de cada serie de tubos
y se determina, a partir de la tabla de NMP correspondiente al sistema de inoculación utilizado, el
número más probable de microorganismos presentes en el volumen de referencia de la muestra.
Hay combinaciones de tubos positivos con una probabilidad de aparición mucho mayor que otras.
Por ejemplo, es mucho menos probable que aparezca una combinación de resultados positivos de 0,
0, 3 que una combinación de 3, 2, 1.
Para cuantificar esta probabilidad, se ha asignado un índice de 0 a 3 a todas las combinaciones

posibles de resultados positivos. La categoría 1 corresponde a los resultados de probabilidad más
alta, mientras que los resultados de la categoría 3 son raros y no son fáciles de reproducir. Los casos
peores son los resultados de la categoría 0; deberían considerarse con un alto grado de desconfianza.
Asumiendo que los resultados del análisis son correctos, debería esperarse que el 95 % de las
combinaciones correspondan a la categoría 1, el 4 % a la categoría 2, el 0.9 % a la categoría 3 y
solamente el 0.1 % a la categoría 0. En la tabla B.6 se explican con mayor detalle las categorías.
En el caso en que se realicen más de tres diluciones, la selección de la combinación correcta de tres
diluciones consecutivas no siempre es muy evidente. Sin embargo, se puede hacer fácilmente
registrando todas las combinaciones posibles de tubos positivos, determinando en la tabla 17 a qué
categoría corresponde.
Por consiguiente, se aplican las reglas siguientes:
1) Se selecciona la combinación de tres diluciones consecutivas con un perfil de categoría 1 para

obtener el índice de NMP. Si se obtiene más de una combinación con perfil de categoría 1, se utiliza
la que tenga un mayor número de tubos positivos.
2) Si no se encuentra ninguna combinación de categoría 1, se utiliza la que presente un perfil de

categoría 2. Si se obtiene más de una combinación con perfil de categoría 2, se utiliza la que tenga
un mayor número de tubos positivos.
77
3) Si no se encuentra ninguna combinación de categoría 2, se utiliza la que presente un perfil de

categoría 3. Si se obtiene más de una combinación con perfil de categoría 3, se utiliza la que tenga
un mayor número de tubos positivos.
3. Programas informáticos
Los programas informáticos más versátiles no plantean restricciones en el número de diluciones ni

en la simetría o en los tubos en paralelo del sistema de NMP. El NMP Assay Analyzer es un
programa de acceso libre, basado en un programa previo (Hurley y Roscoe, 1983).
4. Expresión de los resultados
Utilizando el índice de NMP determinado en la tabla 12 [según la combinación de tres (o cinco)

diluciones consecutivas escogidas], se determina la cantidad más probable de microorganismos en
el volumen de referencia.
El resultado se expresa como el número más probable de microorganismos (o de un grupo

específico de microorganismos) por gramo o por mililitro. La masa o el volumen de referencia
pueden ser diferentes del g o del ml (por ejemplo 100 g o 100 ml).
5. Determinación del número más probable (NMP)
Tabla 8. Valores de NMP por porción de análisis y límites del intervalo de confianza al 95 %
en una serie de 10 tubos, calculados conforme a Hurley y Roscoe (1983).
Número de Series de 10 tubos
tubos Límites del intervalo de confianza al

95 %
positivos
NMP Incertidumbre Inferior Superior
estándar del
log10NMP
1 0.11 0.435 0.02 0.75
2 0.22 0.308 0.06 0.89
3 0.36 0.252 0.11 1.11
4 0.51 0.220 0.19 1.38
5 0.69 0.198 0.28 1.69
6 0.92 0.184 0.40 2.10
7 1,.20 0.174 0.55 2.64
8 1.61 0.171 0.75 3.48
78
9 2.30 0.179 1.03 5.16
tubos NMP Incertidumbre Límites al 95 % de confianza

positivos estándar del
log10NMP Inferior Superior
1 0.07 0.434 0.01 0.49
2 0.14 0.307 0.04 0.57
3 0.22 0.251 0.07 0.69
4 0.31 0.218 0.12 0.83
5 0.41 0.196 0.17 0.98
6 0.51 0.179 0.23 1.15
7 0.63 0.167 0.30 1.33
8 0.76 0.157 0.37 1.55
9 0.92 0.150 0.47 1.80
10 1.10 0.144 0.57 2.11
11 1.32 0.141 0.70 2.49
12 1.61 0.139 0.86 3.02
13 2.01 0.142 1.06 3.82
14 2.71 0.155 1.35 5.45

79
1 0.05 0.434 0.01 0.36
2 0.11 0.307 0.03 0.42
3 0.16 0.251 0.05 0.50
4 0.22 0.218 0.08 0.60
5 0.29 0.195 0.12 0.69
6 0.36 0.178 0.16 0.80
7 0.43 0.165 0.20 0.91
8 0.51 0.155 0.25 1.03
9 0.59 0.147 0.31 1.16
10 0.69 0.140 0.37 1.30
11 0.80 0.134 0.44 1.46
12 0.92 0.130 0.51 1.65
13 1.05 0.126 0.59 1.85
14 1.20 0.123 0.69 2.10
15 1.39 0.121 0.80 2.40
16 1.61 0.121 0.93 2.77
17 1.90 0.122 1.09 3.29
18 2.30 0.127 1.30 4.08
19 3.00 0.141 1.58 5.67

1 0.04 0.434 0.01 0.29
80
2 0.08 0.307 0.02 0.33
3 0.13 0.251 0.04 0.40
4 0.17 0.217 0.07 0.47
5 0.22 0.195 0.09 0.54
6 0.27 0.178 0.12 0.61
7 0.33 0.165 0.16 0,69
8 0.39 0.154 0.19 0.77
9 0.45 0.146 0.23 0.86
10 0.51 0.139 0.27 0.96
11 0.58 0.133 0.32 1.06
12 0.65 0.128 0.37 1.16
13 0.73 0.123 0.42 1.28
14 0.82 0.119 0.48 1.41
15 0.92 0.116 0.54 1.55
16 1.02 0.113 0.61 1.70
17 1.14 0.111 0.69 1.88
18 1.27 0.109 0.78 2.09
19 1.43 0.108 0.88 2.33
20 1.61 0.108 0.99 2.62
21 1.83 0.109 1.12 2.99
22 2.12 0.111 1.29 3.50
23 2.53 0.117 1.49 4.28
24 3.22 0.123 1.77 5.85
Tabla 12. Índices de NMP y límites del intervalo de confianza (95 %) cuando se utilizan tres
porciones de análisis de 1 g (ml), tres de 0.1 g (ml) y tres de 0.01 g (ml).
Número de resultados Índice de Categoríasb Límites de los resultados en un

positivos intervalo de confianza (95 %)a, c
81
NMPa Límite inferior Límite

superior
0 0 0 <0.30 0.00 0.94
0 0 1 0.30 3 0.01 0.95
0 1 0 0.30 2 0.01 1
0 1 1 0.61 0 0.12 1.7
0 2 0 0.62 3 0.12 1.7
0 3 0 0.94 0 0.35 3.5
1 0 0 0.36 1 0.02 1.7
1 0 1 0.72 2 0.12 1.7
1 0 2 1.1 0 0.4 3.5
1 1 0 0.74 1 0.13 2
1 1 1 1.1 3 0.4 3.5
1 2 0 1.1 2 0.4 3.5
1 2 1 1.5 3 0.5 3.8
1 3 0 1.6 3 0.5 3.8
2 0 0 0.92 1 0.15 3.5
2 0 1 1.4 2 0.4 3.5
2 0 2 2.0 0 0.5 3.8
2 1 0 1.5 1 0.4 3.8
2 1 1 2.0 2 0.5 3.8
2 1 2 2.7 0 0.9 9.4
2 2 0 2.1 1 0.5 4
2 2 1 2.8 3 0.9 9.4
2 2 2 3.5 0 0.9 9.4
2 3 0 2.9 3 0.9 9.4
2 3 1 3.6 0 0.9 9.4
3 0 0 2.3 1 0.5 9.4
82
3 0 1 3.8 1 0.9 10.4
3 0 2 6.4 3 1.6 181
3 1 0 4.3 1 0.9 181
3 1 1 7.5 1 1.7 199
3 1 2 12 3 3 36
3 1 3 16 0 3 38
3 2 0 9.3 1 1.8 36
3 2 1 15 1 3 38
3 2 2 21 2 3 40
3 2 3 29 3 9 99
3 3 0 24 1 4 99
3 3 1 46 1 9 198
3 3 2 110 1 20 400
3 3 3 >110
a Fuente: De Man (1983).
b Véase la tabla 13.
c Los límites de confianza mostrados en esta tabla se ofrecen solamente para proporcionar una
indicación de la influencia de las variaciones estadísticas sobre los resultados. Siempre van a existir
otras fuentes de variación, que en ocasiones pueden ser incluso más importantes.
Tabla 13. Explicación sobre las categorías de los resultados.
Categoríaa Definición
1 Cuando el número de bacterias de la muestra es igual al valor de NMP hallado, este

resultado es de los que tienen la mayor probabilidad de obtenerse. Como mucho, hay
un 5 % de probabilidad de obtener un resultado que es menos probable que el de
menor probabilidad de esta categoría.

resultado es de los que tienen una probabilidad de obtenerse menor que incluso el
resultado menos probable de la categoría 1, pero hay, en el mejor de los casos,
solamente un 1 % de probabilidad de obtener un resultado que es menos probable
que el de menor probabilidad de esta categoría.

resultado menos probable de la categoría 2, pero hay, en el mejor de los casos,
83
solamente un 0.1 % de probabilidad de obtener un resultado que es menos probable

que el de menor probabilidad de esta categoría.

resultado menos probable de la categoría 3. Solamente hay un 0.1 % de probabilidad
de obtener un resultado de esta categoría, incluso sin que se haya cometido ninguna
incorrección.
a Antes de comenzar los análisis, debería decidirse qué categoría se va a aceptar, es decir,
solamente la categoría 1, la 1 y la 2 o incluso la 1, la 2 y la 3. Cuando se vaya a tomar una decisión
de gran importancia en base a los resultados, solamente debería aceptarse la categoría 1, o en todo
caso la 1 y la 2. Los resultados de la categoría 0 deberían considerarse con un alto grado de
desconfianza.
Tabla 14. Valores de NMP por gramo de muestra y límites del intervalo de confianza al 95 %
(cuando se utilizan cinco porciones de análisis de 1 g, cinco de 0.1 g y cinco de 0.01 g).
Número de tubos que muestran una reacción Límites al 95 % de confianza

positiva NMP (por g)
5 de 1 g 5 de 0.1 g 5 de 0.01 g Inferior Superior
0 0 0 <0.2 <0.1 0.7
0 1 0 0.2 <0.1 0.7
0 2 0 0.4 <0.1 1.1
1 0 0 0.2 <0.1 0.7
1 0 1 0.4 <0.1 1.1
1 1 0 0.4 <0.1 1.1
1 1 1 0.6 <0.1 1.5
2 0 0 0.5 <0.1 1.3
2 0 1 0.7 0.1 1.7
2 1 0 0.7 0.1 1.7
2 1 1 0.9 0.2 2.1
2 2 0 0.9 0.2 2.1
2 3 0 1.2 0.3 2.8
3 0 0 0.8 0.1 1.9
84
3 0 1 1.1 0.2 2.5
3 1 0 1.1 0.2 2.5
3 1 1 1.4 0.4 3.4
3 2 0 1.4 0.4 3.4
3 2 1 1.7 0.5 4.6
3 3 0 1.7 0.5 4.6
4 0 0 1.3 0.3 3.1
4 0 1 1.7 0.5 4.6
4 1 0 1.7 0.5 4.6
4 1 1 2.1 0.7 6.3
4 1 2 2.6 0.9 7.8
4 2 0 2.2 0.7 6.7
4 2 1 2.6 0.9 7.8
4 3 0 2.7 0.9 8
4 3 1 3.3 1.1 9.3
4 4 0 3.4 1.2 9.3
5 0 0 2.3 0.7 7
5 0 1 3.1 1.1 8.9
5 0 2 4.3 1.5 11
5 1 0 3.3 1.1 9.3
5 1 1 4.6 1.6 12
5 1 2 6.3 2.1 15
5 2 0 4.9 1.7 13
5 2 1 7 2.3 17
5 2 2 9.4 2.8 22
5 3 0 7.9 2.5 19
5 3 1 11 3.1 25
5 3 2 14 3.7 34
85
5 3 3 18 4.4 50
5 4 0 13 3.5 30
5 4 1 17 4.3 49
5 4 2 22 5.7 70
5 4 3 28 9 85
5 4 4 35 12 100
5 5 0 24 6.8 75
5 5 1 35 12 100
5 5 2 54 18 140
5 5 3 92 30 320
5 5 4 160 64 580
5 5 5 >180 − −
6. Precisión
Es bien conocido que con la técnica del NMP en los resultados pueden presentarse diferencias
importantes. Los límites de confianza especificados se basan completamente en una distribución
aleatoria de los resultados. Otras fuentes de variación, que pueden a veces ser incluso de mayor
importancia, no entran en la estimación del NMP. Para considerar tales influencias, se emplean las
categorías de la tabla B.2 de la norma ISO 7218:1996. Éstas resumen las combinaciones posibles de
tubos según la probabilidad de su aparición.
BAM Apéndice 2. Número más probable de diluciones seriales
La prueba de diluciones seriales determina la concentración de un microbio en particular en una

muestra con una estimación llamada el número más probable (NMP). El NMP es particularmente
útil para bajas concentraciones de microorganismos (< 100/g), especialmente en la leche y el agua y
para aquellos alimentos que por las partículas en suspensión puede interferir con el recuento preciso
de colonias.
Sólo organismos viables son contados por la determinación de NMP. Si, en la experiencia del
microbiólogo, las bacterias en la muestra preparada en cuestión, se encuentran unidas en cadenas
que no están separadas por la preparación y la dilución, el NMP debe ser juzgado como una
estimación de las unidades de crecimiento (GUs) o unidades formadoras de colonias (UFCs) en
lugar de las bacterias individuales. Sin embargo, por simplicidad en este apéndice se habla de estos
GUS o UFC como bacterias individuales. Si una prueba de confirmación incluye la selección de
colonias de la prueba, entonces se deberá realizar un ajuste estadístico no incluido en este apéndice.
86
Los siguientes supuestos son necesarios para apoyar el método del NMP. Las bacterias se
encuentran distribuidas al azar dentro de la muestra. Las bacterias son independientes, no se
encuentran agrupada, y no se repelen entre sí. Cada tubo (o la placa, etc), cuyo inóculo contenga
incluso un organismo viable producirá un cambio o crecimiento detectable. Los tubos individuales
de la muestra son independientes.
La esencia del método NMP es diluir la muestra a tal grado que los inóculos en los tubos a veces,
pero no siempre, contengan organismos viables. El "resultado", es decir, el número de tubos y el
número de tubos con el crecimiento en cada dilución, implicará una estimación de la concentración
original sin diluir, de bacterias en la muestra. Con el fin de obtener estimaciones sobre una amplia
gama de posibles concentraciones, los microbiólogos utilizan diluciones seriadas incubando los
tubos a varias diluciones.
El NMP es el número que hace que el resultado observado sea el más probable. Es la disolución
para λ, la concentración, en la siguiente ecuación:
∑ ∑
( )
donde exp (x) significa ex, y
K denota el número de diluciones,
gJ denota el número de positivos (o crecimiento) en tubos de la dilución j,
mJ denota la cantidad de la muestra original poner en cada tubo en la dilución j,
tj denota el número de tubos en la dilución j.
En general, esta ecuación se puede resolver por integración.
Intervalos de confianza
Los intervalos de confianza del 95 % en las tablas tienen el siguiente significado:
Antes de que los tubos sean inoculados, la probabilidad es que al menos el 95 % del intervalo de
confianza asociado con el resultado final englobará la concentración real.
Es posible construir muchos conjuntos diferentes de intervalos que satisfagan este criterio.
Precisión, desviación y resultados extremos
El NMP y los límites de confianza se han expresado en 2 dígitos significativos. Por ejemplo, la
entrada "400" se ha redondeado de un número entre 395 y 405.
Numerosos artículos han notado un sesgo hacia la sobreestimación de las concentraciones

microbianas del NMP. Garthright (1993) ha demostrado, sin embargo, que no hay sesgo apreciable
cuando las concentraciones se expresan como logaritmos, las unidades usuales utilizadas para
regresiones y para combinar los resultados. Por lo tanto, estos NMP no se han ajustado para el
sesgo.
87
El resultado con todos los tubos positivos en cada dilución no da el límite superior de la
concentración. Las tablas de este apéndice listan el NMP para este resultado tan grande como el
NMP más alto, para un resultado con al menos un tubo negativo. Del mismo modo, el resultado con
todos los tubos negativos aparece tan bajo, como el NMP más bajo para un resultado con al menos
un tubo positivo.
Notas de seguridad
Los resultados improbables
Varios problemas potenciales pueden causar resultados improbables. Por ejemplo, para una prueba
confirmatoria se puede pasar por alto el microbio de interés debido a que puede haber interferencia
en diluciones bajas o seleccionando muy pocas colonias en diluciones bajas. Si el problema se cree
limitado a las diluciones bajas, utilizando sólo las diluciones altas con tubos positivos podría ser
más fiable. Si la causa del problema es desconocida, la estimación puede ser poco fiable.
Los tubos no concluyentes
En casos especiales en que los tubos no pueden ser juzgados ya sea positivo o negativo (por
ejemplo, placas invadidas por la microflora que compite en diluciones bajas), los tubos deben ser
excluidos de los resultados. El resultado puede ser un número de tubos diferente de los que se
encuentran en las tablas de este apéndice. Su NMP puede ser resuelto mediante algoritmos
informáticos o estimado por la regla de Thomas. El método de Haldane puede encontrar los límites
de confianza.
Uso de tablas
Selección de tres diluciones para la tabla de referencia
Un NMP puede calcularse para cualquier número positivo de tubos en cualquier número positivo de
diluciones, pero a menudo las diluciones seriadas pueden usar tres o más diluciones y una serie
decimal (Cada dilución tiene una décima parte de la muestra original tanto como la dilución
anterior.) Las tablas de este apéndice requieren la reducción de un resultado a tres de sus diluciones
decimales. Este procedimiento de selección de tres diluciones fue desarrollado para los diseños
(número de tubos por dilución y la relación de diluciones) en estas tablas. Todos ellos tienen
diluciones decimales y un número relativamente pequeño de tubos por dilución. Para otros diseños,
otros procedimientos pueden ser necesarios. Cuando el modelo de NMP las posee, las tres
diluciones decimales se eligen para dar una buena aproximación al NMP del resultado completo. De
lo contrario, la reducción puede eliminar la interferencia (posible de otra especie de microbio o una
sustancia tóxica) que se pueda diluir.
En primer lugar, retire la dilución más alta (el volumen más pequeño de la muestra), si está y la
dilución inmediatamente inferior tiene todos los tubos negativos. Mientras se mantiene esta
condición y por lo menos quedan cuatro diluciones, puede continuar con la eliminación de estas
diluciones.
Si más de tres diluciones permanecen, entonces se debe encontrar la mayor dilución con todos los
tubos positivos. Hay tres casos. En el primer caso, la mayor dilución con todos los tubos positivos
está dentro de las tres diluciones más altas restantes. A continuación, utilice las tres diluciones más
altas restantes.
88
En el segundo caso, la mayor dilución con todos los tubos positivos no está dentro de las tres
diluciones más altas restantes. A continuación, seleccione las dos diluciones próximas más altas que
la dilución más alta con todos los tubos positivos. Asignar la suma de los tubos positivos de
cualquier dilución mayor a la tercera dilución mayor.
En el tercer caso, no hay dilución con todos los tubos positivos. A continuación, seleccione las dos
diluciones más bajas. Asignar la suma de los tubos positivos de cualquier dilución mayor a la
tercera dilución.
Si las tres diluciones seleccionadas no se encuentran en las tablas, entonces pudo haber ocurrido
algo inusual en la dilución seriada. Esta es una advertencia de que el resultado es lo suficientemente
improbable para que los básicos supuestos del NMP puedan ser cuestionados. Si es posible, volver a
hacer la prueba puede ser el procedimiento más fiable. Si un valor de NMP aún se desea, utilice las
tres diluciones más altas restantes.
Conversión de unidades de las tablas
En las tablas descritas a continuación se aplican para inóculos de 0.1, 0.01 y 0.001 g. Cuando se
seleccionan diferentes inóculos para hacer referencia a las tablas, multiplique el NMP/g y los
límites de confianza por cualquier multiplicador hace que la inoculación coincida con el inóculo de
la tabla.
Límites y aproximaciones para un diseño sin una tabla
El NMP para una serie de diluciones que no aparece en alguna tabla (por ejemplo, como resultado
de la pérdida accidental de unos tubos) puede ser calculada por iteración o delimitada de la
siguiente manera.
∑ ∑
∑ ( )
∑ ( ) ∑ ( )
Cuando W y Q son dos conjuntos no continuos de diluciones que en conjunto contienen todas las
diluciones. El límite inferior permite diluciones bajas con todos los tubos positivos que se pueden
eliminar del límite.
A continuación se da una estimación del NMP. En primer lugar, seleccionar la dilución más baja
que no tenga todos los tubos positivos. En segundo lugar, seleccionar la dilución más alta con al
menos un tubo positivo. Por último, seleccionar todas las diluciones entre ellos. Utilizar sólo las
diluciones seleccionadas en la siguiente fórmula de Thomas (1942):
(∑ )
( )
(∑ ∑( ) )
donde la suma se extiende a las diluciones seleccionadas y
Σ gj denota el número de tubos positivos en las diluciones seleccionadas,

Σ tjmj denota los gramos de muestra en todos los tubos en las diluciones seleccionadas,
Σ (tj-gj) mj indica los gramos de muestra en todos los tubos negativos en las diluciones
seleccionadas.
89
Tabla 15. Para 3 tubos cada uno con 0.1, 0.01, 0.001 g de inóculo, el NMP por gramo y los
intervalos de confianza de 95 por ciento.
Tubos positivos MPN/g Límites de Tubos positivos MPN/g Límites de
confianza confianza
0.10 0.01 0.001 Inferior Superior 0.10 0.01 0.001 Inferior Superior
0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1 000
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1 000
2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2 000
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1 100 180 4 100
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1 420 --

100
Tabla 16. Para 5 tubos cada uno con .1, 0.01 y 0.001 g de inóculo, el NMP y los intervalos de
confianza al 95 por ciento.
90
Tubos positivos MPN/g Límites de confianza Tubos positivos MPN/g Límites de

confianza
0 0 0 <1.8 -- 6.8 4 0 2 21 6.8 40
0 0 1 1.8 0.09 6.8 4 0 3 25 9.8 70
0 1 0 1.8 0.09 6.9 4 1 0 17 6 40
0 1 1 3.6 0.7 10 4 1 1 21 6.8 42
0 2 0 3.7 0.7 10 4 1 2 26 9.8 70
0 2 1 5.5 1.8 15 4 1 3 31 10 70
0 3 0 5.6 1.8 15 4 2 0 22 6.8 50
1 0 0 2 0.1 10 4 2 1 26 9.8 70
1 0 1 4 0.7 10 4 2 2 32 10 70
1 0 2 6 1.8 15 4 2 3 38 14 100
1 1 0 4 0.7 12 4 3 0 27 9.9 70
1 1 1 6.1 1.8 15 4 3 1 33 10 70
1 1 2 8.1 3.4 22 4 3 2 39 14 100
1 2 0 6.1 1.8 15 4 4 0 34 14 100
1 2 1 8.2 3.4 22 4 4 1 40 14 100
1 3 0 8.3 3.4 22 4 4 2 47 15 120
1 3 1 10 3.5 22 4 5 0 41 14 100
1 4 0 11 3.5 22 4 5 1 48 15 120
2 0 0 4.5 0.79 15 5 0 0 23 6.8 70
2 0 1 6.8 1.8 15 5 0 1 31 10 70
2 0 2 9.1 3.4 22 5 0 2 43 14 100
2 1 0 6.8 1.8 17 5 0 3 58 22 150
2 1 1 9.2 3.4 22 5 1 0 33 10 100
2 1 2 12 4.1 26 5 1 1 46 14 120
2 2 0 9.3 3.4 22 5 1 2 63 22 150
91
2 2 1 12 4.1 26 5 1 3 84 34 220
2 2 2 14 5.9 36 5 2 0 49 15 150
2 3 0 12 4.1 26 5 2 1 70 22 170
2 3 1 14 5.9 36 5 2 2 94 34 230
2 4 0 15 5.9 36 5 2 3 120 36 250
3 0 0 7.8 2.1 22 5 2 4 150 58 400
3 0 1 11 3.5 23 5 3 0 79 22 220
3 0 2 13 5.6 35 5 3 1 110 34 250
3 1 0 11 3.5 26 5 3 2 140 52 400
3 1 1 14 5.6 36 5 3 3 180 70 400
3 1 2 17 6 36 5 3 4 210 70 400
3 2 0 14 5.7 36 5 4 0 130 36 400
3 2 1 17 6.8 40 5 4 1 170 58 400
3 2 2 20 6.8 40 5 4 2 220 70 440
3 3 0 17 6.8 40 5 4 3 280 100 710
3 3 1 21 6.8 40 5 4 4 350 100 710
3 3 2 24 9.8 70 5 4 5 430 150 1 100
3 4 0 21 6.8 40 5 5 0 240 70 710
3 4 1 24 9.8 70 5 5 1 350 100 1 100
3 5 0 25 9.8 70 5 5 2 540 150 1 700
4 0 0 13 4.1 35 5 5 3 920 220 2 600
4 0 1 17 5.9 36 5 5 4 1 600 400 4 600
5 5 5 >1 700 --
600
Tabla 17. Para 10 tubos cada uno con 0.1, 0.01 y 0.001 g de inóculo, el NMP y los intervalos de
Tubos positivos MPN/g Límites de Tubos positivos MPN/g Límites de
confianza confianza
92
0 0 0 <.90 -- 3.1 8 2 0 17 7.7 34
0 0 1 0.9 0.04 3.1 8 2 1 19 9 34
0 0 2 1.8 0.33 5.1 8 2 2 21 10 39
0 1 0 0.9 0.04 3.6 8 2 3 23 11 44
0 1 1 1.8 0.33 5.1 8 3 0 19 9 34
0 2 0 1.8 0.33 5.1 8 3 1 21 10 39
0 2 1 2.7 0.8 7.2 8 3 2 24 11 44
0 3 0 2.7 0.8 7.2 8 3 3 26 12 50
1 0 0 0.94 0.05 5.1 8 4 0 22 10 39
1 0 1 1.9 0.33 5.1 8 4 1 24 11 44
1 0 2 2.8 0.8 7.2 8 4 2 26 12 50
1 1 0 1.9 0.33 5.7 8 4 3 29 14 58
1 1 1 2.9 0.8 7.2 8 5 0 24 11 44
1 1 2 3.8 1.4 9 8 5 1 27 12 50
1 2 0 2.9 0.8 7.2 8 5 2 29 14 58
1 2 1 3.8 1.4 9 8 5 3 32 15 62
1 3 0 3.8 1.4 9 8 6 0 27 12 50
1 3 1 4.8 2.1 11 8 6 1 30 14 58
1 4 0 4.8 2.1 11 8 6 2 33 15 62
2 0 0 2 0.37 7.2 8 7 0 30 14 58
2 0 1 3 0.81 7.3 8 7 1 33 17 73
2 0 2 4 1.4 9 8 7 2 36 17 74
2 1 0 3 0.82 7.8 8 8 0 34 17 73
2 1 1 4 1.4 9 8 8 1 37 17 74
2 1 2 5 2.1 11 9 0 0 17 7.5 31
2 2 0 4 1.4 9.1 9 0 1 19 9 34
2 2 1 5 2.1 11 9 0 2 22 10 39
93
2 2 2 6.1 3 14 9 0 3 24 11 44
2 3 0 5.1 2.1 11 9 1 0 19 9 39
2 3 1 6.1 3 14 9 1 1 22 10 40
2 4 0 6.1 3 14 9 1 2 25 11 44
2 4 1 7.2 3.1 15 9 1 3 28 14 58
2 5 0 7.2 3.1 15 9 1 4 31 14 58
3 0 0 3.2 0.9 9 9 2 0 22 10 44
3 0 1 4.2 1.4 9.1 9 2 1 25 11 46
3 0 2 5.3 2.1 11 9 2 2 28 14 58
3 1 0 4.2 1.4 10 9 2 3 32 14 58
3 1 1 5.3 2.1 11 9 2 4 35 17 73
3 1 2 6.4 3 14 9 3 0 25 12 50
3 2 0 5.3 2.1 12 9 3 1 29 14 58
3 2 1 6.4 3 14 9 3 2 32 15 62
3 2 2 7.5 3.1 15 9 3 3 36 17 74
3 3 0 6.5 3 14 9 3 4 40 20 91
3 3 1 7.6 3.1 15 9 4 0 29 14 58
3 3 2 8.7 3.6 17 9 4 1 33 15 62
3 4 0 7.6 3.1 15 9 4 2 37 17 74
3 4 1 8.7 3.6 17 9 4 3 41 20 91
3 5 0 8.8 3.6 17 9 4 4 45 20 91
4 0 0 4.5 1.6 11 9 5 0 33 17 73
4 0 1 5.6 2.2 12 9 5 1 37 17 74
4 0 2 6.8 3 14 9 5 2 42 20 91
4 1 0 5.6 2.2 12 9 5 3 46 20 91
4 1 1 6.8 3 14 9 5 4 51 25 120
4 1 2 8 3.6 17 9 6 0 38 17 74
4 2 0 6.8 3 15 9 6 1 43 20 91
94
4 2 1 8 3.6 17 9 6 2 47 21 100
4 2 2 9.2 3.7 17 9 6 3 53 25 120
4 3 0 8.1 3.6 17 9 7 0 44 20 91
4 3 1 9.3 4.5 18 9 7 1 49 21 100
4 3 2 10 5 20 9 7 2 54 25 120
4 4 0 9.3 4.5 18 9 7 3 60 26 120
4 4 1 11 5 20 9 8 0 50 25 120
4 5 0 11 5 20 9 8 1 55 25 120
4 5 1 12 5.6 22 9 8 2 61 26 120
4 6 0 12 5.6 22 9 8 3 68 30 140
5 0 0 6 2.5 14 9 9 0 57 25 120
5 0 1 7.2 3.1 15 9 9 1 63 30 140
5 0 2 8.5 3.6 17 9 9 2 70 30 140
5 0 3 9.8 4.5 18 10 0 0 23 11 44
5 1 0 7.3 3.1 15 10 0 1 27 12 50
5 1 1 8.5 3.6 17 10 0 2 31 14 58
5 1 2 9.8 4.5 18 10 0 3 37 17 73
5 1 3 11 5 21 10 1 0 27 12 57
5 2 0 8.6 3.6 17 10 1 1 32 14 61
5 2 1 9.9 4.5 18 10 1 2 38 17 74
5 2 2 11 5 21 10 1 3 44 20 91
5 3 0 10 4.5 18 10 1 4 52 25 120
5 3 1 11 5 21 10 2 0 33 15 73
5 3 2 13 5.6 23 10 2 1 39 17 79
5 4 0 11 5 21 10 2 2 46 20 91
5 4 1 13 5.6 23 10 2 3 54 25 120
5 4 2 14 7 26 10 2 4 63 30 140
5 5 0 13 6.3 25 10 3 0 40 17 91
95
5 5 1 14 7 26 10 3 1 47 20 100
5 6 0 14 7 26 10 3 2 56 25 120
6 0 0 7.8 3.1 17 10 3 3 66 30 140
6 0 1 9.2 3.6 17 10 3 4 77 34 150
6 0 2 11 5 20 10 3 5 89 39 180
6 0 3 12 5.6 22 10 4 0 49 21 120
6 1 0 9.2 3.7 18 10 4 1 59 25 120
6 1 1 11 5 21 10 4 2 70 30 150
6 1 2 12 5.6 22 10 4 3 82 38 180
6 1 3 14 7 26 10 4 4 94 44 180
6 2 0 11 5 21 10 4 5 110 50 210
6 2 1 12 5.6 22 10 5 0 62 26 140
6 2 2 14 7 26 10 5 1 74 30 150
6 2 3 15 7.4 30 10 5 2 87 38 180
6 3 0 12 5.6 23 10 5 3 100 44 180
6 3 1 14 7 26 10 5 4 110 50 210
6 3 2 15 7.4 30 10 5 5 130 57 220
6 4 0 14 7 26 10 5 6 140 70 280
6 4 1 15 7.4 30 10 6 0 79 34 180
6 4 2 17 9 34 10 6 1 94 39 180
6 5 0 16 7.4 30 10 6 2 110 50 210
6 5 1 17 9 34 10 6 3 120 57 220
6 5 2 19 9 34 10 6 4 140 70 280
6 6 0 17 9 34 10 6 5 160 74 280
6 6 1 19 9 34 10 6 6 180 91 350
6 7 0 19 9 34 10 7 0 100 44 210
7 0 0 10 4.5 20 10 7 1 120 50 220
7 0 1 12 5 21 10 7 2 140 61 280
96
7 0 2 13 6.3 25 10 7 3 150 73 280
7 0 3 15 7.2 28 10 7 4 170 91 350
7 1 0 12 5 22 10 7 5 190 91 350
7 1 1 13 6.3 25 10 7 6 220 100 380
7 1 2 15 7.2 28 10 7 7 240 110 480
7 1 3 17 7.7 31 10 8 0 130 60 250
7 2 0 13 6.4 26 10 8 1 150 70 280
7 2 1 15 7.2 28 10 8 2 170 80 350
7 2 2 17 7.7 31 10 8 3 200 90 350
7 2 3 19 9 34 10 8 4 220 100 380
7 3 0 15 7.2 30 10 8 5 250 120 480
7 3 1 17 9 34 10 8 6 280 120 480
7 3 2 19 9 34 10 8 7 310 150 620
7 3 3 21 10 39 10 8 8 350 150 620
7 4 0 17 9 34 10 9 0 170 74 310
7 4 1 19 9 34 10 9 1 200 91 380
7 4 2 21 10 39 10 9 2 230 100 480
7 4 3 23 11 44 10 9 3 260 120 480
7 5 0 19 9 34 10 9 4 300 140 620
7 5 1 21 10 39 10 9 5 350 150 630
7 5 2 23 11 44 10 9 6 400 180 820
7 6 0 21 10 39 10 9 7 460 210 970
7 6 1 23 11 44 10 9 8 530 210 970
7 6 2 25 12 46 10 9 9 610 280 1 300
7 7 0 23 11 44 10 10 0 240 110 480
7 7 1 26 12 50 10 10 1 290 120 620
8 0 0 13 5.6 25 10 10 2 350 150 820
8 0 1 15 7 26 10 10 3 430 180 970
97
8 0 2 17 7.5 30 10 10 4 540 210 1 300
8 0 3 19 9 34 10 10 5 700 280 1 500
8 1 0 15 7.1 28 10 10 6 920 350 1 900
8 1 1 17 7.7 31 10 10 7 1 200 480 2 400
8 1 2 19 9 34 10 10 8 1 600 620 3 400
8 1 3 21 10 39 10 10 9 2 300 810 5 300
10 10 10 >2 1 300 --
300
Tabla 18. Para 8 tubos cada uno con 0.1, 0.01 y 0.001 g de inóculo, el NMP y los intervalos de
Tubos positivos Límites de confianza

NMP/g
0.1 0.01 0.001 Inferior Superior
0 0 0 <1.2 -- 4.3
0 0 1 1.1 .057 4.3
0 0 2 2.3 .42 6.7
0 1 0 1.1 .058 4.4
0 1 1 2.3 .42 6.7
0 2 0 2.3 .42 6.7
0 2 1 3.4 1.0 9.1
0 3 0 3.4 1.0 9.1
1 0 0 1.2 .064 6.7
1 0 1 2.4 .42 6.8
1 0 2 3.6 1.0 9.1
1 1 0 2.4 .42 7.3
1 1 1 3.6 1.0 9.1
1 1 2 4.8 1.8 12
1 2 0 3.6 1.0 9.1
98
1 2 1 4.9 1.8 12
1 3 0 4.9 1.8 12
1 3 1 6.1 2.8 15
1 4 0 6.2 2.8 15
2 0 0 2.6 .47 9.1
2 0 1 3.8 1.0 9.1
2 0 2 5.1 1.8 12
2 1 0 3.9 1.0 9.9
2 1 1 5.2 1.8 12
2 1 2 6.5 2.8 15
2 2 0 5.2 1.8 12
2 2 1 6.5 2.8 15
2 2 2 7.9 3.3 18
2 3 0 6.6 2.8 15
2 3 1 7.9 3.3 18
2 4 0 8.0 3.3 18
2 5 0 9.4 4.3 19
3 0 0 4.1 1.2 12
3 0 1 5.5 1.9 12
3 0 2 6.9 2.8 15
3 1 0 5.6 1.9 13
3 1 1 7.0 2.8 15
3 1 2 8.4 4.0 18
3 2 0 7.0 2.9 15
3 2 1 8.5 4.0 18
3 2 2 10 4.3 19
3 3 0 8.6 4.0 18
3 3 1 10 4.3 19
99
3 3 2 12 5.2 24
3 4 0 10 4.3 19
3 4 1 12 5.2 24
3 5 0 12 5.2 24
4 0 0 6.0 2.1 15
4 0 1 7.5 2.9 15
4 0 2 9.1 4.1 18
4 1 0 7.6 2.9 18
4 1 1 9.2 4.1 19
4 1 2 11 4.3 22
4 2 0 9.3 4.1 19
4 2 1 11 4.3 22
4 2 2 13 5.7 24
4 3 0 11 4.3 22
4 3 1 13 5.7 24
4 3 2 14 6.6 28
4 4 0 13 5.7 24
4 4 1 15 6.6 29
4 5 0 15 6.6 29
4 5 1 16 7.2 33
4 6 0 17 7.2 33
5 0 0 8.3 3.3 18
5 0 1 10 4.3 19
5 0 2 12 5.2 24
5 0 3 14 6.6 29
5 1 0 10 4.3 22
5 1 1 12 5.2 24
5 1 2 14 6.6 29
100
5 1 3 16 6.7 32
5 2 0 12 5.3 24
5 2 1 14 6.6 29
5 2 2 16 7.2 33
5 2 3 18 7.2 33
5 3 0 14 6.6 29
5 3 1 16 7.2 33
5 3 2 18 7.2 33
5 4 0 16 7.2 33
5 4 1 18 7.6 33
5 4 2 21 9.0 39
5 5 0 19 7.6 33
5 5 1 21 9.0 39
5 6 0 21 9.0 39
6 0 0 11 4.3 24
6 0 1 13 5.7 25
6 0 2 16 6.6 32
6 0 3 18 7.2 33
6 1 0 14 5.8 29
6 1 1 16 6.6 32
6 1 2 18 7.2 33
6 1 3 21 9.0 39
6 2 0 16 6.7 33
6 2 1 18 7.4 33
6 2 2 21 9.0 39
6 2 3 23 11 50
6 3 0 19 7.6 35
6 3 1 21 9.0 39
101
6 3 2 24 11 50
6 3 3 27 12 53
6 4 0 21 9.0 40
6 4 1 24 11 50
6 4 2 27 12 53
6 6 1 31 13 69
6 7 0 31 13 69
7 0 0 16 6.6 32
7 0 1 18 7.2 33
7 0 2 21 9.0 40
7 0 3 25 11 50
7 1 0 19 7.9 39
7 1 1 22 9.0 40
7 1 2 25 11 50
7 1 3 29 12 54
7 2 0 22 9.0 45
7 2 1 25 11 51
7 2 2 29 13 68
7 2 3 33 13 69
7 3 0 26 11 53
7 3 1 30 13 68
7 3 2 34 13 69
7 3 3 39 17 91
7 4 0 30 13 69
7 4 1 35 13 69
7 4 2 39 17 91
7 4 3 45 18 101
7 5 0 36 14 75
102
7 5 1 40 17 91
7 5 2 46 18 101
7 5 3 52 21 117
7 6 0 41 17 91
7 6 1 47 21 117
7 6 2 53 21 117
7 6 3 59 24 146
7 7 0 48 21 117
7 7 1 55 21 117
7 7 2 61 24 146
7 8 0 56 21 119
8 0 0 23 9.7 50
8 0 1 28 12 54
8 0 2 34 13 69
8 0 3 41 17 91
8 1 0 29 12 68
8 1 1 35 13 75
8 1 2 43 17 91
8 1 3 52 21 120
8 1 4 63 28 150
8 2 0 36 14 91
8 2 1 45 17 100
8 2 2 55 21 120
8 2 3 67 28 150
8 2 4 81 32 190
8 3 0 47 18 120
8 3 1 58 21 150
8 3 2 72 28 150
103
8 3 3 87 39 190
8 3 4 102 39 190
8 3 5 118 50 240
8 4 0 62 24 150
8 4 1 77 28 190
8 4 2 94 39 190
8 4 3 110 44 220
8 4 4 130 53 250
8 4 5 150 68 280
8 5 0 84 32 190
8 5 1 100 39 220
8 5 2 120 50 250
8 5 3 140 67 280
8 5 4 170 74 340
8 5 5 190 74 340
8 5 6 210 90 400
8 6 0 110 45 240
8 6 1 140 53 280
8 6 2 160 68 340
8 6 3 190 74 340
8 6 4 220 90 400
8 6 5 250 120 490
8 6 6 290 120 520
8 7 0 160 68 340
8 7 1 190 74 400
8 7 2 230 90 490
8 7 3 270 116 520
8 7 4 310 150 710
104
8 7 5 370 150 720
8 7 6 430 190 1 000
8 7 7 510 190 1 000
8 8 0 240 99 490
8 8 1 300 120 710
8 8 2 380 150 1 000
8 8 3 510.0 190 1 200
8 8 4 700 240 1 700
8 8 5 980 340 2 200
8 8 6 1 400 490 3 100
8 8 7 2 100 710 5 100
8 8 8 >2 100 1 000 --
Tabla 19. Para 10 tubos con 10 ml de inóculo, el NMP por 100 ml y los intervalos de confianza
del 95 por ciento.
Tubos positivos NMP/100ml Límites de confianza
Inferior Superior
0 <1.1 - 3.3
1 1.1 .05 5.9
2 2.2 .37 8.1
3 3.6 .91 9.7
4 5.1 1.6 13
5 6.9 2.5 15
6 9.2 3.3 19
7 12 4.8 24
8 16 5.9 33
9 23 8.1 53
10 >23 12 -
105
4. GLOSARIO DE MEDIOS DE CULTIVO Y OTROS REACTIVOS
Para diseñar un medio de cultivo se debe tener en cuenta no sólo los nutrientes requeridos por el
microorganismo que se desea estudiar, sino también las condiciones físicas que le permitan crecer,
tal y como Hodges (2007), Willey et al., 2008 y Madigan et al., 2011 lo describen:
1. Nutrientes: La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene

determinada por el rendimiento de un producto, además de los requerimientos nutricionales del
microorganismo.
2. pH: Un microorganismo puede alterarse o alterar el pH del medio de cultivo como resultado de
las sustancias producidas por el propio microorganismo. Estos cambios pueden llegar a inhibir
el crecimiento del microorganismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH
mediante sistemas tampón, el más utilizado en microbiología es la combinación de KH2PO4 y
K2HPO4.
3. Necesidades de gases: los principales gases que afectan al desarrollo microbiano son el O2 y
CO2. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al O2 libre clasificándose en 4
grupos:
• Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de O2 libre.
• Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de O2 libre.
• Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan en presencia o ausencia de O2 libre.
• Microaerobias: bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de O2 libre.
4. Suministro de luz: Los organismos fotosintéticos deberán ser expuestos a una fuente de
iluminación, la cual no debe plantear problemas de variación de temperatura, por lo que suelen
usarse lámparas fluorescentes con un desprendimiento mínimo de calor.
5. Control de temperatura: El desarrollo de las bacterias depende de reacciones químicas y la

velocidad con que se efectúan, las cuales están influidas por la temperatura, por lo cual la
temperatura puede, en parte, determinar el crecimiento de los microorganismos en estudio.
Cada especie microbiana posee una temperatura óptima de crecimiento clasificándose según
esto en:
• Psicrófilas: capaces de desarrollarse a 0 °C o menos. Su temperatura óptima es alrededor de

los 15 °C.
• Mesófilas: crecen mejor entre 25 °C y 40 °C.
• Termófilas: crecen mejor entre 45 °C y 60 °C.
6. Grado de humedad
7. Presión osmótica: generalmente se trabaja en condiciones de isofonía (300 miliosmoles),

aunque existen bacterias que pueden crecer en concentraciones hipotónicas e hipertónicas
8. Esterilidad
106
9. Protección: El medio de cultivo debe estar protegido de la contaminación microbiana

ambiental.
Agar-Agar
Sustancia mucilaginosa que se extrae de algunas algas rojas o Rodofíceas, frecuentes en el océano
atlántico, pacífico e índico. Es una sustancia amorfa. Se emplea como medio de cultivo en
bacteriología, como apresto de sedas, como sustituto de la gelatina, etc.
La forma seca del agar-agar se conoce de mediados del siglo XVIII, cuando un japonés descubrió,
accidentalmente, la manera de purificarlo y secarlo. Fue llevado de China a Europa y traído a
América a mediados del siglo XIX, para utilizarse, principalmente, como substituto de la gelatina
en la confección de postres gelatinosos. Químicamente, el agar-agar es una mezcla compleja de
sales de polisacáridos, fundamentalmente, galactósidos. Las grandes moléculas que lo constituyen
determinan sus cualidades sobresalientes, como coloides y espesantes, que lo han hecho hasta ahora
insustituible. Además de los polisacáridos, el agar-agar contiene numerosos cationes asociados,
tales como sodio, potasio, calcio, magnesio, etc. los cuales no está claramente establecida su
influencia sobre las propiedades de este producto.
Referente a las propiedades y contenidos del agar-agar, básicamente, dependen de la materia prima
empleada, procedencia geográfica, época de cosecha y madurez del alga.
A continuación, se caracterizarán los tipos de medios de cultivo según su estado y composición.
Estado:
• Medios sólidos: Su proporción de agar es siempre por encima del 15 %.
• Medios semisólidos: Son medios intermedios entre los medios líquidos y sólidos, su
proporción de agar puede ser inferior al 5 %, pero siempre suele presentar cierta cantidad que le
proporcione una consistencia semisólida.
• Medios líquidos o caldos: No contiene agar y su composición (además de agua) suele

contener al menos una fuente de carbono, sales minerales, y a veces según las características del
medio, factores de crecimiento, vitaminas, peptonas, aminoácidos, entre otros.
Composición:
• Medios sintéticos o químicamente definidos: Llevan fuentes de carbono, nitrógeno, sales

que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca, etc.), otros elementos como estimuladores de crecimiento pero
siempre a concentraciones conocidas.
• Medios complejos o de composición indefinida: Estos medios llevan ingredientes como

extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes
en abundancia, pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos
nutrientes.
• Medios de enriquecimiento: Son medios complejos, normalmente, con aditivos adicionales

para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente heterótrofos
exigentes). Tales como: adición de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.
• Medios selectivos: Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de
un microorganismo particular o grupo de microorganismos. Es de gran utilidad para el aislamiento
107
de microorganismos a partir de una población microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de
carbono es selectivo para autótrofos, adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los
Gram (+), utilizando maltosa como única fuente de carbono, sólo crecerán los que usen maltosa.
• Medios diferenciales: Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de

microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios.
Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkey diferencia lactosa (+)
de lactosa (-).
• Medios de mantenimiento: Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el

crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Por ejemplo: al añadir
glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es
preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.
4.1 Escherichia coli y coliformes
NOM-112-SSA1-1994
Reactivo o medio de cultivo: Caldo lactosado (concentración 1.5, concentración sencilla).
Ingredientes:
Extracto de Peptona de
Ingredientes Lactosa Agua
carne gelatina
Cantidades
(concentración 4.5 g 7.5 g 7.5 g 1 000 ml
sencilla)
Cantidades
3.0 g 5.0 g 5.0 g 1 000 ml
(concentración 1.5)
Preparación: Disolver los ingredientes en 1 L de agua, calentando si es necesario o el medio

completo deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar el pH final de tal manera
que después de la esterilización éste sea de 6.9 ± 0.2 a 25 °C. Distribuir en volúmenes de 10 ml en
tubos con dimensiones de 16 mm x 160 mm el medio de concentración sencilla y de 20 ml en tubos
de 20 mm x 200 mm el medio de concentración 1.5, cada tubo debe tener campana de
fermentación. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 °C ± 1.0 °C. Enfriar rápidamente para
evitar una exposición excesiva al calor. El aspecto del caldo es claro y de color beige. Se puede
utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 ml del caldo
preparado, cuando se agreguen 10 ml de la muestra.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo lauril sulfato triptosa (concentración 1.5, concentración
sencilla).
Ingredientes:
Lauril
Fosfato Fosfato Cloruro
Ingredientes Triptosa Lactosa sulfato de Agua
dipotásico monopotásico de sodio
sodio
108
Cantidades
1 000
(concentración 3.0 g 7.5 g 4.125 g 4.125 g 7.5 g 0.15 g
ml
sencilla)
Cantidades
1 000
(concentración 20.0 g 5.0 g 2.75 g 2.75 g 5.0 g 0.1g
ml
1.5)
Preparación: Disolver los componentes en 1 L de agua, calentando si es necesario o el medio de

cultivo completo deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar el pH de tal
manera que después de la esterilización éste sea de 6.8 ± 0.2 a 25 °C. Distribuir en volúmenes de 10
ml en tubos con dimensiones de 16 mm x 160 mm el medio de concentración sencilla y de 20 ml en
tubos de 20 mm x 200 mm el medio de concentración 1.5, cada tubo debe tener campana de
fermentación. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 °C ± 1.0 °C. Se recomienda almacenar
el medio una vez preparado. Las campanas de fermentación no deben de contener burbujas de aire
después de la esterilización. Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en
cuyo caso se emplearán 10 ml de caldo preparado, cuando se agreguen 10 ml de muestra.
Reactivo o Medio de cultivo: Caldo lactosa bilis verde brillante.
Ingredientes:
Verde
Ingredientes Peptona Lactosa Sales biliares Agua
brillante
Cantidades 10 g 10 g 20 g 0.0133 g 1.0 L
Preparación: Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en agua, calentar si es

necesario. Ajustar el pH, de tal manera que después de la esterilización éste sea de 7.2 a 25 °C.
Distribuir el medio en cantidades de 10 ml en tubos de 16 mm X 160 mm conteniendo campana de
fermentación. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 °C ± 1.0 °C. Las campanas de
fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.
NOM-113-SSA1-1994
Reactivo o medio de cultivo: Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (RVBA).
Ingredientes:
Extracto de Cloruro de
Ingredientes Peptona Lactosa Sales biliares
levadura sodio
Cantidades 7.0 g 3.0 g 10.0 g 1.5 g 1.0 L
Preparación: Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos.
Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7.4 con ácido clorhídrico 0.1N o con hidróxido de sodio
0.1N a 25 °C, de tal forma que después del calentamiento se mantenga en este valor. Calentar con
agitación constante y hervir durante 2 minutos. Enfriar inmediatamente el medio en un baño de
agua hasta que llegue a 45 °C. Evitar el sobrecalentamiento del medio. No debe esterilizarse en
autoclave. Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación. En el caso de
utilizar medio de cultivo deshidratado, seguir las instrucciones del fabricante.
109
Reactivo o medio de cultivo: Disolución reguladora de fosfatos.
Ingredientes:
Ingredientes Fosfato monopotásico Agua destilada

Cantidades 34.0 g 1.0 L
Preparación: Disolver el fosfato en el agua y ajustar el pH a 7.2 con disolución de hidróxido de

sodio 1 N. Llevar con agua a 1 litro. Esterilizar por 15 min a 121 °C. Conservar en refrigeración
(disolución concentrada). Tomar 1.25 ml de la disolución concentrada y llevar a un litro de agua
(disolución de trabajo). Distribuir en porciones según se requieran. Esterilizar por 15 min a 121 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Agua peptonada.
Ingredientes:
Ingredientes Peptona NaCl Agua destilada

Cantidades 1.0 g 8.5 g 1.0 L
Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada. Ajustar el pH a 7.0 con NaOH 1 N.
Distribuir en porciones de 99 ml, 90 ml y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se
requiera. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 °C ± 1.0 °C.
UNE-EN ISO 16654:2002
Reactivo o medio de cultivo: Caldo triptona soya modificado (mTSB) + novobiocina (N).
Ingredientes:
Ingredientes Cantidades
Digerido enzimático de caseína 17.0 g
Digerido enzimático de soya 3.0 g
D(+)-glucosa 2.5 g
Sales biliares n° 3 1.5 g
Cloruro de sódio 5.0 g
Dipotasio hidrógeno fosfato (K2HPO4) 4.0 g
Agua 1 000 ml
*Novobiocina 0.45 g y agua 100 ml
Preparación: Se disuelven en agua los constituyentes del medio completo deshidratado, calentando
si fuera necesario. Se ajusta el pH si fuera necesario, utilizando el pHmetro, de manera que después
de la esterilización sea de 7.4 ± 0.2 a 25 °C. Se reparte el medio en cantidades adecuadas en
110
matraces o frascos. Se esteriliza durante 5 min en autoclave regulado a 121 °C. * Se disuelve la
novobiocina en agua y se esteriliza mediante filtración por membrana. Se prepara el día de su
utilización. Preparación del medio completo: inmediatamente antes de su uso se añade 1 ml ó 4 ml
de la disolución de novobiocina a 225 ml ó a 900 ml respectivamente de mTSB enfriado. La
concentración final de novobiocina es de 20 mg por litro de mTSB.
Reactivo o medio de cultivo: Agar cefixima telurito sorbitol MacConkey agar (CT-SMAC).
Ingredientes:
Digerido
Digerido Sales Cloruro
enzimático Rojo Violeta
Ingredientes enzimático Sorbitol biliares de Agar Agua
de tejidos neutro cristal
de caseína n° 3 sódio
animales
9.0 g
0.001 a 1 000
Cantidades 17.0 g 3.0 g 10.0 g 1.5 g 5.0 g 0.03 g
g 18.0 ml
g
* Telurito potásico para uso bacteriológico 5 mg, agua 100 ml. ** Cefixima 5 mg, agua 100 ml.
***Medio completo: medio base 1 000 ml, disolución de telurito potásico 1 ml, disolución de
cefixima 1 ml.
Preparación: Se disuelven en agua mediante ebullición los constituyentes básicos, o la base

deshidratada completa. Se ajusta el pH de manera que después de la esterilización sea de 7.1 ± 0.2 a
25 °C. Se esteriliza durante 15 min en autoclave regulado a 121 °C. * Se disuelve el telurito
potásico en el agua y se esteriliza mediante filtración por membrana. Esta disolución puede ser
almacenada hasta un mes a temperatura ambiente, pero se desecha si se forma un precipitado
blanco. ** Se disuelve la cefixina en agua y se esteriliza mediante filtración por membrana, puede
almacenarse la disolución a 3 °C ± 2 °C durante una semana. *** En el caso de medio base recién
esterilizado, se enfría a una temperatura entre 44 °C y 47 °C y en el caso del medio base
esterilizado previamente y solidificado, se funde en corriente de vapor y a continuación se enfría
entre 44 °C y 47 °C. Se añade el telurito y la cefixima al medio base, se mezcla y se vierten
cantidades de unos 15 ml en cajas Petri estériles y se deja solidificar. Antes de su uso, se secan las
placas del agar con las tapas retiradas y con la superficie del agar mirando hacia abajo, en una
estufa regulada entre 25 °C y 50 °C, no se deben secar demasiado. Si se preparan con antelación,
las placas sin secar se pueden almacenar en la oscuridad en bolsas de plástico en una nevera a 3 °C
± 2 °C durante 2 semanas.
Reactivo o medio de cultivo: Agar nutritivo.
Ingredientes:
Ingredientes Extracto de carne Peptona Agar Agua

Cantidades 3.0 g 5.0 g 9.0 a 18.0 g 1 000 ml
Preparación: Se disuelven los constituyentes del medio completo deshidratado en el agua mediante
calentamiento si es necesario. Se ajusta el pH de manera que después de la esterilización sea de 7.1
± 0.2 a 25 °C . Se transfiere el medio a matraces o frascos de capacidad adecuada. Se esteriliza
durante 15 min en autoclave regulada a 121 °C.
111
Reactivo o medio de cultivo: Medio triptona / triptofano.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona Cloruro sódico D-L-Triptófano Agua

Cantidades 10.0 g 5.0 g 1.0 g 1 000 ml
Preparación: Se disuelven los constituyentes en el agua por ebullición si es necesario. Se ajusta el

pH de manera que después de la esterilización sea de 7.1 ± 0.2 a 25 °C. Se distribuye en cantidades
de 5 ml en tubos de ensayo o frascos. Se esteriliza durante 15 min en autoclave.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo de indol de Kovak.
Ingredientes:
p- 2-metil-1-butanol ó 1- Ácido
Ingredientes
dimetilaminobenzaldehído pentanol clorhídrico
Cantidades 5.0 g 75.0 ml 1 000 ml
Preparación: Se disuelve el p-dimetilaminobenzaldehido en el alcohol, calentando si es necesario

entre 44 °C y 47 °C. Se enfría a temperatura ambiente y se añade el ácido clorhídrico. Proteger de
la luz en frasco de vidrio marrón y almacenar a 3 °C ± 2 °C. El reactivo deberá ser amarillo claro o
marrón claro y libre de precipitado.
Reactivo o medio de cultivo: Tampón fosfato modificado, 0.01 mol/l, pH 7.2.
Ingredientes:
Monolaurato
Disodio Potasio de
Cloruro Cloruro hidrógeno dihidrógeno polioxietileno
Ingredientes Agua
sódico potásico fosfato fosfato sorbitán
(anhidro) (anhidro) (Tween 20
jarabe)
Cantidades 8.0 g 0.2 g 1.44 g 0.24 g 0.2 ml 1 000 ml
Preparación: Se disuelven los constituyentes en el agua por ebullición si es necesario. Se ajusta el

pH de manera que después de la esterilización sea de 7.1 ± 0.2 a 25 °C. Se distribuye en cantidades
de 5 ml en tubos de ensayo o frascos. Se esteriliza durante 15 min en autoclave. La disolución
puede parecer turbia pero se aclara tras mantenerla en reposo.
BS 5763: Part 10: 1993
Reactivo o medio de cultivo: Agar glutamato con modificación mineral.
Ingredientes:
112
Glutamato de L-ácido
Ingredientes Lactosa Formiato de sodio L-cistina L-arginina
sodio aspártico
Cantidades 6.35 g 10 g 0.25 g 0.02 g 0.02 g 0.024 g
Citrato de
Cloruro de Fosfato
Ácido Ácido Sulfato de hierro
Ingredientes calcio dipotásico de
nicotínico Pantoténico magnesio amoniacal
dihidratado hidrógeno
(III)
Ingredientes Cloruro de amonio Tiamina Agar Agua destilada

Cantidades 2.5 g 0.001 g 12 g a 18 g 1 000 ml
Preparación: Disolver el cloruro de amonio en el agua. Adicionar los otros componentes y disolver
por agitación y calentamiento. Ajustar el pH después de la esterilización a 6.7 ± 0.2 a 25 °C.
Transferir volúmenes de 100 ml del medio a envases adecuados y esterilizar en autoclave por 10
minutos a 115 °C. Adicionar a cajas Petri de 12 ml a 15 ml del medio estéril y enfriado a
aproximadamente 45 °C. Dejar solidificar.
Reactivo o medio de cultivo: Agar triptona y bilis.
Ingredientes:
Agua
Ingredientes Triptona Sales biliares Agar
destilada
Cantidades 20 g 1.5 g 12 g a 18 g 1 000 ml
Preparación: Disolver los componentes en el agua por calentamiento. Ajustar el pH después de la

esterilización a 7.2 ± 0.2 a 25 °C. Transferir volúmenes de 100 ml del medio a contenedores
adecuados y esterilizar el medio en autoclave por 15 minutos a 121 °C. Adicionar a cajas Petri
estériles de 12 ml a 15 ml del medio enfriado a 45 °C. Dejar solidificar y almacenar a 0 °C – 5 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base
Ingredientes:
Disolución
Extracto de
Extracto de Cloruro Agua
Ingredientes Triptona de sulfamezatina
carne Glicina de litio Agar destilada
levadura (solo de ser
necesario)
12 g
Cantidades 10 g 1g 5 g 12 g 5g a 20 1 000 ml 27.5 ml
g
113
Preparación: Disolver los componentes en el agua por calentamiento. Si es necesario, adicionar los
27.5 ml de la disolución de sulfamezatina (sulfamidina, INN). Ajustar el pH después de la
esterilización a 7.2 ± 0.2 a 25 °C. Transferir volúmenes de 90 ml del medio a frascos o botellas de
capacidad no mayor a 300 ml. Esterilizar el medio en autoclave por 15 minutos a 121 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de telurito
Ingredientes:
Disolución de telurito de
Ingredientes Agua destilada
potasio
Cantidades 1g 100 ml
Preparación: Disolver el telurito de potasio en el agua con mínimo calentamiento. Esterilizar por
filtración.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de sulfamezatina (sulfadimina, INN), solo en sospecha de

presencia de Proteus.
Ingredientes:
Disolución de
Ingredientes Sulfamezatina hidróxido de sodio Agua destilada
(0.1 mol/l)
Cantidades 0.2 g 10 ml 100 ml
Preparación: Disolver la sulfamezatina en la disolución de hidróxido de sodio. Llevar hasta un

volumen final de 100 ml con el agua destilada.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de piruvato de sodio.
Ingredientes:
Ingredientes Piruvato de sodio Agua destilada

Cantidades 20 g 100 ml
Preparación: Disolver el piruvato en el agua destilada. Filtrar
Reactivo o medio de cultivo: Emulsión yema de huevo.
Ingredientes:

114
Preparación: usar huevos frescos, separar las yemas de las claras. Mezclar las yemas
vigorosamente con 4 veces su volumen de agua. Calentar la mezcla en baño de agua, a temperatura
controlada de 45 °C, por 2 horas y dejar de 18 h a 24 h a 0 °C para permitir que se forme un
precipitado. Decantar el líquido supernadante y esterilizar por filtración, la emulsión debe ser
separada asépticamente. La emulsión debe almacenarse entre 0 °C -5 °C por no más de 72 h.
Reactivo o medio de cultivo: Medio completo.
Ingredientes:
Medio Disolución de piruvato Emulsión yema de Disolución de telurito de

Ingredientes
base de sodio huevo potasio
Cantidades 90 ml 5 ml 5 ml 1 ml
Preparación: Disolver el medio base y enfriar a aproximadamente 50 °C. Adicionar los otros
líquidos, mezclando bien después de cada adición. Distribuir de 15 ml a 20 ml del medio completo
en cajas Petri y dejar solidificar.
5763:Part 10:1993
Reactivo o medio de cultivo: Caldo glucosa bilis verde brillante tamponado (caldo E.E.).
Ingredientes:
Medio doble
Bilis Ox Verde
Ingredientes Peptona Glucosa Na2HPO4 KH2PO4 Agua destilada
deshidratada brillante
Cantidades 20 g 10 g 12.9 g 4g 40 g 0.03 g 1 000 ml
Medio simple
Bilis Ox Verde
Ingredientes Peptona Glucosa Na2HPO4 KH2PO4 Agua destilada
deshidratada brillante
Cantidades 10 g 5g 6.45 g 2g 20 g 0.015 g 1 000 ml
Preparación: Disolver los ingredientes en el agua destilada por medio de calentamiento. No

calentar el medio por más de 30 minutos. Enfriar el medio rápidamente. Ajustar el pH después del
calentamiento a 7.2 a 25 °C. Transferir porciones de 10 ml a tubos o botes estériles. El medio no
debe ser esterilizado en autoclave.
Reactivo o medio de cultivo: Agar glucosa bilis rojo violeta (VRBG) .
Ingredientes:
Extracto de Cloruro de Sales

Ingredientes Peptona Glucosa
levadura sodio biliares
Cantidades 7g 10 g 3g 5g 1.5 g
115
Ingredientes Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua destilada

Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada por medio de calentamiento. No

calentar el medio por más de 30 minutos. Ajustar el pH después del calentamiento a 7.2 a 25 °C.
Transferir el medio de cultivo a tubos, botellas o frascos estériles de capacidad no mayor a 500 ml.
El medio no debe ser esterilizado en autoclave. Preparar el medio justo antes de su uso. Preparación
en cajas Petri: distribuir aproximadamente 15 ml del medio de cultivo, enfriado a aproximadamente
a 45 °C, en cajas Petri y dejar solidificar.
Reactivo o medio de cultivo: Agar glucosa.
Ingredientes:
Extracto Cloruro
Púrpura de
Ingredientes Triptona Glucosa de de Agar Agua destilada
bromocresol
levadura sodio
8 g a 18
Cantidades 10 g 10 g 1.5 g 5g 0.015 g 1 000 ml
g
Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada por medio de calentamiento. Ajustar el
pH después de la esterilización a 7.0 a 25 °C. Distribuir 15 ml del medio de cultivo a tubos o
frascos. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121 °C. Colocar los tubos o frascos en posición
vertical.
Ingredientes:
Extracto de
Ingredientes Peptona Agar Agua destilada
carne
Cantidades 3g 5g 8 g a 18 g 1 000 ml
Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada por medio de calentamiento. Ajustar el
pH después de la esterilización a 7.0 a 25 °C. Trasferir el medio de cultivo a tubos, botellas o
frascos de capacidad no mayor a 500 ml. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121 °C. Preparación
en cajas Petri: distribuir aproximadamente 15 ml del medio de cultivo, enfriado a aproximadamente
45 °C, en cajas Petri y dejar solidificar.
BS 5763: Part 13: 1989
Ingredientes:
116
sodio aspártico
Citrato de
Cloruro de Fosfato
nicotínico pantoténico magnesio amoniacal
(III)
Preparación: Disolver el cloruro de amonio en el agua. Adicionar los otros componentes y disolver
por agitación y calentamiento. Ajustar el pH después de la esterilización a 6.7 ± 0.2 a 25 °C.
Transferir volúmenes de 100 ml del medio a envases adecuados y esterilizar en autoclave por 10
minutos a 115 °C. Adicionar a cajas Petri de 12 ml a 15 ml del medio estéril y enfriado a
aproximadamente 45 °C. Dejar solidificar.
Ingredientes:
Agua
destilada
Preparación: Disolver los componentes en el agua por calentamiento. Ajustar el pH después de la

esterilización a 7.2 ± 0.2 a 25 °C. Transferir volúmenes de 100 ml del medio a contenedores
adecuados y esterilizar el medio en autoclave por 15 minutos a 121 °C. Adicionar a cajas Petri
estériles de 12 ml a 15 ml del medio enfriado a 45 °C. Dejar solidificar y almacenar de 0 °C – 5 °C.
BAM Capítulo 4. Recuento de Escherichia coli y bacterias coliformes
Reactivo o medio de cultivo: Caldo lactosa bilis verde brillante.
Ingredientes:
117
Verde
Ingredientes Peptona Lactosa Sales biliares Agua
brillante
Cantidades 10.0 g 10.0 g 20.0 g 0.0133 g 1 000 ml
Preparación: Disolver la peptona y lactosa en 500 ml de agua destilada. Adicionar las sales biliares
a 200 ml de agua destilada. El pH de la disolución es aproximadamente de 7.0-7.5. Mezclar y añadir
agua hasta un volumen final de 975 ml. Ajustar el pH a 7.4. Adicionar 13.3 ml de verde brillante (1
%) disuelto en agua destilada. Añadir agua destilada hasta completar 1 000 ml. Distribuir el medio
en tubos. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 °C ± 1.0 °C. Las campanas de fermentación
no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.
Reactivo o Medio de cultivo: Caldo lauril sulfato triptosa (LST).
Ingredientes:
Lauril
Fosfato Fosfato Cloruro sulfato Agua
Ingredientes Triptosa Lactosa
dipotásico monopotásico de sodio de destilada
sodio
Cantidades 20.0 g 5.0 g 2.75 g 2.75 g 5.0 g 0.1 g 1 000 ml
Preparación: Disolver los componentes en 1 000 ml de agua. Distribuir en volúmenes de 10 ml en

tubos con dimensiones de 16 mm x 160 mm, cada tubo debe tener campana de fermentación.
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 °C ± 1.0 °C. pH final 6.8 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo EC.
Ingredientes:
Cloruro
Fosfato Fosfato Agua
Ingredientes Triptosa Sales biliares n° 3 de
dipotásico monopotásico destilada
sodio
Cantidades 20.0 g 1.5 g 4.0 g 1.5 g 5.0 g 1 000 ml
Preparación: Distribuir en volúmenes de 8 ml en tubos de dimensiones de 16 mm x 150 mm con

tubos de fermentación invertidos de 10 mm x 75 mm. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121
°C. pH final 6.9 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Levine de Eosin-Azul de metileno (L-EMB).
Ingredientes:
Azul de Agua
Ingredientes Peptona Lactosa K2HPO4 Agar Eosin Y
metileno destilada
118
Preparación: Disolver la peptona, el fosfato y el agar en el agua por ebullición si es necesario.

Añadir agua para obtener el volumen original. Distribuir en porciones de (100 o 200) ml y
esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 °C. pH final 7.1 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo triptona 1 %.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona Agua

Cantidades 10.0 g 1 000 ml
Preparación: Disolver y distribuir en cantidades de 5 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 125 mm

o 16 mm x 150 mm. Se esteriliza durante 15 min en autoclave a 121 °C. Ajustar el pH a 6.9 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo MR-VP.
Ingredientes:
Medio 1:
Fosfato
Ingredientes Peptona Glucosa dipotásico Agua destilada
(K2HPO4)
Medio 2:
Digerido
Digerido
enzimático de Fosfato de
Ingredientes pancreático Dextrosa Agua destilada
tejidos potasio
de caseína
animales
Medio 3:
Ingredientes Peptona Glucosa Buffer de fosfatos Agua destilada

Preparación: Disolver los ingredientes con calentamiento si es necesario. Distribuir en cantidades

de 10 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm, esterilizar en autoclave durante 15 min. Ajustar
el pH a 6.9 ± 0.2. Medio 3: Disolver los ingredientes en agua. Distribuir en cantidades de 10 ml en
tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm, esterilizar en autoclave durante 15 min. Ajustar el pH a 7.5 ±
0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo citrato de Koser.
119
Ingredientes:
NaNH4HPO4·4H2O Citrato de Agua

Ingredientes MgSO4·7H2O
(monobásico) sodio·2H2O destilada
Preparación: Distribuir en cantidades necesarias en tubos de rosca. Esterilizar en autoclave durante

15 min. Ajustar el pH a 6.7 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar recuento en placa.
Ingredientes:
Extracto de Agua
Ingredientes Triptona Dextrosa Agar
levadura destilada
Preparación: Calentar para disolver los ingredientes. Colocar el medio en tubos o frascos.
Esterilizar 15 min a 121 °C. pH final 7.0 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Amortiguador de fosfato.
Ingredientes:
Ingredientes KH2PO4 Agua destilada

Cantidades 34.0 g 500 ml
Preparación: Ajustar el pH a 7.2 con NaOH 1 N. Llevar el volumen a 1 litro con agua destilada.
Esterilizar 15 min a 121 °C. Almacenar en refrigeración.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo de indol de Kovak.
Ingredientes:
2-metil-1-butanol ó Ácido
Ingredientes p-dimetilaminobenzaldehído
1-pentanol clorhídrico
Preparación: Se disuelve el p-dimetilaminobenzaldehido en el alcohol, calentando si es necesario

entre 44 °C y 47 °C. Enfriar a temperatura ambiente y se añade el ácido clorhídrico.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para prueba Voges-Proskauer (VP)
Ingredientes:
Disolución 1:
Ingredientes α-Naftol 5 g Alcohol (absoluto)

120
Disolución 2:
Ingredientes Hidróxido de potasio Agua destilada

Preparación: Transferir 1 ml del cultivo de 48 h y añadir 0.6 ml de la disolución 1 y 0.2 ml de la

disolución 2. Agitar después de cada adición. Para intensificar y apresurar la reacción, añadir unos
cristales de creatina a la mezcla. Dejar a temperatura ambiente. Observar los resultados después de
4 h de adicionar los reactivos.
Reactivo o medio de cultivo: Cristal violeta de Hucker.
Ingredientes:
Disolución A:
Ingredientes Cristal violeta (90 %) Etanol (95 %)

Disolución B:
Ingredientes Oxalato de amonio Agua destilada

Preparación: Mezclar las soluciones A y B. Almacenar por 24 h y filtrar con papel filtro.
Reactivo o medio de cultivo: LUGOL.
Ingredientes:
Ingredientes Yodo Yoduro de potasio (KI) Agua destilada

Cantidades 1.0 g 2.0 g 300 ml
Preparación: Colocar el yoduro de potasio en el mortero, añadir el yodo, moler de 5 min a 10 min.
Añadir de manera espaciada 1 ml de agua, 5 ml de agua y 10 ml de agua, moler entre cada
aplicación. Verter esta disolución en una botella, lavar el mortero con el resto del agua destilada y
adicionar a la botella del reactivo.
Reactivo o medio de cultivo: Contraste de Hucker (disolución stock)
Ingredientes:
Ingredientes Safranina O Agua destilada

121
Preparación: Disolución de trabajo: añadir 10 ml de la disolución stock a 90 ml de agua destilada.
Reactivo o Medio de cultivo: Tinción de Gram.
Ingredientes: Cristal violeta, LUGOL y Contraste de Hucker.
Preparación: Transferir a una laminilla la muestra del cultivo. Pasar la laminilla por la flama varias
veces muy rápido y esperar que la muestra se seque. Añadir una gota de cristal violeta, esperar 1
min a que seque. Lavar con agua. Esperar a que se seque. Colocar una gota de LUGOL, dejar secar
y lavar con agua. Secar. Decolorar con etanol al 95 %. Lavar con agua. Dejar secar. Agregar una
gota de safranina, dejar secar aprox. 1 min, lavar con agua, secar nuevamente. Observar al
microscopio.
Reactivo o medio de cultivo: Indicador rojo de metilo.
Ingredientes:
Ingredientes Rojo de metilo Etanol al 95 % Agua destilada para un

Cantidades 0.10 g 300 ml volumen final de 500 ml
Preparación: Disolver el rojo de metilo en el etanol. Ajustar el volumen a 500 ml con agua
destilada.
Reactivo o medio de cultivo: Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (BRVA).
Ingredientes:
Extracto Cloruro
Sales Rojo Cristal Agua
Ingredientes Peptona de Lactosa de Agar
biliares neutro violeta destilada
levadura sodio
0.002 1 000
Cantidades 7.0 g 3.0 g 10.0 g 1.5 g 5.0 g 0.03 g 15.0 g
g ml
Preparación: Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos.
Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7.4. Calentar con agitación constante y hervir durante 2
minutos. No esterilizar. Antes de su uso enfriar el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45
°C.
Reactivo o medio de cultivo: Agar BRVA-MUG.
Ingredientes:
Ingredientes MUG Medio VRBA

Preparación: Añadir 0.1 g de MUG a los ingredientes de 1 litro de VRBA, continuar con el
procedimiento para VRBA.
122
Reactivo o Medio de cultivo: Medio EC-MUG.
Ingredientes:
Ingredientes MUG Caldo EC

Cantidades 50 mg 1 000 ml
Preparación: Preparar como el caldo EC, pero adicionar 50 mg de MUG por litro, antes de
esterilizar.
Reactivo o Medio de cultivo: Caldo lauril triptosa MUG (LST-MUG).
Ingredientes:
Lauril
Cloruro de Agua
Ingredientes Triptosa Lactosa K2HPO4 KH2PO4 sulfato MUG
sodio destilada
de sodio
50.0
mg
Preparación: Preparar el caldo lauril triptosa y añadir MUG. Disolver con agitación y
calentamiento si es necesario. Distribuir en porciones de 10 ml en tubos de ensayo de 20 mm x 150
mm con tubo de fermentación de 10 mm x 75 mm. Esterilizar 15 min a 121 °C. pH final 6.8 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Diluyente peptona.
Ingredientes:
Ingredientes Peptona Agua destilada

Preparación: Esterilizar 15 min a 121 °C. pH final 7.0 ± 0.2.
BAM: Capítulo 4A. Escherichia coli diarreogénica
Medio de cultivo: Caldo triptona fosfato (TP).
Ingredientes:
Polisorbato 80 Agua
Ingredientes Triptona K2HPO4 KH2PO4 NaCl
(Tween 80) destilada
Cantidades 20.0 g 2.0 g 2.0 g 5.0 g 1.5 ml 1L
Preparación: Disolver los constituyentes en el agua destilada, calentar si es necesario. Esterilizar

15 min a 121 °C. pH final , 7.0 ± 0.2.
123
Medio de cultivo: Caldo y agar infusión cerebro corazón (BHI).
Ingredientes:
Medio 1:
Peptona
Infusión Infusión
proteoso
de de 250 g Agua
Ingredientes (Difco) o NaCl Na2HPO4* Dextrosa
cerebro de corazón destilada
polipeptona
de ternera de res
(Bioquest)
Cantidades 200.0 g 2.0 g 10 g 5.0 g 2.5 g 2.0 g 1L
*Difco no especifica aguas de hidratación
Medio 2:
Digerido
Infusión Digerido Na2H
péptico de Agua
Ingredientes cerebro NaCl Dextrosa pancreático de PO4*
tejido destilada
corazón gelatina *
animal
Cantidades 6.0 g 6.0 g 5.0 g 3.0 g 14.5 g 2.5 g 1L
**BBL no especifica aguas de hidratación.
Preparación: Medio 1: Disolver los ingredientes del medio 1 en agua destilada con calentamiento
suave. Medio 2: Suspender los ingredientes del medio 2 en agua destilada y hervir durante 1 min
hasta disolver completamente. Para ambos medios 1 y 2, verter el caldo dentro de botellas o tubos
para su almacenamiento. Esterilizar 15 min a 121 °C. pH final , 7.4 ± 0.2. BHI comercial también es
aceptable. Para preparar el agar infusión cerebro corazón, adicionar 15 g de agar a 1 litro de caldo
BHI. Calentar hasta disolver el agar antes de verter en botellas o matraces. Esterilizar 15 min a 121
°C.
Medio de cultivo: Agar Levine de Eosin-Azul de metileno (L-EMB).
Ingredientes:
Azul de Agua
Ingredientes Peptona Lactosa K2HPO4 Agar Eosin Y
metileno destilada
Cantidades 10.0 g 10.0 g 2.0 g 15.0 g 0.4 g 0.065 g 1L
Preparación: Disolver la peptona, el fosfato y el agar en el agua por ebullición si es necesario.

Añadir agua para obtener el volumen original. Distribuir en porciones de (100 o 200) ml y
esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 °C. pH final 7.1 ± 0.2.
Medio de cultivo: Agar McConkey.
Ingredientes:
124
Sales
Peptona
biliares
proteos Peptona Agua
no. 3 o Rojo Cristal
Ingredientes ao o Lactosa NaCl Agar destil
mezcla de neutro violeta
polipep gelisado ada
sales
tona
biliares
Cantidades 3.0 g 17.0 g 10.0 g 1.5 g 5.0 g 0.03 g 0.001 g 13.5 g 1 L
Preparación: Suspender los ingredientes y calentar con agitación hasta disolver. Hervir por 1 min a
2 min. Esterilizar 15 min a 121 °C, enfriar a 45 °C -50 °C, y verter porciones de 20 ml dentro de
cajas Petri estériles de 15 mm x 100 mm. Secar a temperatura ambiente con la tapa cerrada. No usar
cajas húmedas. pH final , 7.1 ± 0.2.
Medio de cultivo: Agar triple azúcar hierro (agar TSI).
Ingredientes:
Medio 1:
Ingredientes Polipeptona NaCl Lactosa Sacarosa Glucosa

Cantidades 20.0 g 5.0 g 10.0 g 10.0 g 1.0 g
Agua
Ingredientes Fe(NH4)2(SO4)2 · 6H2O Na2S2O3 Rojo fenol Agar
destilada
Cantidades 0.2 g 0.2 g 0.025 g 13 g 1 000 ml
Medio 2:
Cloruro
Extracto de Extracto de Peptona
Ingredientes Peptona sódico Lactosa
carne levadura proteosa
(NaCl)
Sulfato Tiosulfato
Ingredientes Sacarosa Glucosa Rojo fenol Agar Agua
férrico sódico
Cantidades 10. 0 g 1.0 g 0.2 g 0.3 g 0.024 g 12.0 g 1 000 ml
Preparación: Puede utilizarse cualquiera de los dos medios. Medio 1: Se disuelven los
componentes o el medio completo deshidratado en el agua, calentando si fuera necesario. Se reparte
el medio en tubos de ensayo. Se esteriliza en autoclave regulado a 118 °C durante 15 min. pH 7.3 ±
0.2. Medio 2: se prepara de la misma manera que el medio 1 pero se esteriliza en autoclave
regulado a 121 °C durante 15 min. pH 7.4 ± 0.2.
Medio de cultivo: Agar sangre base (Agar infusión) BAB.
Ingredientes:
125
Infusión de
Ingredientes músculo de Triptona NaCl Agar Agua destilada
corazón
Cantidades 375 g 10.0 g 5.0 g 15.0 g 1L
Preparación: Calentar suavemente hasta disolver. Esterilizar 20 min a 121 °C. pH final, 7.3 ± 0.2.
También puede utilizarse agar de infusión de corazón deshidratado comercial.
Medio de cultivo: Caldo triptona (Triptófano), 1 %.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona o tripticasa Agua destilada

Cantidades 10.0 g 1L
Preparación: Disolver y verter porciones de 5 ml en tubos de ensayo de (16 x 125) mm o 16 mm x

150 mm. Esterilizar 15 min a 121°C. pH final, 6.9 ± 0.2.
Medio de cultivo: Caldo púrpura de bromocresol suplementado individualmente con 0.5 % (p/v) de
cada uno: glucosa, adonitol, celobiosa, sorbitol, arabinosa, manitol y lactosa.
Ingredientes:
Extracto de Púrpura de Agua

Ingredientes Peptona NaCl
carne de res bromocresol destilada
Cantidades 10.0 g 3.0 g 5.0 g 0.04 g 1L
Preparación: Verter porciones de 2.5 ml de disolución base dentro de tubos de ensayo de 13 mm x

100 mm conteniendo tubos de fermentación de 6 mm x 50 mm invertidos. Esterilizar 10 min a 121
°C. pH final, 7.0 ± 0.2. Esterilizar (en autoclave) por separado disoluciones madre de carbohidratos
(50 % p/v) o preferentemente por filtración (0.2 µm tamaño de poro). Adicionar 0.278 ml ± 0.002
ml de la disolución madre de carbohidratos a 2.5 ml de medio basal para dar una concentración final
de carbohidratos de 5 % p/v.
Medio de cultivo: Caldo urea.
Ingredientes:
Extracto de Agua
Ingredientes Urea Na2HPO4 KH2PO4 Rojo de fenol
levadura destilada
Cantidades 20.0 g 0.1 g 9.5 g 9.1 g 0.01 g 1L
Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada. No calentar. Esterilizar por filtración a
través de una membrana de 0.45 µm. Verter asépticamente porciones de 1.5 ml a 3.0 ml dentro de
tubos de ensayo de 13 mm x 100 mm. pH final, 6.8 ± 0.2.
Medio de cultivo: Caldo lisina descarboxilasa.
Ingredientes:
126

Ingredientes Peptona Glucosa L-lisina
levadura bromocresol destilada
Preparación: Calentar hasta disolver. Distribuir en porciones de 5 ml en tubos con tapón de rosca
de 16 mm x 125 mm. Autoclave 15 min a 121 °C. pH final 6.8 ± 0.2.
Medio de cultivo: Caldo cianuro de potasio (KCN).
Ingredientes:
Proteasa
Cianuro de
peptona N° 3 Agua
Ingredientes potasio NaCl KH2PO4 Na2HPO4
o destilada
(KCN)
polipeptona
Preparación: Disolver los ingredientes excepto el cianuro de potasio. Autoclave 15 min a 121 °C.
Enfriar y refrigerar entre 5 °C y 8 °C. pH final 7.6 ± 0.2. Preparar el KCN disolviendo 0.5 g de
KCN en 100 ml de agua destilada estéril y a una temperatura entre 5 °C y 8 °C. Pipetear 15 ml de la
disolución fría de KCN a 1 L del medio base estéril y frío. Mezclar y distribuir porciones de 1 ml
a1.5 ml en tubos de ensayo estériles. Utilizando una técnica aséptica tapar los tubos con tapones de
corcho impregnados con parafina. Almacenar los tubos a 5 °C a 8 °C. No pipetear con la boca.
Usar guantes. No almacenar por más de 2 semanas.
Medio de cultivo: Caldo MR-VP.
Ingredientes:
Medio 1:
Agua peptonada
Ingredientes amortiguada en Glucosa K2HP04 Agua destilada
polvo
Medio 2:
Digerido Digerido
Fosfato de
Ingredientes pancreático de péptico de Dextrosa Agua destilada
potasio
caseína tejido animal
Medio 3:
Amortiguador de
Ingredientes Peptona Glucosa Agua destilada
fosfato
127
Preparación: Medio 1 y 2: Disolver los ingredientes en agua con agitación y calentamiento

moderado. Distribuir porciones de 10 ml en tubos de 16 mm x 150 mm. Esterilizar en autoclave
durante 15 min a 118 °C a 121 °C. pH final 6.9 ± 0.2. Medio 3: Disolver los ingredientes en agua.
Verter 10 ml dentro de tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm y esterilizar 15 min a 121 °C. pH final,
7.5 ± 0.2.
Medio de cultivo: Medio indol nitrito (Nitrato tríptico).
Ingredientes:
Agua
Ingredientes Tripticasa Na2HPO4 Dextrosa KNO3 Agar
destilada
Cantidades 20.0 g 2.0 g 1.0 g 1.0 g 1.0 g 1.0 L
Preparación: Calentar con agitación suave. Mezclar y verter porciones de 11 ml dentro de tubos de
16 mm x 150 mm. Esterilizar 15 min a 118 °C. pH final, 7.2 ± 0.2.
Medio de cultivo: Agar acetato.
Ingredientes:
Fosfato
Acetato MgSO4 Azul de Agua
Ingredientes NaCl de K2HPO4 Agar
de sodio (anhidro) bromotimol destilada
amonio
Cantidades 2.0 g 5.0 g 0.2 g 1.0 g 1.0 g 0.08 g 20.0 g 1.0 L
Preparación: Adicionar todos los ingredientes excepto MgSO4 a 1 litro de agua destilada. Calentar
a ebullición con agitación. Adicionar MgSO4 y ajustar el pH. Verter porciones de 8 ml dentro de
tubos de 16 mm x 150 mm. Esterilizar 15 min a 121°C. Inclinar los tubos para obtener inclinación
de 5 cm. pH final, 6.7.
Medio de cultivo: Caldo mucato.
Ingredientes:
Azul de
Ingredientes Peptona Ácido múcico Agua destilada
bromotimol
Cantidades 10.0 g 10.0 g 0.024 g 1.0 L
Preparación: Disolver la peptona. Disolver el ácido múcico añadiendo lentamente NaOH 5 N y

agitando. Verter porciones de 5 ml dentro de tubos con tapón de rosca de 13 mm x 100 mm.
Esterilizar 10 min a 121 °C. pH final, 7.4 ± 0.1.
Medio de cultivo: Caldo control mucato.
Ingredientes:
128
Ingredientes Peptona Azul de bromotimol Agua destilada

Cantidades 10.0 g 0.024 g 1.0 L
Preparación: Disolver los ingredientes. Verter porciones de 5 ml dentro de tubos de tapón de rosca
de 13 mm x 100 mm. Esterilizar 10 min a 121 °C. pH final, 7.4 ± 0.1.
Medio de cultivo: Caldo malonato.
Ingredientes:
Extracto de
Ingredientes (NH4)2SO4 K2HPO4 KH2PO4 NaCl
levadura
Malonato de sodio Glucosa Azul de bromotimol Agua destilada

3.0 g 0.25 g 0.025 g 1.0 L
Preparación: Disolver, calentando si es necesario. Verter porciones de 3 ml dentro de tubos de
ensayo de 13 mm x 100 mm. Esterilizar 15 min a 121 °C. pH final, 6.7 ± 0.2.
Medio de cultivo: Caldo citrato de Koser.
Ingredientes:
KH2PO4 Citrato de Agua

Ingredientes NaNH4HPO4·4H2O MgSO4·7H2O
(monobásico) sodio·2H2O destilada
Cantidades 1.5 g 1.0 g 0.2 g 3.0 g 1.0 L
Preparación: Verter dentro de tubos de tapón de rosca como se desee. Esterilizar 15 min a 121 °C.
pH final, 6.7 ± 0.2. Esta formulación se enlista en los métodos oficiales de análisis de la AOAC
Internacional y los métodos estándar para la examinación de aguas residuales de la APHA. La
composición difiere del medio deshidratado comercial. Este último es satisfactorio.
Medio de cultivo: Disolución de bicarbonato de sodio 10 %.
Ingredientes:
Ingredientes Bicarbonato de sodio Agua destilada para aforar

Cantidades 100.0 g 1L
Preparación: No se especifica la preparación.
Medio de cultivo: Prueba de ONPG.
Disolución de fosfato monosódico 1.0 M pH 7:
Disolución NaOH
Ingredientes NaH2PO4·H20 Agua destilada
30 % (p/v)
129
Cantidades 6.9 g 45.0 ml 3.0 ml
0.0133 M o-Nitrofenil-D-galactósido (ONPG):
Disolución de fosfato
Ingredientes ONPG Agua destilada a 37 °C
monosodico 1.0 M pH 7
Cantidades 80.0 mg 15.0 ml 5.0 ml
Preparación: Disolución de fosfato monosódico 1.0 M pH 7: Disolver el NaH2PO4·H2O en agua

destilada. Adicionar la disolución de 30 % NaOH y ajustar a pH 7. Aforar a 50 ml con agua
destilada y almacenar en refrigeración (alrededor de 4 °C). 0.0133 M o-Nitrofenil-D-galactosido
(ONPG): Disolver el ONPG en agua destilada a 37 °C. Adicionar la disolución 1.0 M de NaH2PO4.
La disolución no debe tener color. Almacenar en refrigeración (alrededor de 4 °C). Calentar una
porción suficiente para el número de pruebas a 37 °C antes de usar.
Medio de cultivo: Amortiguador salino de fosfatos 0.01 M (pH 7.5).
Ingredientes:
Disolución madre (Stock, 0.1 M):
NaH2PO4
Ingredientes NaH2PO4 · H20 NaCl Agua destilada
(anhidro)
Cantidades 12.0 g 2.2 g 85.0 g 1.0 L
Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada y aforar a 1 litro. Diluir la disolución
madre 19 en agua doble destilada. Mezclar bien. Ajustar pH a 7.5 con HCl 0.1 N o NaOH 0.1 N si
es necesario. Se encuentra disponible comercialmente en Difco Laboratories y BBL en su forma
deshidratada.
Medio de cultivo: Agua de dilución amortiguador de fosfatos de Butterfield.
Ingredientes:

Preparación: Ajustar pH a 7.2 con NaOH 1 N. Aforar a 1 litro con agua destilada. Esterilizar 15
min a 121 °C. Almacenar en refrigeración. Blancos de dilución: Tomar 1.25 ml de la disolución
madre descrita anteriormente y aforar a 1 litro con agua destilada. Verter dentro de frascos a 90 ml
o 99 ml ± 1 ml. Esterilizar 15 min a 121 °C.
Medio de cultivo: Reactivo de Kovacs.
Ingredientes:
Alcohol amílico
Ingredientes p-Dimetilaminobenzaldehído HCl (concentrado)
(normal)
130
Preparación: Disolver el p-dimetilaminobenzaldehido en alcohol amílico normal. Lentamente

adicionar HCl. Almacenar a 4 °C. Para la prueba de indol, adicionar de 0.2 ml a 0.3 ml del reactivo
a 5 ml de un cultivo de 24 h en caldo triptona. Una capa color rojo oscuro en la superficie es una
prueba positiva para la prueba de indol.
Medio de cultivo: Reactivos para prueba Voges-Proskauer (VP).
Ingredientes:
Disolución 1:
Ingredientes α-Naftol Alcohol (absoluto)

Disolución 2:

Preparación: Transferir 1 ml del cultivo de 48 h y añadir 0.6 ml de la disolución 1 y 0.2 ml de la

disolución 2. Agitar después de cada adición. Para intensificar y apresurar la reacción, añadir unos
cristales de creatina a la mezcla. Dejar a temperatura ambiente. Observar los resultados después de
4 h de adicionar los reactivos.
Medio de cultivo: Reactivo para oxidasa.
Ingredientes:
Ingredientes N,N,N',N'-Tetrametil-p-fenilenediaminea2HCl Agua destilada

Preparación: Usar un preparado fresco, sin embargo, el reactivo puede ser usado hasta por 7 días,
si es almacenado en un frasco de vidrio oscuro en refrigeración. Aplicar la disolución recientemente
preparada (fresca) directamente a un cultivo joven (24 h) en cajas Petri o tubos inclinados. Las
colonias oxidasa-positivas desarrollan un color rosa que progresivamente se torna púrpura oscuro.
Transferir las colonias fuera del reactivo dentro de 3 min, si es que los cultivos se van a conservar
debido a que el reactivo es tóxico para los organismos. Método opcional: Transferir una pequeña
cantidad de cultivo a un papel filtro impregnado con el reactivo. Un color púrpura oscuro dentro de
10 s indica una prueba positiva. Usar un asa de platino, un aplicador de madera o un palillo estéril
debido a que las asas que contienen hierro (ejem. asa de nicromo) dan reacciones falso positivas.
Alternativamente, la prueba se puede hacer con una disolución al 1 % de hidroclórido de N,N-
dimetil-p-fenilenediamina. Aplicar la disolución directamente al cultivo en caja o tubo inclinado.
Medio de cultivo: Reactivos para detección de nitritos.
131
Ingredientes:
Reactivo ácido sulfanílico:
Ingredientes Ácido sulfanílico Ácido acético 5 N

Cantidades 1.0 g 125.0 ml
Reactivo N-(1-naftil) etilendiamina:
N-(1-naftil) etilendiamina
Ingredientes Ácido acético 5 N
dihidrocloruro
Reactivo α-Naftol:
Ingredientes α-Naftol Ácido acético 5 N

Reactivos alternativos para la prueba: El ácido sulfónico 5-Amino-2-naftileno (Ácido de Cleve) y

N,N-dimetil- 1-naftilamina han sido recomendados como sustitutos para la preparación del reactivo
B. Etanol absoluto puede ser sustituido por ácido acético en el reactivo C. Sin embargo, se deberán
realizar evaluaciones comparativas antes de sustituir los reactivos originales.
Preparación: Para preparar el ácido acético 5 N, adicionar 28.75 ml de ácido acético glaciar a
71.25 ml de agua destilada. Almacenar los reactivos en frascos color ámbar. Para realizar la prueba
adicionar de 0.1 ml -0.5 ml de los reactivos A y reactivos B o reactivos C (según lo descrito en el
método) a un cultivo en medio líquido o semisólido. El desarrollo de un color rojo-violeta con los
reactivos A y B o un color naranja con los reactivos A y C indica que el nitrato ha sido reducido a
nitrito. Debido a que el color producido por los reactivos A y B puede desvanecerse o desaparecer
en muy pocos minutos la reacción debe registrarse tan pronto como el color aparezca. Si no se
desarrolla color, la prueba de presencia de nitrato por la adición de una pequeña cantidad de polvo
de zinc. Si se desarrolla color, el nitrato no ha sido reducido. Prueba de reducción del nitrato para E.
coli enteropatogénica. Para 3 ml de un cultivo de 18 h -24 h en medio indol-nitrito, adicionar 2
gotas de los reactivos A y B. Un color rojo-violeta indica que el nitrato ha sido reducido a nitrito.
Revisar las pruebas negativas añadiendo pequeñas cantidades de polvo de zinc; si el color rojo-
violeta no aparece, el nitrato ha sido reducido.
Medio de cultivo: Aceite mineral.
Preparación: Esterilizar 30 min a 121 °C. Usar contenedores con tapón de rosca a la mitad de su
capacidad con 20 ml-50 ml.
Medio de cultivo: Cristal violeta de Hucker.
Ingredientes:
Disolución A:
132
Ingredientes Cristal violeta (90 %) Etanol (95 %)

Disolución B:
Ingredientes Oxalato de amonio Agua destilada

Preparación: Mezclar las disoluciones A y B. Almacenar por 24 h y filtrar con papel filtro.
Medio de cultivo: LUGOL.
Ingredientes:
Ingredientes Yodo Yoduro de potasio (KI) Agua destilada

Preparación: Colocar el yoduro de potasio en el mortero, añadir el yodo, moler por 5 min a 10
min. Añadir de manera espaciada 1 ml de agua, 5 ml de agua y 10 ml de agua, moler entre cada
aplicación. Verter esta disolución en una botella, lavar el mortero con el resto del agua destilada y
adicionar a la botella del reactivo.
Medio de cultivo: Contraste de Hucker (disolución stock).
Ingredientes:
Ingredientes Safranina O Agua destilada

Preparación: Disolución de trabajo: añadir 10 ml de la disolución stock a 90 ml de agua destilada.
Medio de cultivo: Tinción de Gram.
Ingredientes: Cristal violeta, LUGOL y contraste de Hucker
Preparación: Transferir a una laminilla la muestra del cultivo, pasar la laminilla por la flama varias
veces de manera rápida y esperar que la muestra se seque, añadir una gota de cristal violeta, esperar
1 min a que seque, lavar con agua, esperar a que se seque, colocar una gota de LUGOL, dejar secar
y lavar con agua, secar, decolorar con etanol al 95 %, lavar con agua, dejar secar, agregar una gota
de safranina, dejar secar aprox. 1 min, lavar con agua, secar nuevamente, observar al microscopio.
Reactivo o medio de cultivo: Agua peptonada amortiguada con piruvato (mBPWp) (M192a).
Ingredientes:
Ingredientes Peptona NaCl Na2HPO4 Casaminoácidos

Cantidades 10.0 g 5.0 g 3.6 g 5.0 g
133
Extracto de
Ingredientes Lactosa Piruvato de sodio Agua destilada
levadura
Preparación: Esterilizar en autoclave. pH 7.2 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Suplemento de acriflavina-Cefsulodina-Vancomicina (ACV)

(M192a).
Ingredientes:
Ingredientes Acriflavina Cefsulodina Vancomicina Agua destilada

Cantidades 1.1250 g 1.125 g 0.9 g 500.0 ml
Preparación: Disolver cada uno de los suplementos en 500 ml de agua destilada. Esterilizar por
filtración. Añadir 1 ml de cada uno a 225 ml de mBPWp.
Reactivo o medio de cultivo: Oligonucleótidos iniciadores y para STEC/O157 específicos para la

plataforma de PCR en tiempo real (Tabla 20).
Ingredientes:
Tabla 20. Secuencias de oligo/sonda para su uso en la plataforma SmartCycler II y

LightCycler 2.0.
Oligos1 GenBank # Bases 5' → 3' Secuencia

gTg gCA TTA ATA CTg AAT TgT CAT CA
Stx1F934 M19473 26
Stx1R1042 M19473 21 gCg TAA TCC CAC ggA CTC TTC
gAT gTT TAT ggC ggT TTT ATT TgC
Stx2F1218 X07865 24
Tgg AAA ACT CAA TTT TAC CTT Tag CA
Stx2R1300 X07865 26
UidAF241 AF305917 21 CAg TCT ggA TCg CgA AAA CTg
ACC AgA CgT TgC CCA CAT AAT T
UidAR383 AF305917 22
IAC55F2 17 ATg ggT gCC gTT CgA gc
2 Cga gaC gAT gCa gCC aTT C
IAC186R 19
uidA F 241 AF305917 21 CAg TCT ggA TCg CgA AAA CTg
Secuencias de los oligos y sondas para su uso en la plataforma LightCycler 2.0.
Oligos1 GenBank # Bases 5' → 3' Secuencia
ACC AgA CgT TgC CCA CAT AAT T
uidA R 383 AF305917 22
stx1 F 406 M19573 25 gAg gAA ggg Cgg TTT AAT AAT CTA C
CAC TAT gCg ACA TTA AAT CCA gAT AAg
stx1 R 667 M19573 27
134
gTT TTg ACC ATC TTC gTC TgA TTA TTg A

stx2 F 492 X07865 28
ACT CCA TTA ACg CCA gAT ATg A
stx2 R 737 X07865 22
1 Nombre de oligo compuesto por gen de interés (stx1, stx2 o uidA), oligo directo (F), oligo reverso
(R), posición de la base 5' del oligonucleótido en la respectiva secuencia del gen especificada en la
columna 2
2 Los oligos y sondas para control interno de amplificación (IAC) están cubiertos por U.S. Patent
Application 0060166232.
Preparación: Disolución de trabajo para oligos iniciadores 10 µM de cada oligo listado en a tabla
20. La disolución de trabajo puede prepararse rehidratando los oligos sintetizados comercialmente
con purificación básica de desalado (Fisher/Genosys o equivalente) con agua destilada a la
concentración apropiada. Almacenar de -20 °C a -70 °C en un congelador sin escarcha.
Reactivo o medio de cultivo: OmniMix-HS o SmartMix HM reactivos de esferas para PCR

(Cepheid o Fisher).
Reactivo o medio de cultivo: Agar MacConkey telurito cefixima-sorbitol (TC-SMAC) (M194).
Ingredientes:
Ingredientes Telurito de potasio Cefixima

Cantidades 2.5 mg/L 0.05 mg/L
Preparación: Preparar Agar MacConkey sorbitol (SMAC) (M139) como se indicó anteriormente.
Después de esterilizar y temperar añadir los 2 aditivos, 250 µL de una disolución 1 % de telurito de
potasio y 1 mL de una disolución 50 mg/L de cefixima en 95 % EtOH . Esterilizar por filtración.
Reactivo o medio de cultivo: Agar cromogénico selectivo agar E. coli O157:H7 R&F® agar (R&F
Laboratories, Downers Grove, IL).
Preparación: Preparar de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Rainbow® O157 (BIOLOG, Hayward, CA).
Preparación: Preparar de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Levin azul de eosin-metileno (L-EMB) (M80).
Ingredientes:
Azul de Agua
Ingredientes Peptona Lactosa K2HPO4 Agar Eosina
metileno destilada
Preparación: Hervir para disolver la peptona, el fosfato, y el agar en 1 litro de agua, añadir agua
para completar el volumen original, distribuir en porciones de 100 ml o 200 ml cada vez y
135
esterilizar en autoclave 15 minutos a no más de 121 ºC. Antes de su uso, añadir a cada porción de
100 ml: 5 ml de disolución estéril de lactosa al 20 %; 2 ml de disolución acuosa de eosina al 2 % y
4.3 ml de disolución acuosa de azul de metileno al 0.15 %; cuando se usa el producto deshidratado
completo, hervir para disolver todos los ingredientes en un litro de agua, distribuir porciones de 100
ml o 200 ml. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C. El pH final es de 7.1 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar tripticasa de soya con extracto de levadura (TSAYE) (M153).
Ingredientes:
Agar soya
Ingredientes Extracto de levadura Agua destilada
tripticaseína
Cantidades 40.0 g 6.0 g 1 000 ml
Preparación: Pesar los ingredientes, adicionar agua y mezclar, esterilizar en autoclave por 15 min a
121 °C. pH final 7.3 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Amortiguador de fosfato Butterfield (R11).
Ingredientes:

Preparación: Ajustar el pH a 7.2 con NaOH 0.1 N, ajustar el volumen a 1 litro con agua destilada,
esterilizar por 15 min a 121 °C, almacenar en refrigeración, dilución de los blancos, tomar 1.25 ml
de la disolución madre anterior y ajustar el volumen a 1 litro con agua destilada, distribuir en
botellas de 90 ml o 99 ml ± 1 ml, esterilizar por 15 minutos a 121 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución fisiológica salina (0.85 % NaCl).
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo de Kovacs (R38).
Ingredientes:
ρ-
Ingredientes Alcohol amílico HCl (concentrado)
dimetilaminobenzaldehido
Preparación: Disolver el ρ-dimetilaminobenzaldehido en alcohol amílico, lentamente adicionar

HCl, almacenar a 4 °C, para la prueba de indol, adicionar 0.2 ml a 0.3 ml del reactivo a 5 ml de
cultivo bacteriano de 24 h en caldo triptona.
Reactivo o medio de cultivo: ColiComplete Discs – conteniendo substrato MUG fluorogénico para
GUD y X-gal cromogénico para GAL (BioControl, Bellevue, WA).
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo latex Anti-O157 y anti-H7 (Remel, Lenexa, KS, o
equivalente).
Reactivo o medio de cultivo: API20E o VITEK GNI (BioMerieux, St. Louis, MO).
136
ISO 7251:2005 (E)
Medio de cultivo: Caldo lauril sulfato.
Ingredientes:
Digerido
enzimático Lauril
Agua
Ingredientes de tejidos Lactosa K2HPO4 KH2PO4 NaCl sulfato de
destilada
de plantas sodio
o animales
Cantidades
simple)
1 000 ml
Cantidades
doble)
Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada, calentar si es necesario, ajustar el pH

a 6.8 ± 0.2. Para el caso de medio de concentración simple, distribuir 9 ml de medio en tubos de
ensayo de 16 mm x 160 mm con campana Durham, para el medio de concentración doble, distribuir
10 ml de medio en tubos de ensayo de 18 mm x 180 mm o 20 mm x 200 mm con campana Durham.
Esterilizar por 15 min a 121 °C.
Medio de cultivo: Caldo EC.
Ingredientes:
Digerido Sales
Agua
Ingredientes enzimático Lactosa biliares No. K2HPO4 KH2PO4 NaCl
destilada
de caseína 3

a 6.8 ± 0.2, distribuir el medio en cantidades de 10 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 160 mm con
campana Durham, esterilizar por 15 min en autoclave a 121 °C. La campana Durham no debe tener
burbujas de aire después de la esterilización.
Medio de cultivo: Agua peptonada libre de indol.
Ingredientes:
Digerido enzimático de
Ingredientes NaCl Agua destilada
caseína
137

a 7.3 ± 0.2, distribuir el medio en cantidades de 5 ml o 10 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 160
mm, esterilizar por 15 min en autoclave a 121 °C.
Ingredientes:
Ingredientes 4-Dimetilaminobenzaldehido Ácido clorhídrico 2-Metilbutan-1-ol o pentan-1-ol

Preparación: Disolver el 4-dimetilaminobenzaldehido en el alcohol calentando lentamente por

medio de baño María mantenido entre 50 °C y 55 °C. Enfriar y añadir el ácido, proteger de la luz y
almacenar a aproximadamente 4 °C.
4.2 Listeria spp. y L. monocytogenes
NOM-143-SSA1-1995
Reactivo o medio de cultivo: Caldo soya tripticaseina con 0.6 % de extracto de levadura
(CSTEL).
Ingredientes:
Ingredientes Caldo soya tripticaseina Extracto de levadura Agua

Preparación: Agitar hasta disolver los ingredientes,esterilizar a 121 ºC ± 1 ºC durante 15 min, el

pH final de la disolución debe ser 7.3 ± 0.2, un litro de caldo soya tripticaseina con extracto de
levadura (CSTEL) debe contener caldo de enriquecimiento.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de enriquecimiento (EB) pH 7.3.
Ingredientes:
Ácido
Clorhidrato Ácido pirúvico (sal sódica) disolución
Ingredientes nalidíxico Cicloheximida
de acriflavina al 10 % (p/v)
(sal sódica)
Cantidades 15.0 mg 40.0 mg 50 mg 11.1 mL
Preparación: Preparar los suplementos de acriflavina y nalidíxico a partir de una disolución al 0.5
% (p/v) con agua, el suplemento de cicloheximida prepararlo como una disolución al 1.0 % (p/v) en
una disolución al 40 % (v/v) de etanol en agua, esterilizar por filtración los suplementos, agregar en
condiciones asépticas los suplementos al medio CSTEL previamente esterilizado, justo antes de su
138
uso. Para la preparación de un litro del medio CSTEL se debe partir de las soluciones anteriores,
agregando las siguientes cantidades: 3.0 ml de acriflavina, 8.0 ml de ácido nalidíxico y 5.0 ml de
disolución de cicloheximida. La cicloheximida es una sustancia química altamente tóxica, durante
su manejo deben emplearse guantes, lentes de protección y lavarse las manos inmediatamente
después de usarla. * Utilizar ácido pirúvico solamente cuando se sospeche que las células de
Listeria estén dañadas.
Reactivo o medio de cultivo: Medio de cloruro de litio feniletanol-moxolactam (LMP).
Ingredientes:
Disolución de
Agar fenil Glicina moxolactam al 1 % en
Ingredientes Cloruro de litio Agua
etanol anhidra amortiguador de fosfatos
pH 6.0
Cantidades 35.5 g 10.0 g 5.0 g 2.0 ml 1 000 ml
Preparación: Esterilizar el medio (sin moxolactam) en autoclave a 121 ºC ± 1 °C durante 15 min,

enfriar de 48 ºC a 50 °C y agregar la disolución de moxolactam previamente esterilizada por
filtración, distribuir volúmenes de 12 ml a 15 ml del medio en cajas de Petri estériles, las placas
delgadas facilitan la observación de las colonias.
Reactivo o Medio de cultivo: Medio Oxford.
Ingredientes:
Un litro de medio Oxford debe contener los siguientes suplementos:
Sulfato de
Ingredientes Cicloheximida Acriflavina Cefotetán Fosfomicina
colistina
Cantidades 400 mg 20.0 mg 5.0 mg 2.0 mg 10 mg
Preparación: Disolver la cicloheximida, el sulfato de colestina, acriflavina, cefotetán y la

fosfomicina en 10 ml de una mezcla 1:1 de etanol: agua, esterilizar por filtración antes de agregar al
medio base, mezclar y vaciar en cajas Petri estériles, las placas del medio Oxford se pueden
almacenar como máximo dos semanas.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base Oxford (OXA).
Ingredientes:
Base de agar Citrato férrico

Ingredientes Esculina Cloruro de litio Agua
Columbia amónico
Preparación: Agregar los ingredientes a un litro de agua y llevar a ebullición hasta disolución
completa, esterilizar en autoclave a 121 ºC ± 1 ºC durante 15 min, enfriar a 50 ºC el medio base y en
condiciones asépticas agregar los suplementos.
139
Reactivo o medio de cultivo: Agar soya tripticaseína con 0.6 % de extracto de levadura (ASTEL).
Ingredientes:
Ingredientes Agar soya tripticaseína Extracto de levadura Agua

Preparación: Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar, esterilizar a 121 ºC ± 1 °C

durante 15 min, pH final de 7.3 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar sangre de carnero.
Ingredientes:
Ingredientes Base de agar sangre Sangre de carnero desfibrinada

Cantidades 95.0 ml 5.0 ml
Preparación: Preparar el agar base de acuerdo a las instrucciones del fabricante, enfriar a 45 ºC ± 2
ºC y agregar asépticamente la sangre de carnero, la cual previamente se debe encontrar a
temperatura ambiente (20 – 25 ) °C, homogeneizar el medio y verter en las cajas Petri estériles de
12 ml a 15 ml para la prueba de CAMP y de 15 ml a 20 ml para la prueba de hemólisis.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo nitritos.
Ingredientes:
Ingredientes Nitrato de potasio Cloruro de sodio Peptona Agua

Preparación: Agregar los ingredientes a un litro de agua, agitar hasta disolución completa, verter
en tubos de 13 mm x 100 mm con tapón de rosca, esterilizar en autoclave a 121 ºC ± 1 °C durante
15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Medio de SIM.
Ingredientes:
Sulfato de
Peptona de Peptona de Tiosulfato
Ingredientes fierro y Agar Agua
caseína carne de sodio
amonio
Preparación: Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar, envasar en porciones de 4 ml en

tubos de 13 mm x 100 mm, esterilizar en autoclave a 121 ºC ± 1 °C durante 15 min, pH final de 7.3
± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Medio MTM.
140
Ingredientes:
Cloruro de sodio
(NaCl)

tubos de 13 mm x 100 mm, esterilizar en autoclave a 121 ºC ± 1 °C durante 15 min, pH final de 7.4
± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo púrpura para fermentación de carbohidratos.
Ingredientes:
Proteosa Cloruro Extracto de Púrpura de

Ingredientes Agua
peptona No. 3 de sodio carne bromocresol
Preparación: Calentar si es necesario para disolver los ingredientes, esterilizar en autoclave

durante 15 min. a 121 ºC ± 1 °C, pH final 6.8 ± 0.2, agregar la disolución del carbohidrato,
previamente esterilizada, por filtración en cantidad suficiente para obtener una concentración final
de 0.5 %.
UNE-EN ISO 11290-1:1997
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de Fraser de concentración media.
Ingredientes:
Sal sódica
Disolución de Clorhidrato de Citrato amónico de
Ingredientes Base del ácido
cloruro de litio acriflavina hierro
nalidíxico
Cantidades 100 ml 1 ml 0.1 ml 0.5 ml 1.0 ml
Preparación: Inmediatamente antes de su uso, añadir las cuatro disoluciones a cada porción de 100
ml de la base.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base (Caldo Fraser).
Ingredientes:
Peptona de carne
Triptona (digestato
Ingredientes (digestato péptico de Extracto de carne Cloruro de sodio
péptico de caseína)
tejido animal)
141
Fosfato de hidrógeno disódico Fosfato de hidrógeno

Esculina Agua
dihidratado potásico
12.0 g 1.3 g 1.0 g 1 000 ml
Preparación: Disolver los componentes calentando si es necesario, ajustar el pH después de la

esterilización a 7.2 ± 0.2 a 25 °C, dispensar en frascos, esterilizar durante 15 min en autoclave a 121
°C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de cloruro de litio.
Ingredientes:
Ingredientes Cloruro de litio Agua

Preparación: Añadir el cloruro de litio al agua, esterilizar por filtración.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de la sal sódica de ácido nalidíxico.
Ingredientes:
Ingredientes Sal sódica del ácido nalidíxico Disolución de hidróxido sódico 0.05 mol/l
Preparación: Disolver la sal del ácido nalidixico en el hidróxido sódico y esterilizar por filtración.
Reactivo o Medio de cultivo: Disolución de hidrocloruro de acriflavina.
Ingredientes:
Ingredientes Clorhidrato de acriflavina Agua

Preparación: Disolver el hidrocloruro de acriflavina en el agua y esterilizar por filtración.
Reactivo o Medio de cultivo: Disolución de citrato amónico de hierro (III).
Ingredientes:
Ingredientes Citrato amónico de hierro (III) Agua

Preparación: Disolver el citrato amónico de hierro (III) en el agua y esterilizar por filtración.
Reactivo o Medio de cultivo: Caldo Fraser.
Ingredientes:
142
Disolución de clorhidrato de Disolución de citrato amónico de

Ingredientes Medio base
acriflavina hierro (II)
Cantidades 10 ml 0.1 ml 0.1 ml
Preparación: Inmediatamente antes de su uso añadir 0.1 ml de las soluciones a cada tubo con 10
ml de medio base, mezclar agitando con suavidad, ajustar el pH después de la esterilización a 7.2 ±
0.2 a 25 °C.
Reactivo o Medio de cultivo: Medio base (Caldo Fraser).
Ingredientes:
Peptona de
carne Triptona Fosfato de
(digestato (digestato Extracto de Extracto de Cloruro hidrógeno
Ingredientes
péptico de péptico de carne levadura sódico disódico
tejido caseína) dihidratado
animal)
Fosfato de Sal sódica de

Cloruro de
Ingredientes hidrógeno Esculina ácido Agua
litio
potásico nalidíxico

esterilización a 7.2 ± 0.2 a 25 °C, dispensar en tubos, esterilizar durante 15 min en autoclave a 121
°C.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Oxford.
Ingredientes: Medio base, suplementos.
Preparación: Enfriar la base hasta 47 °C y añadir asépticamente el suplemento, dispensar

cantidades de 5 ml del medio en placas Petri estériles y dejar solidificar, almacenar el medio
protegido de la luz.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base (Agar Oxford).
Ingredientes:
Agar Citrato amónico de Cloruro de

Ingredientes Esculina Agua
Columbia hierro (III) litio
143
Preparación: Disolver los componentes en agua por ebullición, ajustar el pH después de la

°C. *Agar Columbia: Almidón 1 g, proteosa peptona 23 g, cloruro sódico 5 g, agar de 9 g a 18 g.
Reactivo o medio de cultivo: Suplemento para un medio de 1 000 ml (Agar Oxford).
Ingredientes:
Clorhidrat
Ciclohexim Sulfato de Fosfomici
Ingredientes o de Cefotetan Etanol Agua
ida colistina na
acriflavina
Cantidades 400 mg 20.0 mg 5.0 mg 2.0 mg 10 mg 5 ml 5 ml
Preparación: Disolver los componentes en la mezcla etanol/agua, esterilizar por filtración.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Palcam - medio base.
Ingredientes:
Cloruro de Extracto de
Ingredientes Peptonas Almidón Agar D-glucosa
sodio levadura
9.0 g a
18.0 g
Citrato
Cloruro de
Ingredientes D-manitol Esculina amónico de Rojo de fenol Agua
litio
hierro (III)
Cantidades 10.0 g 0.8 g 0.5 g 0.08 g 15.0 g 960 ml

°C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de sulfato de polimixina B.
Ingredientes:
Ingredientes Sulfato de polimixina B (100 000 UI) Agua

Preparación: Disolver el sulfato de polimixina B en el agua y esterilizar por filtración.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de ceftazidima sódica pentahidrato.
144
Ingredientes:
Ingredientes Ceftazidima sódica pentahidratada Agua

Preparación: Disolver la ceftazidima sódica en el agua y esterilizar por filtración.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Palcam - medio completo
Ingredientes:
Disolución de Disolución de
Disolución de ceftazidima sódica
Ingredientes Base sulfato de clorhidrato de
pentahidratada
poliximina acriflavina
Cantidades 960 ml 10.0 ml 10.0 ml 20.0 ml
Preparación: Añadir las soluciones a la base fundida (47 °C), agitando suavemente entre cada
adición, dispensar cantidades de 15 ml del medio en placas Petri estériles y dejar solidificar,
almacenar el medio protegido de la luz.
Reactivo o Medio de cultivo: Agar triptona soya-extracto de levadura (TSYEA).
Ingredientes:
Caldo triptona Extracto de

Ingredientes Agar Agua
soya* levadura
Cantidades 30.0 g 6.0 g 9.0 a 18.0 g 1 000 ml
Preparación: Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua por

ebullición, ajustar el pH si es necesario para que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a 25
°C, dispensar el medio en tubos de capacidad apropiada para obtener cantidades adecuadas para el
análisis, esterilizar durante 15 min en la autoclave a 121 ° C, permitir su estabilización en una
posición inclinada, dispensar el medio en placas Petri estériles, en cantidades adecuadas para el
análisis, esperar a su solidificación, *Caldo triptona soya: Triptona 17 g, peptona de soya 3 g,
cloruro de sodio 5 g, fosfato de hidrógeno dipotásico 2.5 g, glucosa 2.5 g.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo triptona soya-extracto de levadura (TSYEB).
Ingredientes:
Ingredientes Caldo triptona soya Extracto de levadura Agua

Cantidades 30 g 6.0 g 1 000 ml
Preparación: Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua calentando si

es necesario, ajustar el pH si es pertinente, para que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a
145
25 °C, dispensar el medio en frascos o tubos de capacidad apropiada para obtener cantidades
adecuadas para el análisis, esterilizar durante 15 min en la autoclave a 121 ° C.
Reactivo o Medio de cultivo: Agar sangre de cordero (Base).
Ingredientes:
Digestato Extracto
Peptona de Cloruro
Ingredientes enzimático de de Agar Agua
carne sódico
hígado levadura
9.0 g a
18.0 g
Preparación: Disolver los componentes en el agua por ebullición, ajustar el pH si es necesario,

para que después de la esterilización sea de 7.2 ± 0.2 a 25 °C, dispensar el medio en frascos de
capacidad apropiada para obtener cantidades adecuadas para el análisis, esterilizar en la autoclave a
121 ° C durante 15 min.
Reactivo o Medio de cultivo: Sangre de cordero desfibrinada.
Ingredientes:
Ingredientes Base Sangre de cordero desfibrinada

Cantidades 100 ml 5.0 ml a 7.0 ml
Preparación: Añadir la sangre a la base previamente enfriada a 47 °C, mezclar convenientemente,

dispensar el medio en placas Petri estériles, en cantidades adecuadas para el análisis, dejar
solidificar.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de utilización de carbohidratos (ramnosa y xilosa) - base.
Ingredientes:
Proteasa Extracto de Púrpura de

Ingredientes Cloruro sódico Agua
peptona carne bromocresol
Preparación: Disolver los componentes en el agua, calentando si es necesario, ajustar el pH si es

necesario, para que después de la esterilización sea de 6.8 ± 0.2 a 25 °C, dispensar el medio en
tubos de capacidad apropiada para obtener cantidades adecuadas para el análisis, esterilizar en la
autoclave a 121 ° C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Soluciones de carbohidratos.
Ingredientes:
Ingredientes Carbohidrato (L-ramnosa o D-xilosa) Agua

146
Preparación: Disolver separadamente cada carbohidrato en 100 ml de agua, esterilizar por

filtración.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de utilización de carbohidratos (ramnosa y xilosa) - medio

completo.
Ingredientes: Medio base, soluciones de carbohidratos.
Preparación: Para cada carbohidrato añadir asépticamente x ml de la disolución de carbohidratos a

9 ml x ml de la base.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo motilidad.
Ingredientes:
Peptona de
Ingredientes Peptona de carne Agar Agua
caseína

para que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a 25 °C, dispensar el medio en tubos en
cantidades de unos 5 ml, esterilizar en el autoclave a 121 °C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Medio CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen).
Ingredientes: Base agar sangre de cordero, medio de sangre de cordero desfibrinada (descritos
previamente).
Preparación: Dispensar cantidades de 10 ml del medio base en placas Petri estériles y esperar a
que se solidifiquen, verter una capa muy fina del medio de sangre utilizando cantidades inferiores a
3 ml por placa, esperar a que se solidifiquen, si el medio sangre se añade a placas conteniendo la
base (medio base) que han sido preparadas de antemano, puede ser necesario calentar las placas
durante 20 min en una incubadora regulada a 37 °C antes de verter la capa del medio de sangre.
Para esta prueba pueden utilizarse placas de agar sangre de cordero, pero es preferible utilizar
placas de agar con doble capa, con una capa de sangre muy fina.
Reactivo o medio de cultivo: Cepas para la reacción de CAMP.
Ingredientes: Para llevar a cabo la prueba de CAMP se necesitan una cepa b-hemolítica de S.
aureus (por ej. NCTC 1803 o ATCC 25923) y una cepa de R. equi (por ej. NCTC 1621 o ATCC
6939). No todas las cepas de S. aureus son válidas para la prueba de CAMP.
Preparación: Mantener los cultivos de reserva de S. aureus, R. equi, L. monocytogenes, L. nnocua

y L. ivanovii inoculándolos en pendiente de TSYEA, incubándolos a 35 °C o 37 °C de 24 h a 28 h,
o hasta que se haya producido crecimiento y almacenándolos en el refrigerador a 3 °C ± 2 °C. Se
recomienda hacer subcultivos al menos mensualmente.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución tampón de fosfato salino (PBS).
Ingredientes:
147
Fosfato de hidrógeno Fosfato de dihidrógeno Cloruro

Ingredientes Agua
disódico dihidratado sódico de sodio
Preparación: Disolver los componentes en el agua, ajustar el pH si es necesario, para que después
de la esterilización sea de 7.2 ± 0.2 a 25 °C, esterilizar en la autoclave a 121 ° C durante 15 min.
UNE-EN ISO 11290-2:2000
Reactivo o medio de cultivo: Disolución tamponada de peptona.
Ingredientes:
Digestato Fosfato de hidrógeno Fosfato de

Cloruro de
enzimático de disódico hidrógeno
Ingredientes sodio Agua
tejidos dodecahidratado potásico
(NaCl)
animales (Na2HPO4·12H2O) (KH2PO4)
Preparación: Se disuelven en agua los componentes, calentando si es necesario, se ajusta el pH si

es necesario, de tal manera que tras la esterilización sea de 7.0 ± 0.2 a 25 °C, se vierte el medio en
matraces de capacidades adecuadas para obtener alícuotas apropiadas para el ensayo, se esteriliza en
la autoclave a 121 ° C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base para el caldo semi-Fraser con citrato de amonio hierro
(III).
Ingredientes: Medio base para el caldo semi-Fraser y disolución de citrato de amonio hierro (III)
(descritos a continuación).
Preparación: Se añade 1 ml de la disolución de citrato de amonio y hierro (III) a cada una de las
alícuotas del medio base del caldo semi-Fraser inmediatamente antes de su uso. El caldo base semi-
Fraser sin la adición de agentes de selección puede utilizarse como disolvente para las muestras de
alimentos o de preparados cuando, tanto el método de detección, como este método de recuento se
realizan sobre una misma muestra de ensayo. Este procedimiento sirve para evitar preparar dos
suspensiones iniciales; los agentes de selección se añaden a la suspensión una vez que se ha
utilizado la porción de ensayo para el recuento. El seguimiento de este procedimiento debería
señalarse en el informe de ensayo.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base para el caldo semi-Fraser.
Ingredientes:
Peptona de carne
Triptona (digestato Extracto de
Ingredientes (digestato péptico de Cloruro de sodio
péptico de caseína) carne
tejido animal)
148
Fosfato de
Fosfato de
Ingredientes hidrógeno disódico Esculina Agua
hidrógeno potásico
dihidratado

esterilización a 7.2 ± 0.2 a 25 °C, dispensar en frascos, esterilizar durante 15 min en autoclave a 121
°C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de citrato amónio de hierro (III).
Ingredientes:
Ingredientes Citrato amónico de hierro (III) Agua

Preparación: Disolver el citrato amónico de hierro (III) en el agua y esterilizar por filtración.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Palcam - medio base.
Ingredientes:
Ingredientes Peptonas Almidón Agar D-glucosa
sodio levadura
9.0 g a 18.0
g
Citrato
Rojo de Cloruro de
Ingredientes D-manitol Esculina amónico de Agua
fenol litio
hierro (III)
Cantidades 10.0 g 0.8 g 0.5 g 0.08 g 15.0 g 960. 0 ml

esterilización a 7.2 ± 0.2 a 25 °C, esterilizar durante 15 min en autoclave a 121 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de sulfato de polimixina B.
Ingredientes:
Ingredientes Sulfato de polimixina B (100 000 UI) Agua

Preparación: Disolver el sulfato de polimixina B en el agua y esterilizar por filtración.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de clorhidrato de acriflavina.
149
Ingredientes:
Ingredientes Clorhidrato de acriflavina Agua

Preparación: Disolver el hidrocloruro de acriflavina en el agua y esterilizar por filtración.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de ceftazidima sódica pentahidrato.
Ingredientes:
Ingredientes Ceftazidima sódica pentahidrato Agua

Preparación: Disolver la ceftazidima sódica en el agua y esterilizar por filtración.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Palcam - completo.
Ingredientes:
Disolución de Disolución de
Disolución de sulfato
Ingredientes Agar base clorhidrato de ceftazidima sódica
de polimixina B
acriflavina pentahidrato
Cantidades 960.0 ml 10.0 ml 10.0 ml 20.0 ml
Preparación: Se añaden las disoluciones de los apartados al medio fundido a 47 °C, mezclando
concienzudamente tras cada adición, el pH del medio completo deberá ser de 7.2 ± 0.2 a 25 °C. Se
vierten cantidades apropiadas de medio completo recién preparado en un número adecuado de
placas Petri, se deja solidificar, los medios se almacenarán en un lugar oscuro.
Reactivo o medio de cultivo: Agar triptona soya-extracto de levadura (TSYEA).
Ingredientes:
Ingredientes Caldo triptona soya* Extracto de levadura Agar Agua

9.0 g a 18.0
g
Preparación: Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua por

ebullición, ajustar el pH si es necesario para que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a 25
°C, dispensar el medio en tubos de capacidad apropiada para obtener cantidades adecuadas para el
análisis, esterilizar durante 15 min en la autoclave a 121 ° C, permitir su estabilización en una
posición inclinada. Para la preparación de placas de agar, dispensar el medio en placas Petri
estériles, en cantidades adecuadas para el análisis, esperar a su solidificación. *Caldo triptona soya:
Triptona 17 g, peptona de soya 3 g, cloruro sódico 5 g, fosfato de hidrógeno dipotásico 2.5 g, D-
glucosa 2.5 g.
Ingredientes:
150
Ingredientes Caldo triptona soya* Extracto de levadura Agua

Preparación: Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua calentando si

es necesario, ajustar el pH si es necesario, para que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a 25
°C, dispensar el medio en frascos o tubos de capacidad apropiada para obtener cantidades
adecuadas para el análisis, esterilizar durante 15 min en la autoclave a 121 ° C.
Reactivo o medio de cultivo: Agar sangre de oveja (Base).
Ingredientes:
Digestato
Peptona de Extracto de Cloruro
Ingredientes enzimático Agar Agua
carne levadura sódico
de hígado
9.0 g a 18.0
g
Preparación: Disolver los componentes en el agua por ebullición, ajustar el pH si es necesario para
que después de la esterilización sea de 7.2 ± 0.2 a 25 °C, dispensar el medio en frascos de capacidad
apropiada para obtener cantidades adecuadas para el análisis, esterilizar en la autoclave a 121 ° C
durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Agar sangre de oveja (completo).
Ingredientes:
Ingredientes Base Sangre de oveja desfibrinada

Cantidades 100.0 ml 5.0 ml a 7.0 ml
Preparación: Añadir la sangre a la base previamente enfriada a 47 °C, mezclar convenientemente,

dispensar el medio en placas Petri estériles, en cantidades adecuadas para el análisis, dejar
solidificar.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de utilización de carbohidratos (ramnosa y xilosa) (Base).
Ingredientes:
Proteasa Extracto de Cloruro Púrpura de

Ingredientes Agua
peptona carne sódico bromocresol
Preparación: Disolver los componentes en el agua, calentando si es necesario, ajustar el pH si es

necesario, para que después de la esterilización sea de 6.8 ± 0.2 a 25 °C, dispensar el medio en
tubos de capacidad apropiada para obtener cantidades adecuadas para el análisis, esterilizar en la
autoclave a 121 ° C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Soluciones de carbohidratos.

151
Ingredientes:
Ingredientes Carbohidrato (L-ramnosa o D-xilosa) Agua

Preparación: Disolver separadamente cada carbohidrato en 100 ml de agua, esterilizar por

filtración.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de utilización de carbohidratos (ramnosa y xilosa) - medio

completo.
Ingredientes: Medio base, soluciones de carbohidratos.
Preparación: Para cada carbohidrato añadir asépticamente x ml de la disolución de carbohidratos a

9 x ml de la base.
Reactivo o medio de cultivo: Agar de movilidad.
Ingredientes:
Ingredientes Peptona de Peptona de carne Agar Agua

caseína

para que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a 25 °C, dispensar el medio en tubos en
cantidades de unos 5 ml, esterilizar en la autoclave a 121 °C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Medio CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen).
Ingredientes: Base agar sangre de cordero, medio sangre de cordero desfibrinada.
Preparación: Dispensar cantidades de 12 ml de la base en placas Petri estériles y esperar a que se

solidifiquen, verter una capa muy fina del medio de sangre utilizando cantidades inferiores a 3 ml
por placa, esperar a que se solidifiquen, si el medio sangre se añade a placas conteniendo la base
que han sido reparadas de antemano, puede ser necesario calentar las placas durante 20 min en un
incubador regulado a 37 °C antes de verter la capa del medio de sangre, para esta prueba pueden
utilizarse placas de agar sangre de cordero, pero es preferible utilizar placas de agar con doble capa,
con una capa de sangre muy fina.
Reactivo o medio de cultivo: Cepas para la reacción de CAMP.
Ingredientes: Para llevar a cabo la prueba de CAMP se necesitan una cepa b-hemolítica de S.
aureus (por ej. NCTC 1803 o ATCC 25923) y una cepa de R. equi (por ej. NCTC 1621 o ATCC
6939). No todas las cepas de S. aureus son válidas para la prueba de CAMP.
Preparación: Mantener los cultivos de reserva de S. aureus, R. equi, L. monocytogenes, L. nnocua

y L. ivanovii inoculándolos en pendiente de TSYEA, incubándolos a 35 °C o 37 °C de 24 h a 28 h,
o hasta que se haya producido crecimiento y almacenándolos en el refrigerador a 3 °C ± 2 °C. Se
recomienda hacer subcultivos al menos mensualmente.
152
Reactivo o medio de cultivo: Disolución tampón de fosfato salino (PBS).
Ingredientes:
Fosfato de
Fosfato de
Ingredientes hidrógeno disódico Cloruro de sodio Agua
hidridógeno sódico
dihidratado
Preparación: Disolver los componentes en el agua, ajustar el pH si es necesario, para que después
de la esterilización sea de 7.2 ± 0.2 a 25 °C, esterilizar en la autoclave a 121 ° C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Suspensión de eritrocitos de sangre de oveja.
Ingredientes: Sangre de oveja, tampón PBS.
Preparación: Se mantienen las células de la sangre de oveja a 3 °C ± 2 °C antes de su uso, se

examina la presencia de señales de hemólisis (enrojecimiento) en la capa superior de suero antes de
su uso, si no aparece hemólisis, se añaden 2 ml de la capa inferior de eritrocitos sobre 98 ml de
tampón PBS, si se ha producido hemólisis, se suspenden unos 4 ml de la capa de células rojas en 10
ml de tampón PBS y se mezcla suavemente, centrifugando a continuación, si el sobrenadante es
visiblemente rojo debido a una hemólisis muy significativa, no se utilizará y se descartará la
suspensión inicial, si no es así, se decanta el sobrenadante y se añaden 2 ml de esta suspensión de
células a 98 ml de tampón PBS. La suspensión puede guardarse hasta 5 días a +3 °C ± 2 °C. Si
aparece hemólisis, se desechará.
BAM Capítulo 10: Listeria monocytogenes
Reactivo o medio de cultivo: Agar moxalactam feniletanol cloruro de litio (LPM).
Ingredientes:
Disolución
stock
Agar Glicina Cloruro de moxalactam (en
feniletanol anhidra litio buffer de
fosfato 1 %, pH
6.0)
Cantidades 35.5 g 10.0 g 5.0 g 2 ml 1 000 ml
Preparación: Esterilizar el medio sin moxalactam a 121 °C durante 15 min, enfriar a 48 ºC - 50 °C

y añadir la disolución stock moxalactam esterilizada por filtración, disolución stock moxalactam:
disolver 1 g de sal moxalactam (amonio o sodio) en 100 ml de buffer de fosfato potasio 0.1 M pH
6.0. Almacenar la disolución filtrada-esterilizada congelada en alícuotas de 2 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Esculina e iones de hierro (suplemento para LPM).
Ingredientes:
Ingredientes Esculina Citrato de amonio férrico

153
Cantidades 1g 0.5 g
Preparación: Añadir estos ingredientes al medio LPM, esterilizar el medio, enfriar y añadir la
disolución de moxalactam como se describe en el medio LPM.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo nitrato.
Ingredientes:
Ingredientes Extracto de carne Peptona KNO3 Agua destilada

Preparación: Disolver los ingredientes, distribuir en alícuotas de 5 ml en tubos de 16 mm x 125

mm, esterilizar 15 min a 121 °C, pH final de 7.0 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para la detección de nitrato.
Ácido sulfanílico
Ingredientes:
Ingredientes Ácido sulfanílico Ácido acético 5 N

Ingredientes:
Ingredientes Ácido acético 5 N
dihidrocloruro
α-Naftol
Ingredientes:
Ingredientes α-Naftol Ácido acético 5 N

Preparación: Preparar el ácido acético 5 N, adicionando 28.75 ml de ácido acético glacial a 71.25
ml de agua destilada, almacenar los reactivos en frascos color ámbar con tapa de rosca, para la
prueba, adicionar de 0.1 ml a 0.5 ml de cada reactivo al medio de cultivo sólido o semisólido.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo nutritivo.
Ingredientes:
154
Ingredientes Extracto de carne Peptona Agua destilada

Preparación: Disolver los ingredientes por calentamiento, distribuir en alícuotas de 225 ml en

matraces Erlenmeyer de 500 ml, esterilizar durante 15 min a 121 °C, pH final de 6.8 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución salina fisiológica 0.85 % (estéril).
Ingredientes:

Preparación: Disolver el NaCl en el agua, esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 °C,
almacenar a temperatura ambiente.
Ingredientes:
Proteasa Extracto Púrpura de

peptona N° 3 de carne bromocresol
Preparación: Disolver los componentes, distribuir en porciones de 2.5 ml en tubos de 13 mm x 100

mm con tubos de fermentación invertidos de 6 mm x 50 mm, esterilizar en autoclave 10 min a 118 °
C. pH final 6.8 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Medio de SIM.
Ingredientes:
Sulfato de
Peptona de Peptona de Tiosulfato de
Ingredientes fierro y Agar
caseína carne sodio
amonio

tubos de rosca de 16 mm x 125 mm, esterilizar de acuerdo a las instrucciones del fabricante. pH
final 7.3 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar motilidad semisólido.
Ingredientes:
Extracto de
Ingredientes Peptona NaCl Agar Agua destilada
carne
155
Preparación: Disolver con agitación y calentamiento, hervir durante 1 min para disolver el agar,
distribuir en porciones de 8 ml en tubos de rosca de 16 mm x 150 mm, esterilizar en autoclave
durante 15 min a 121 °C. pH final 7.4 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar soya tripticaseína con 0.6 % de extracto de levadura (TSYEA).
Ingredientes:
Ingredientes Caldo soya tripticaseína Extracto de levadura Agua

Preparación: Agitar hasta disolver los ingredientes, esterilizar a 121°C ± 1 °C durante 15 min. El
pH final de la disolución debe ser 7.3 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo soya tripticaseína con 0.6 % de extracto de levadura (TSYEB).
Ingredientes:
Ingredientes Caldo soya tripticaseína Extracto de levadura Agua

Preparación: Agitar hasta disolver los ingredientes, esterilizar a 121 ºC ± 1 °C durante 15 min. El
pH final de la disolución debe ser de 7.3 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Medio Oxford.
Ingredientes:
Agar base sangre Citrato férrico

Ingredientes Esculina Cloruro de litio
Columbia amoniacal
Cantidades 39.0 g 1.0 g 500.0 mg 15.0 g
Sulfato de
Ingredientes Cicloheximida Acriflavina Cefotetán Fosfomicina
colistina
Cantidades 400.0 mg 20.0 mg 5.0 mg 2.0 mg 10.0 mg
Preparación: Disolver los primeros cuatro ingredientes en 1 L de agua destilada, esterilizar en

autoclave a 121 °C por 15 min, enfriar a 50 °C y adicionar de manera aséptica los suplementos.
Disolver la cicloheximida, el sulfato de colestina, acriflavina, cefotetán y la fosfomicina en 10 ml
de una mezcla 1:1 de etanol: agua. Esterilizar por filtración antes de agregar al medio base, mezclar
y vaciar en cajas Petri estériles.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de enriquecimiento amortiguado (para listeria), pH 7.3 ± 0.1.
Ingredientes: TSYEB suplementado con:

156
Fosfato de Fosfato Ácido

Acriflavina Ácido
Ingredientes monopotasio disódico nalidíxico Cicloheximida
HCl pirúvico
(anhidro) (anhidro) (sal sódica)
11.1
Cantidades 1.35 g/l 9.6 g/l 10 mg/l 40 mg/l 50 mg/l
ml/l
Preparación: Esterilizar el medio de enriquecimiento sin los tres agentes selectivos en autoclave a
121 °C durante 15 min. Después añadir 2.5 ml de ácido pirúvico al 10 % (p/v) filtrado-esterilizado
(el ácido puede ser adicionado antes de meter a la autoclave), añadir asépticamente los tres agentes
selectivos a 225 ml del caldo de enriquecimiento después de 4 h de incubación a 30 °C, añadir 25 g
de la muestra del alimento, preparar la acriflavina y el ácido nalidíxico como una disolución stock
al 0.5 % (p/v) en agua destilada, preparar la cicloheximida como una disolución stock al 1 % (p/v)
en una disolución etanol - agua al 40 % (v/v). Esterilizar por filtración los 3 ingredientes selectivos,
añadir las soluciones stock: 0.455 ml acriflavina, 1.8 ml ácido nalidíxico y 1.15 ml de
ciclohexamida a 225 ml de caldo de enriquecimiento con la muestra.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Palcam.
Ingredientes:
Medio base:
Cloruro de Agar
Ingredientes Peptonas Almidón D-glucosa
sodio Columbia
Citrato
D- Rojo de Cloruro de
Ingredientes Esculina amónico de Agua
manitol fenol litio
hierro (III)
Agentes selectivos: Sulfato de polimixina B 10 mg, acriflavina 5 mg, ceftazidina 20 mg, agua
destilada 2 ml.
Ingredientes Sulfato de polimixina B Acriflavina Ceftazidina Agua destilada

Cantidades 10.0 mg 5.0 mg 20.0 mg 2.0 ml
Preparación: Para hacer 500 ml del medio, pesar 34.4 g de medio basal en polvo (todos los
ingredientes menos los 3 agentes selectivos) y suspender en 500 ml de agua destilada. Esterilizar en
autoclave a 121 °C durante 15 min. Disolver la mezcla de agentes selectivos en agua destilada a
17.5 g/ml y esterilizar por filtración. Añadir 1 ml del agente selectivo en disolución a 500 ml del
medio basal estéril que ha sido enfriado a 50 °C. Mezclar y dispensar en placas estériles. pH final
7.2 ± 0.1.
Reactivo o medio de cultivo: Agar Oxford modificado.
Ingredientes:
157
Agar base Citrato

Cloruro Buffer colistina
Ingredientes sangre Agar Esculina férrico Agua
de litio metansulfonato
Columbia amoniacal
39.0-44.0
Cantidades 2.0 g 1.0 g 0.5 g 15.0 g 1.0 ml 1 000 mL
g
Preparación: Disolver el medio basal por agitación en agua destilada, ajustar el pH a 7.2 ± 0.1.
Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 10 min, mezclar nuevamente, enfriar rápidamente a 46 °C
en baño de agua, adicionar 2 ml de disolución moxalactam amortiguada y mezclar. Dispensar 12 ml
en cajas Petri. Disolución colistina amortiguada al 1 % (p/v): colistina metansulfonato 1 g, buffer
de fosfato de sodio 0.1 M pH 6.0 ± 0.1, 100 ml. Disolución moxalactam amortiguada al 1 %
(p/v): moxalactam 1 g, buffer fosfato de potasio 0.1 M pH 6.0 ± 0.1, 100 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Medio ALOA.
Ingredientes:
Sulfato
Peptona Extracto de Piruvato Glicerofosfato
Ingredientes Triptona Glucosa de
carne levadura de sodio de magnesio
magnesio
Fosfato
5-bromo-4-cloro-
Clorhidrato Clorhidrato hidrogenado
Ingredientes 3-indolyl-β-D- Agar Agua
de sodio de litio disódico
glucopyranosido
anhidro
12.0 g a 925 ml a
Cantidades 5.0 g 10.0 g 2.5 g 0.05 g
18.0 g 930 ml
Preparación: Disolver los componentes, ajustar el pH a 7.2 ± 0.2, esterilizar en autoclave por 15
min a 121 °C. Medio completo: 925 ml o 930 ml de agar base, 5 ml disolución de ácido nalidíxico,
5 ml disolución ceftazidima, 5 ml disolución cicloheximida, 5 ml polimixina B (o 10 ml de
anfotericina B), 50 ml L-α-fosfatidilinositol. Suplementos: Disolver 2 g de L-α-fosfatidilinositol en
50 ml de agua fría, agitar aproximadamente por 30 min hasta obtener una suspensión homogénea,
esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C, enfriar entre 48 °C y 50 °C, disolver los siguientes
componentes individualmente en sus respectivos solventes y esterilizar por filtración: 0.02 g ácido
nalidíxico en 5 ml de agua; 0.02 g de ceftazidima en 5 ml de agua; 76700 U de polimixina B en 5
ml de agua; 0.05 g cicloheximida en 2.5 ml de etanol y adicionar 2.5 ml de agua; 0.01 de
anfotericina B en una mezcla de 2.5 ml HCl (1 M) y 7.5 ml de dimetilformamida.
Reactivo o medio de cultivo: Medio Rapid'L mono.
Ingredientes:
158
Suplementos selectivos
Extracto de Extracto de Clorhidrato
Ingredientes Peptona (información no
carne levadura de litio
especificada)
Cantidades 30.0 g 5.0 g 1.0 g 9.0 g 20.0 ml
Sustrato
Agar B
cromogénico
Ingredientes D-xilosa Rojo fenol (información no Agua destilada
(información no
especificada)
especificada)
Cantidades 10.0 g 0.12 g 13.0 g 1.0 ml 1 000 ml
Preparación: pH final 7.3 ± 0.1, almacenar entre 2 °C - 8 °C en obscuridad, el medio se encuentra

disponible comercialmente en Bio-Rad http://www.biorad.com.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo y agar triptosa (para serología).
Ingredientes:
Ingredientes Difco Bacto triptosa NaCl Dextrosa Agar Agua destilada

Preparación: Pesar los ingredientes, añadir el agua y mezclar, esterilizar en autoclave 15 min a 121
°C, pH final 7.2 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: CHROMagar Listeria.
Preparación: Medio selectivo comercial. Se encuentra disponible en www.chromagar.com
Reactivo o medio de cultivo: Agar cromogénico para Listeria.
Preparación: Medio selectivo comercial. Se encuentra disponible en www.oxoid.com
Reactivo o medio de cultivo: Medio cromogénico para Listeria M. (BSM)
Preparación: Se puede obtener comercialmente como un medio deshidratado basal más

suplementos.
BAM Capítulo 10: Listeria monocytogenes. BAM Protocolo: Confirmación simultánea de

especies aisladas de Listeria y L. monocytogenes por PCR en tiempo real
Reactivo o medio de cultivo: Agua grado molecular estéril

159
Reactivo o medio de cultivo: OmniMix-HS PCR Reagent Beads (Cepheid, Sunnyvale, CA.
También disponible en Fisher).
Reactivo o medio de cultivo: Oligos iniciadores para especies de Listeria y el gen iap de L.
monocytogenes (Tabla 21).
Tabla 21. Secuencias de los oligos para usar en la plataforma SmartCycler II (Cepheid,
Sunnyvale, CA) basada en la secuencia GenBank Accession X52268.
Oligos1 Bases 5' → 3' Secuencia

Lm835F 28 AACTGGTTTCGTTAACGGTAAATACTTA
Lm998R 20 TAGGCGCAGGTGTAGTTGCT
Lall1055F 24 GTTAAAAGCGGTGACACTATTTGG
Lall1163R 31 TTTGACCTACATAAATAGAAGAAGAAGATAA
1
El nombre del oligo iniciador se compone del objetivo (Lall = todas las especies de Listeria, Lm =
L. monocytogenes), Posición 5' de la base del oligonucleótido en la respectiva secuencia específica
del gen especificada en la columna 2 y oligo delantero (F) u oligo reverso (R).
4.3 Staphylococcus aureus
NOM-115-SSA1-1994
Reactivo o medio de cultivo: Medio de Baird-Parker
Ingredientes: Medio base 95 ml, disolución de telurito de potasio 1 ml, emulsión de yema de huevo
5 ml; cuando el medio base esté a 45 °C, agregar los demás ingredientes y mezclar. Colocar de 15 a
20 ml del medio completo, enfriar y dejar solidificar. Las placas pueden almacenarse por 48 h a
temperatura de 0 °C a 5 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base de Baird-Parker
Ingredientes:
Ingredientes Triptona Extracto de levadura Extracto de carne Glicina

Cantidades 10.0 g 1.0 g 5.0 g 12.0 g
Ingredientes Cloruro de litio Piruvato de sodio Agar Agua

Preparación: Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitación constante y
hervir durante 1 min, esterilizar a 121 °C ±1 °C durante 15 min, enfriar y mantener el medio a 45
°C.
Ingredientes:
160
Ingredientes Telurito de potasio Agua

Preparación: Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar, la disolución puede ser

almacenada por varios meses a temperatura de 0 °C a 5 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Emulsión de yema de huevo.
Ingredientes y preparación: Huevos frescos, tintura de yodo (disolución alcohólica al 2 %),

cloruro mercúrico (1:1000). Lavar con agua y jabón los huevos frescos que sean necesarios y
limpiarlos con una disolución de tintura de yodo o sumergirlos en disolución de cloruro mercúrico,
enjuagar con agua estéril y secar con gasa estéril, en campana de flujo laminar o en condiciones
asépticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador de claras estéril, transferir las yemas a una
probeta hasta un volumen de 60 ml y completar a 90 ml con disolución salina isotónica, verter la
emulsión a un matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio estéril y agitar fuertemente para formar la
emulsión, filtrar a través de gasa, las placas deben utilizarse dentro de las 48 h siguientes a su
preparación.
Reactivo o Medio de cultivo: Disolución salina isotónica
Ingredientes:
Ingredientes Cloruro de sodio Agua

Preparación: Disolver el ingrediente en agua y esterilizar a 121 °C ±1 °C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de infusión cerebro-corazón (BHI)
Ingredientes:
Infusión de Infusión de
Peptona de Cloruro Fosfato disódico
Ingredientes cerebro de corazón de Glucosa Agua
gelatina de sodio dodecahidratado
ternera res
1 000
Cantidades 200.0 ml 250.0 ml 10.0 g 5.0 g 2.5 g 2.0 g
ml
Preparación: Disolver el ingrediente en agua y esterilizar a 121 °C ±1 °C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Ácido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera.
Ingredientes: Ácido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera o equivalente a 0.03 g, agar

1 g, cloruro de calcio anhidro (Disolución 0.01 M) 0.10 ml, cloruro de sodio 1 g, azul de toluidina
(Disolución 0.1 M) 0.3 ml, Tris-(hidroximetil-aminometano) (Tris disolución 0.05 M, pH 9) 100
ml.
161
Ácido Cloruro de Tris-

Azul de
desocirribonucleico calcio (hidroximetil-
Cloruro toluidina
Ingredientes helicoidal de timo Agar anhidro aminometano)
de sodio (Disolución
de ternera o (Disolución (Tris disolución
0.1 M)
equivalente 0.01 M) 0.05 M, pH 9)
Cantidades 0.03 g 1.0 g 0.10 ml 1.0 g 0.3 ml 100 ml
Preparación: Disolver los ingredientes, excepto el azul de toluidina agitando hasta completar la
disolución del ácido desoxirribonucleico y calentar a ebullición, agregar el azul de toluidina,
distribuir en frascos pequeños con tapón de hule, no es necesario esterilizar. Este medio es estable a
temperatura ambiente hasta 4 meses y funciona perfectamente aún después de fundirlo varias veces;
tomar un porta objetos limpio y agregar 3 ml del medio fundido esparciéndolo por la superficie,
cuando el agar solidifique, hacer orificios con la punta de una pipeta Pasteur, conservar en
refrigeración para evitar la deshidratación.
Reactivo o medio de cultivo: Plasma de conejo
Ingredientes: Plasma de conejo deshidratado o rehidratado, ácido etilendiaminotetracético (EDTA)

0.1 %, emplear plasma de conejo deshidratado o rehidratado siguiendo las instrucciones del
fabricante y agregar ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en disolución al 0.1 % en plasma
rehidratado. Si se utiliza plasma deshidratado diluir con agua estéril en proporción de 1:3. Puede
emplearse plasma de conejo liofilizado adicionado de EDTA, no debe emplearse sangre citratada.
UNE-EN ISO 6888-1:2000
Reactivo o medio de cultivo: Medio de agar de Baird-Parker
Ingredientes:
Disolución de Emulsión de Disolución de

telurito potásico yema de huevo sulfametacina
Preparación: Medio base 100 ml, disolución de telurito potásico 1 ml, emulsión de yema de huevo
5 ml, disolución de sulfametacina 2.5 ml. Se funde el medio base y a continuación se deja enfriar
aproximadamente hasta 47 °C utilizando el baño de agua, añadir en condiciones asépticas las otras
dos disoluciones y si es necesario (si se sospecha la presencia de especies de Proteus en la muestra
de ensayo) la disolución de sulfametacina, habiendo calentado previamente las disoluciones a 47 °C
en el baño de agua, mezclar bien.
Ingredientes:
Digerido
Extracto de
Ingredientes pancreático de Extracto de carne Piruvato sódico
levadura
caseína
Cantidades 10.0 g 1.0 g 5.0 g 10.0 g
162
Ingredientes L-glicina Cloruro de litio Agar Agua

Entre 12.0 g y Hasta un volumen
Cantidades 12.0 g 5.0 g
22.0 g final de 1 000 ml
Preparación: Se disuelven los componentes del medio base completo deshidratado en agua en
ebullición, ajustar pH a 7.2 ± 0.2 a 25 °C, trasvasar el medio en alicuotas de 100 ml, esterilizar
durante 15 min a 121 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de telurito potásico
Ingredientes:
Ingredientes Telurito potásico Agua

Preparación: Disolver el telurito potásico en el agua, calentando mínimamente, esterilizar por

filtración utilizando membranas de tamaño de poro de 0.22 µm, almacenar aproximadamente 1 mes
a 3 °C ± 2 °C, desechar si se forma un precipitado blanco.
Reactivo o medio de cultivo: Emulsión de yema de huevo
Ingredientes y preparación: Huevos frescos, etanol (70 %). Se lavan los huevos con un cepillo y
detergente líquido, aclarar bajo el chorro de agua y desinfectar las cáscaras por inmersión en etanol
(70 %) durante 30 s y dejarlas secar al aire libre o rociarlas con alcohol seguido de esterilización
con llama, trabajando en condiciones asépticas, se rompe la cáscara de cada huevo en dos y se
separa la yema de la clara transfiriendo repetidamente la yema de una mitad de la cáscara a la otra,
se introducen las yemas en un matraz estéril y se añade un volumen de agua estéril igual a cuatro
veces el volumen de las yemas, se mezcla completamente, se calienta la mezcla en el baño de agua
conectado a 47 °C durante 2 h y se deja entre 18 h y 24 h a 3 °C ± 2 °C para dejar que se forme un
precipitado, se recoge el líquido sobrenadante en condiciones asépticas y se introduce en un matraz
estéril nuevo. Almacenar a 3 °C ± 2 °C durante un máximo de 72 h.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de sulfametacina
Ingredientes:
Ingredientes Sulfametacina Disolución de hidróxido sódico Agua

Preparación: Disolver la sulfametacina en la disolución de hidróxido sódico, esterilizar por

filtración utilizando membranas de tamaño de poro de 0.22 µm, la disolución puede almacenarse
durante un mes a 3 °C ± 2 °C.
Reactivo o Medio de cultivo: Infusión de cerebro y corazón.
Ingredientes:
163
Fosfato de
Digerido Infusión de Infusión de
hidrógeno
enzimático cerebro de corazón de Cloruro
Ingredientes Glucosa disódico Agua
de tejidos ternera buey de sodio
(Na2HPO4)
animales deshidratada deshidratada
anhidro
ebullición, ajustar pH a 7.2 ± 0.2 a 25 °C, trasvasar el medio en alicuotas de 5 ml y 10 ml, esterilizar
Reactivo o Medio de cultivo: Plasma de conejo
Ingredientes: Se utilizará plasma deshidratado de conejo comercial y se rehidratará de acuerdo con

las instrucciones del fabricante. Si no se tuviera acceso a plasma deshidratado de conejo, se diluirá
un volumen de plasma fresco estéril de conejo con tres volúmenes de agua estéril, si se utilizó
citrato potásico o citrato sódico como anticoagulantes de plasma, se añadirá una disolución de
EDTA, de forma que resulte una concentración de 0.1 % de EDTA en el plasma rehidratado o
diluido. Salvo que las instrucciones del fabricante indiquen lo contrario, el plasma rehidratado o
diluido se utilizará inmediatamente; antes de utilizarse se analizará cada lote de plasma con cepas
de estafilococos coagulasa-positivos y cepas de estafilococos coagulasa-negativos.
UNE-EN ISO 6888-2:2000
Reactivo o medio de cultivo: Medio de agar de plasma de conejo y fibrinógeno
Ingredientes:
Disolución de
Disolución Disolución de plasma de conejo y
telurito potásico fribrinógeno bovino del inhibidor de
tripsina
Preparación: Medio base 90 ml, disolución telurito potásico 0.25 ml, disolución de fibrinógeno
bovino 7.5 ml, disolución de plasma de conejo y del inhibidor de tripsina 2.5 ml. Fundir el medio
base y después dejarlo enfriar a 48 °C en baño de agua; en condiciones asépticas, añadir las tres
soluciones previamente calentadas a 48 °C en baño de agua, mezclar completamente por rotación
tras cada adición, para minimizar la formación de espuma, utilizar el medio completo
inmediatamente después de su preparación, a fin de evitar la precipitación del plasma.
Ingredientes:
Digerido Extracto
Extracto Piruvato L- Cloruro
Ingredientes pancreático de Agar Agua
de carne sódico glicina de litio
de caseína levadura
164
Entre Hasta un
12.0 g volumen
a 22.0 final de 1
g 000 ml
ebullición, ajustar el pH a 7.2 ± 0.2 a 25 °C; trasvasar el medio en alicuotas de 100 ml, esterilizar
Ingredientes:


filtración utilizando membranas de tamaño de poro de 0.22 µm; almacenar aproximadamente 1 mes
a 3 °C ± 2 °C; desechar si se forma un precipitado blanco.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de fibrinógeno bovino
Ingredientes:
Ingredientes Fibrinógeno bovino Agua estéril

Cantidades 5.0 g a 7.0 g 100 ml
Preparación: En condiciones asépticas, disolver el fibrinógeno bovino en agua justo antes de su

utilización.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de plasma de conejo y del inhibidor de la tripsina
Ingredientes: Plasma de conejo con EDTA para la coagulasa (plasma coagulasa EDTA) 30 ml,
inhibidor de la tripsina 30 mg. En condiciones asépticas, disolver el fibrinógeno bovino en agua
justo antes de su utilización.
UNE-EN ISO 6888-3:2003
Reactivo o medio de cultivo: Caldo Giolitti y Cantoni modificado
Ingredientes: Medio base, telurito potásico; poco tiempo antes de su uso, se calienta el medio base
durante 15 min a 100 °C para expulsar el aire, se enfría entre 44 °C y 47 °C y se añade
asépticamente la disolución de telurito potásico utilizando 0.1 ml por tubo de medio de
concentración simple y 0.2 ml por tubo de medio de concentración doble.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base (medio doble, medio simple).
Ingredientes:
Medio doble:
165
Digestato
Extracto de Cloruro de Cloruro
Ingredientes enzimático de Manitol
carne litio sódico
caseína
Cantidades 20.0 mg 10.0 g 10.0 g 40.0 g 10.0 g
Mono-oleato de sorbitán
Ingredientes Glicina Piruvato sódico polioxietilenado, Tween Agua
80
Medio simple:
Digestato
Ingredientes enzimático de Manitol Cloruro sódico
carne litio
caseína
Cantidades 10.0 mg 5.0 g 5.0 g 20.0 g 5.0 g
Mono-oleato de sorbitán
Ingredientes Glicina Piruvato sódico polioxietilenado, Tween Agua
80
Preparación: Se disuelven los ingredientes en el agua, mediante calentamiento y mezclando si

fuera necesario, para obtener una disolución completa. Se enfría a temperatura ambiente y se ajusta
el pH; dispensar el medio en cantidades apropiadas en tubos, esterilizar 15 min.
Ingredientes:


filtración utilizando membranas de tamaño de poro de 0.22 µm, almacenar aproximadamente 1 mes
a 3 °C ± 2 °C, desechar si se forma un precipitado blanco.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de agar
Ingredientes:
Ingredientes Agar Agua

Cantidades 15.0 g a 20.0 g 1 000 ml
166
Preparación: Se suspende el agar en el agua mediante ebullición y, se esteriliza en autoclave a 121

°C durante 15 min, se enfría entre 44 °C y 47 °C antes de su empleo, se reparte en tubos de
capacidad adecuada, almacenar de acuerdo a la Norma ISO 7218.
Reactivo o medio de cultivo: Medio agar de Baird-Parker
Ingredientes: Véase la norma ISO 6888-1:1999.
Reactivo o medio de cultivo: Medio agar de plasma de conejo y fibrinógeno
Reactivo o medio de cultivo: Caldo infusión de cerebro y corazón.
Reactivo o medio de cultivo: Plasma de conejo.
Ingredientes: Refiérase a la norma ISO 6888-1:1999.
BS 5763: Part 7: 1983
Ingredientes:
sodio aspártico
Citrato de
Cloruro de Fosfato
nicotínico pantoténico magnesio amoniacal
(III)

Preparación: Disolver el cloruro de amonio en el agua, adicionar los otros componentes y disolver
por agitación y calentamiento, ajustar el pH después de la esterilización a 6.7 ± 0.2 a 25 °C,
transferir volúmenes de 100 ml del medio a envases adecuados y esterilizar en autoclave por 10
minutos a 115 °C, adicionar a cajas Petri de 12 ml a 15 ml del medio estéril y enfriado a
aproximadamente 45 °C, dejar solidificar.
167
Ingredientes:
Agua
destilada
Preparación: Disolver los componentes en el agua por calentamiento, ajustar el pH después de la

esterilización a 7.2 ± 0.2 a 25 °C, transferir volúmenes de 100 ml del medio a contenedores
adecuados y esterilizar el medio en autoclave por 15 minutos a 121 °C, adicionar a cajas Petri
estériles de 12 ml a 15 ml del medio enfriado a 45 °C, dejar solidificar y almacenar a 0 °C – 5 °C.
Ingredientes:
Disolución
Extracto de
Extracto de Cloruro Agua
Ingredientes Triptona de sulfamezatina
carne Glicina de litio Agar destilada
levadura (solo de ser
necesario)
12 g
Cantidades 10 g 1g 5g 12 g 5g a 20 1 000 ml 27.5 ml
g
Preparación: Disolver los componentes en el agua por calentamiento, si es necesario, adicionar los
27.5 ml de la disolución de sulfamezatina (sulfamidina, INN), ajustar el pH después de la
esterilización a 7.2 ± 0.2 a 25 °C, transferir volúmenes de 90 ml del medio a frascos o botellas de
capacidad no mayor a 300 ml, esterilizar el medio en autoclave por 15 minutos a 121 °C.
Ingredientes:
Disolución de telurito de
potasio
Preparación: Disolver el telurito de potasio en el agua con mínimo calentamiento, esterilizar por
filtración.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de sulfamezatina (sulfadimina, INN), solo en sospecha de

presencia de Proteus.
Ingredientes:
Disolución de
Ingredientes Sulfamezatina hidróxido de sodio Agua destilada
(0.1 mol/l)
168
Preparación: Disolver la sulfamezatina en la disolución de hidróxido de sodio, llevar hasta un

volumen final de 100 ml con el agua destilada.
Ingredientes:
Preparación: Disolver el piruvato en el agua destilada.
Ingredientes:
Preparación: Disolver el piruvato en el agua destilada, filtrar por filtración.
Reactivo o medio de cultivo: Emulsión yema de huevo.
Ingredientes:

Preparación: Usar huevos frescos, separar las yemas de las claras, mezclar las yemas
vigorosamente con 4 veces su volumen de agua, calentar la mezcla en baño de agua, a temperatura
controlada de 45 °C, por 2 horas y dejar de (18 a 24) h a 0 °C para permitir que se forme un
precipitado, decantar el líquido supernadante y esterilizar por filtración, la emulsión debe ser
separada asépticamente. La emulsión debe almacenarse a 0 °C -5 °C por no más de 72 h.
Reactivo o medio de cultivo: Medio completo.
Ingredientes:
Disolución de Emulsión Disolución de

Ingredientes Medio base piruvato de yema de telurito de
sodio huevo potasio
Cantidades 90 ml 5 ml 5 ml 1 ml
169
Preparación: Disolver el medio base y enfriar a aproximadamente 50 °C, adicionar los otros
líquidos, mezclando bien después de cada adición, distribuir de 15 ml a 20 ml del medio completo
en cajas Petri y dejar solidificar.
BAM Capítulo 12: Staphylococcus aureus
Reactivo o Medio de cultivo: Medio Baird-Parker, pH 7.0
Ingredientes:
Ingredientes Medio base Disolución de telurito de potasio-emulsión de yema de huevo

Asépticamente adicionar 5 ml de la disolución yema de huevo-telurito a 95 ml del medio base

precalentado (45 - 50) °C y mezclar, colocar de 15 ml a 20 ml del medio completo, enfriar y dejar
solidificar, secar las placas antes de usarlas. Las placas pueden almacenarse hasta 5 días a
temperatura de (20 a 25) °C.
Reactivo o medio de cultivo: Medio base de Baird-Parker
Ingredientes:
Extracto de
Ingredientes Triptona Extracto de carne Glicina
levadura
Cantidades 10.0 g 1.0 g 5.0 g 12.0 g
Ingredientes Cloruro de litio Piruvato de sodio Agar Agua

Preparación: Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitación constante y
hervir durante 1 min, esterilizar a (121 ±1) °C durante 15 min, enfriar y mantener el medio a (48 –
50) °C, enriquecimiento: Emulsión yema de huevo –telurito.
Reactivo o medio de cultivo: Agar soya-triptona (TSA)
Ingredientes:
Preparación: Disolver el agar por calentamiento y agitación, hervir 1 min, repartir en tubos o
frascos de capacidad adecuada, esterilizar 15 min a 121 °C, pH final 7.0 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo y agar de infusión cerebro-corazón (BHI).
Ingredientes:
Medio 1:
Peptona de Peptona de Cloruro de

Ingredientes Agar Agua destilada
soya caseína sodio
170
Medio 2:
Digerido
Infusión Peptona
enzimático Cloruro de
Ingredientes cerebro- Dextrosa de Na2HPO4 Agua
de tejidos sodio
corazón gelatina
animales
Preparación: Disolver el medio 1 en agua destilada con calentamiento moderado, suspender los
ingredientes del medio 2 en agua destilada y hervir por 1 min para disolver completamente,
distribuir ambos medios en tubos o botellas para almacenar, esterilizar 15 min a 121 °C, pH final
7.4 ± 0.2, para preparar el agar añadir 15 g de agar a 1 L de medio BHI, calentar para disolver
completamente, distribuir en botellas o frascos para almacenar, esterilizar 15 min a 121 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Agar DNAsa azul de toluidina.
Ingredientes:
Azul de TRIS Agua

Ingredientes DNA Agar CaCl2 (anhidro) NaCl
toloudina aminometano destilada
Cantidades 0.3 g 10.0 g 1.1 mg 10.0 g 0.083 g 6.1 g 1 000 ml
Preparación: Disolver el TRIS en 1 L de agua destilada, ajustar el pH a 9.0, adicionar el resto de

los ingredientes menos el azul de tolouidina, disolver por calentamiento; disolver el azul de
toluidina en el medio, distribuir en tubos con rosca. No es necesario esterilizar si se utiliza
inmediatamente; el medio estéril es estable por 4 meses a temperatura ambiente.
Reactivo o medio de cultivo: Agar triptona extracto de levadura
Ingredientes:
Extracto de Morado de Agua

Ingredientes Triptona Carbohidrato Agar
Preparación: Disolver el agar con calentamiento y agitación, ajustar el pH a 7.0 ± 0.2, llenar 2/3 de
tubos de 16 mm x 125 mm, esterilizar por 20 min a 115 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Buffer fosfato salino 0.02 M (pH 7.3 - 7.4)
Ingredientes:
Disolución stock 1:
171
Ingredientes Na2HPO4 (anhidro) NaCl Agua destilada

Disolución stock 2:
Ingredientes NaH2PO4·H2O (monohidratado) NaCl Agua destilada

Preparación: Para obtener el buffer (0.85 %), tomar diluciones 1:10 de cada disolución stock.
Se usan los mismos medios y reactivos descritos para la metodología de cuenta directa (BAM
Capítulo 12: Staphylococcus aureus) previamente descrita. Adicionalmente:
Medio de cultivo: Caldo soya tripticasa conteniendo 10 % NaCl y 1 % piruvato de sodio (M154a).
Ingredientes:
Peptona de
Fitona Cloruro Fosfato Piruvato Agua
Ingredientes tripticasa Dextrosa
(soytona) de sodio dipotásico de sodio destilada
(triptona)
Preparación: El caldo deshidratado de tripticasa o tripti soya es adecuado si se adiciona con 95 g

de NaCl y 10 g de piruvato de sodio por litro. Verter 10 ml dentro de tubos 16 mm x 150 mm,
esterilizar en autoclave por 15 min a 121 ºC, pH final, 7.3 ± 0.2, almacenar hasta un mes a 4 °C ±
1°C.
4.4 Salmonella spp.
NOM-114-SSA1-1994
Reactivo o medio de cultivo: Agua de peptona tamponada.
Ingredientes:
Fosfato
Fosfato sódico
Ingredientes Peptona Cloruro sódico potásico Agua
dibásico
monobásico
Preparación: Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario, ajustar el pH, si es

necesario, después de la esterilización a 7.0. Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables con la
172
capacidad necesaria para obtener las porciones necesarias para la prueba, esterilizar por 20 min a
121 °C ± 1 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo lactosado.
Ingredientes:
Ingredientes Extracto de carne Peptona Lactosa Agua destilada

Preparación: Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65 °C, distribuir en porciones de 225
ml, en frascos de 500 ml, esterilizar durante 15 min a 121 °C ± 1 °C, pH final: 6.9 ± 0.2 a 25°C.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo selenito-cistina.
Ingredientes:
Selenito
Triptona o Fosfato
Ingredientes Lactosa ácido de L-cistina Agua destilada
polipeptona disódico
sodio
Preparación: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y distribuir en

volúmenes de 10 ml y 225 ml en recipientes estériles, según se requiera; el caldo así preparado es
transparente. De preferencia usarlo el mismo día de su preparación, si se desea conservar el medio
por varios días, puede exponerse al calor en autoclave por 5 min a 110 °C ± 1 °C, tomando entonces
un color salmón, pH final: 7.0 ± 0.2 a 25 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo tetrationato.
Ingredientes:
Ingredientes Proteosa Sales biliares Carbonato de Tiosulfato de Agua

peptona o calcio sodio destilada
triptona pentahidratado
Preparación: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril, distribuir, agitando
constantemente, en porciones de 10 ml y 225 ml, en recipientes estériles, guardar en refrigeración.
Antes de usar el medio, agregar 2 ml de una disolución yodo-yoduro y 1 ml de disolución de verde
brillante al 0.1 % por cada 100 ml de caldo; el medio una vez adicionado de yodo no debe
calentarse y debe usarse el mismo día de su preparación, pH final: 7.0 ± 0.1.
Reactivo o medio de cultivo: Vassiliadis-Rappaport.
Ingredientes:
Disolución A:
173
Fosfato de potasio
Ingredientes Triptona Cloruro de sodio Agua destilada
dihidrogenado
Disolución B:
Ingredientes Cloruro de magnesio hexahidratado Agua destilada

Cantidades 400 g 1 000 ml
Disolución C:
Oxalato de verde de
malaquita
Medio completo:
Ingredientes Disolución A Disolución B Disolución

Cantidades 1 000 ml 100 ml 10 ml
Preparación: Disolución A: Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70 °C.
Disolución B: Disolver el cloruro de magnesio en agua. Como esta sal es muy higroscópica es
conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio desde un recipiente recientemente
abierto de tal modo que la concentración de la disolución sea de 0.4 g/ml. Conservar en frasco
ámbar a temperatura ambiente. Disolución C: Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua,
conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. Medio completo: Adicionar 1 000 ml de la
disolución A, 100 ml de la disolución B y 10 ml de la disolución C; ajustar el pH si es necesario, de
tal manera que después de la esterilización sea de 5.2; distribuir antes de usar dentro de tubos en
cantidades de 10 ml, almacenar en refrigeración.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de soya tripticasa.
Ingredientes:
Tripticasa o Cloruro de
Ingredientes Fitona Glucosa Agua destilada
triptosa sodio
Preparación: Disolver los ingredientes en 1 litro de agua destilada, calentando lentamente hasta su
disolución completa, distribuir porciones de 225 ml dentro de matraces de 500 ml y esterilizar en
autoclave durante 15 min a 121 °C ± 1 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Leche descremada reconstituida.
174
Ingredientes: Leche en polvo, agua.
Preparación: Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada, agitar
circularmente hasta disolución, distribuir en volúmenes de 225 ml en matraces Erlenmeyer de 500
ml, esterilizar a 121 °C ± 1 °C por 15 min. El volumen final debe corregirse para mantener 225 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de potasio.
Ingredientes:
Ingredientes Caldo soya tripticasa Sulfito de potasio

Cantidades 1 000 ml 5.0 g
Preparación: Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito de potasio por cada 1 000 ml de
medio, quedando una concentración final de sulfito de potasio del 0.5 %. Adicionar el sulfito de
potasio antes de esterilizar en autoclave en la forma habitual.
Reactivo o medio de cultivo: Agar verde brillante (VB).
Ingredientes:
Polipeptona
Ingredientes (Proteosa Lactosa Sacarosa
levadura sodio
peptona No. 3)
Ingredientes Rojo de fenol Agar Verde brillante Agua destilada
Preparación: Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullición, hasta
disolución completa, ajustar el pH. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C ± 1 °C; el
sobrecalentamiento del medio disminuye su selectividad, enfriar el medio a 50 °C y distribuirlo en
cajas de Petri estériles; el aspecto del medio es obscuro, de color marrón. pH final: 6.9 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar con sulfito de bismuto.
Ingredientes:
Fosfato Sulfato
Extracto de Mezcla de
Ingredientes Glucosa disódico ferroso
carne de res peptonas
(anhidro) (anhidro)
Ingredientes Sulfito de Verde brillante Agar Agua destilada

175
bismuto
Preparación: Suspender los ingredientes en un litro de agua, calentar hasta su disolución completa,
agitando frecuentemente, ajustar el pH, enfriar a 45 °C y verter en cajas de Petri estériles,
distribuyendo de manera homogénea el precipitado propio del medio. El aspecto de las placas es
opaco, de color verde pálido y deben usarse el mismo día de su preparación, si la coloración es
parda, no deben utilizarse; el medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta
su selectividad, pH final: 7.6 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD).
Ingredientes:
Ingredientes Xilosa L-lisina Lactosa Sacarosa
sodio levadura
Citrato
Rojo de Desoxicolato Tiosulfato Agua
Ingredientes Agar férrico-
fenol de sodio de sodio destilada
amónico
Preparación: Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar en baño de agua a
55 °C, agitando frecuentemente, hasta disolución completa, ajustar el pH, enfriar a 50 °C y verter en
cajas de Petri estériles, no se esterilice. El sobrecalentamiento produce una precipitación; la
reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las colonias suelen ser muy pequeñas; el aspecto
del medio es claro y de color rojo brillante, pH final: 6.9 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar para Salmonella y Shigella (SS).
Ingredientes:
Citrato de Tiosulfato de
Extracto de Sales
Ingredientes Polipeptona Lactosa sodio sodio
carne biliares
dihidratado pentahidratado
Ingredientes Citrato férrico Agar Rojo neutro Verde brillante Agua destilada
Cantidades 1.0 g 13.5 g 0.025 g 0.330 mg 1 000 ml
Preparación: Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y calentar a ebullición
hasta disolución completa, ajustar el pH, no esterilizar en autoclave, enfriar a 50 °C y distribuir en
176
cajas de Petri estériles en condiciones asépticas, el aspecto del medio fundido es claro y de color
rosado, pH final: 7.0 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar entérico Hektoen.
Ingredientes:
Extracto
Proteosa Sales Cloruro
Ingredientes de Lactosa Sacarosa Salicina
peptona biliares de sodio
levadura
Citrato
Tiosulfato Azul de Fuscina
Ingredientes amónico Agar Agua
de sodio bromotimol ácida
férrico
Preparación: Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir con agitación hasta completa
disolución del agar, no sobrecalentar, dejar enfriar a 55 °C -60 °C y distribuir en cajas de Petri
estériles en condiciones asépticas, pH final: 7.5 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar de tres azúcares y hierro (TSI).
Ingredientes:
Peptona de Peptona de Cloruro de

Ingredientes Lactosa Sacarosa Glucosa
carne caseína sodio
Sulfato ferroso
Rojo de Tiosulfato de Agua
Ingredientes Agar amónico
fenol sodio destilada
pentahidratado
Cantidades 1.3 g 2.5 mg 20.0 mg 20.0 mg 100 ml
Preparación: Suspender los ingredientes en 100 ml de agua destilada, calentar a ebullición,

agitando ocasionalmente, hasta disolución completa, enfriar a 60 °C y ajustar el pH, distribuir en
volúmenes de 3 ml en tubos de 13 mm x 100 mm y esterilizar a 121 °C ± 1 °C durante 15 min,
inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y una
profundidad de 4 cm; el medio es de color rojo, pH final: 7.3 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar de hierro y lisina (LIA).
Ingredientes:
Peptona de Extracto de Citrato férrico

Ingredientes Glucosa L-lisina
gelatina levadura amónico
177
Cantidades 0.5 g 0.3 g 0.1 g 1.0 g 50.0 mg
Tiosulfato de Púrpura de
sodio anhidro bromocresol
Cantidades 4.0 mg 2.0 mg 1.5 g 100 ml
Preparación: Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta
ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa, ajustar el pH, distribuir
en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 mm x 100 mm, con tapón de rosca, esterilizar en autoclave a
121 °C ± 1 °C durante 12 min, dejar que los tubos se enfríen en posición inclinada, de tal modo que
se obtengan columnas de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm, el medio ya preparado
es de color púrpura, pH final: 6.7 ± 0.2.
Ingredientes:
Ingredientes Extracto de carne Peptona Agar Agua destilada

Preparación: Suspender los ingredientes en agua, dejar reposar de 5 min a 10 min, calentar a
ebullición hasta disolución completa, distribuir en tubos de 13 mm x 100 mm, en cantidades de 1/3
de su volumen, esterilizar a (121 ± 1) °C por 15 min, inclinar los tubos antes que el agar solidifique,
pH final: 6.8 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Medio de SIM (para sulfuro, indol y movilidad).
Ingredientes:
Extracto de Hierro Tiosulfato de

carne peptonizado sodio
Preparación: Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando

frecuentemente hasta lograr una disolución completa, enfriar a 50 °C y ajustar el pH, distribuir el
medio en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 mm x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121 °C ± 1
°C durante 15 min, se dejan enfriar los tubos en posición vertical, pH final: 7.3 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar citrato de Simmons.
Ingredientes:
Fosfato Sulfato
Fosfato Cloruro Citrato de Azul de Agua
Ingredientes de de Agar
dipotásico de sodio sodio bromotimol destilada
amonio magnesio
15.0
Cantidades 1.0 g 1.0 g 5.0 g 2 0.2 g 0.08 g 1 000 ml
g
178

frecuentemente hasta lograr una disolución completa, ajustar el pH final: 6.8 ± 0.2, distribuir el
°C durante 15 min, dejar enfriar los tubos en posición inclinada.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer).
Ingredientes:
Difosfato de
Ingredientes Peptona Dextrosa Agua destilada
potasio

°C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo manitol.
Ingredientes:
Extracto de Proteosa Cloruro de Rojo de

Ingredientes Manitol Agua
carne peptona sodio fenol
Preparación: Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro de agua, mezclar y ajustar el pH,
distribuir en volúmenes de 2 ml a 3 ml en tubos de 13 mm x 100 mm, esterilizar a 121 °C ± 1 °C
durante 15 min, pH final: 7.4 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo malonato.
Ingredientes:
Extracto de Sulfato de Fosfato Fosfato Cloruro de

Ingredientes
levadura amonio dipotásico monopotásico sodio
Ingredientes Malonato Glucosa Azul de bromotimol Agua

Preparación: Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH, distribuir en tubos de 13
mm x 100 mm en cantidades de 3 ml, esterilizar en autoclave a (121 ± 1) °C durante 15 min, pH
final: 6.7 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo urea.
Ingredientes:
179
Extracto de Fosfato Fosfato

Ingredientes Urea Rojo de fenol Agua
levadura monopotásico disódico
Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR. Esterilizar por

filtración a través de membrana 0.45 μm o en autoclave de 5 lb a 8 lb de presión durante 15 min,
distribuir asépticamente de 1.5 ml a 3 ml en tubos estériles de 13 mm x 100 mm, pH final: 6.8 ±
0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de urea rápido.
Ingredientes:
Extracto de Fosfato Fosfato

Ingredientes Urea Rojo de fenol
levadura monopotásico disódico
Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR. Esterilizar por

filtración a través de membrana 0.45 μm, distribuir asépticamente de 1.5 ml a 3 ml en tubos
estériles de 13 mm x 100 mm, pH final: 6.8 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo infusión cerebro corazón.
Ingredientes:
Infusión
Infusión Fosfato
de Proteosa Cloruro Agua
Ingredientes cerebro disódico Dextrosa
corazón peptona de sodio destilada
corazón dodecahidratado
de res
Cantidades 200 g 250 g 10.0 g 5.0 g 2.5 g 2.0 g 1000 ml
Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada, calentar suavemente, distribuir y

esterilizar a 121 °C ± 1 °C durante 15 min, pH final: 7.4 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución verde brillante al 0.1 % (1:1000).
Ingredientes:
Ingredientes Verde brillante Agua destilada estéril

Preparación: Disolver 0.1 g de verde brillante en agua destilada estéril hasta completar 100 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de yodo-yoduro.
Ingredientes:
Ingredientes Cristales de yodo Yoduro de potasio Agua destilada
180
Preparación: Disolver los cristales y el yoduro de potasio en agua destilada hasta completar 100
ml, conservar en frasco ámbar.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución salina al 0.85 %
Ingredientes:
Ingredientes Cloruro de sodio Agua destilada

Preparación: Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121 °C ± 1 °C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución salina formalizada.
Ingredientes:
Ingredientes Disolución de Cloruro de sodio Agua destilada

formaldehído (36 %-38
%)
Cantidades 6.0 ml 8.5 g 1 000 ml
Preparación: Disolver 8.5 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua destilada, esterilizar a 121 °C ±
1 °C durante 15 min, enfriar a temperatura ambiente, adicionar 6 ml de la disolución de
formaldehído, no esterilizar después de la adición de formaldehído.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo de Kovac.
Ingredientes:
Ingredientes p-dimetil-aminobenzaldehído Alcohol Ácido clorhídrico

amílico concentrado
Preparación: Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehído en el alcohol amílico y después agregar el

ácido clorhídrico lentamente, conservar en frasco ámbar en refrigeración.
Reactivo o Medio de cultivo: Disolución de alfa-naftol al 5 %.
Ingredientes:
Ingredientes Alfa-naftol Alcohol

Preparación: Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta completar 100 ml.
181
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de rojo de metilo.
Ingredientes:
Ingredientes Rojo de metilo Alcohol etílico Agua destilada c.b.p.

Preparación: Disolver el rojo de metilo en el alcohol etílico y adicionar agua hasta completar 500
ml.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de hidróxido de potasio al 40 %.
Ingredientes:

Preparación: Disolver 40 g de hidróxido de potasio en agua hasta completar 100 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de gelatinasa al 5 %.
Ingredientes:
Ingredientes Gelatinasa Agua

Preparación: Disolver 5 g de gelatinasa en 100 ml de agua destilada. NO CALENTAR.
UNE-EN ISO 6579:2003
Ingredientes:
Fosfato
Digestato Cloruro Fosfato ácido de
diácido de
Ingredientes enzimático de sódico sodio dodecahidrato Agua
potasio
caseína (NaCl) (Na2HPO4·12H2O
(KH2PO4)
Preparación: Se disuelven en agua los componentes, calentando si es necesario. Se ajusta el pH si

es necesario, de tal manera que tras la esterilización sea de 7.0 ± 0.2 a 25 °C, se vierte el medio en
matraces de capacidades adecuadas para obtener alícuotas apropiadas para el ensayo, se esteriliza en
la autoclave a 121 ° C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Medio de Rappaport-Vassiliadis con soya (caldo RVS).
Ingredientes: Disolución A:
182
Digerido Fosfato diácido Fosfato ácido

Cloruro
Ingredientes enzimático de de potasio de potasio Agua
sódico
soya (KH2PO4) (K2HPO4)
Disolución B:
Cloruro de magnesio hexahidratado

Ingredientes Agua
(MgCl2.6H2O)
Disolución C:
Ingredientes Oxalato verde de malaquita Agua

Medio completo:
Ingredientes Disolución A Disolución B Disolución C

Preparación: Disolución A: se disuelven los componentes en el agua calentando a unos 70 °C si

fuera necesario; la disolución debe prepararse en el mismo día que se prepare el medio RVS
completo. Disolución B: Se disuelve el cloruro de magnesio en el agua; como esta sal es muy
higroscópica, se aconseja disolver el contenido entero de un recipiente recién abierto de MgCl2
6H2O siguiendo la formulación. Por ejemplo, 250 g de MgCl2.6H2O se añaden a 625 ml de agua,
dando una disolución con un volumen total de 788 ml y una concentración en peso de unos 31.7 g
por 100 ml de MgCl2.6H2O. La disolución puede mantenerse en frascos de vidrio de color ámbar
bien cerrados y a temperatura ambiente durante 2 años como mínimo. Disolución C: Se disuelve el
oxalato verde de malaquita en el agua. La disolución puede mantenerse en frascos de vidrio de color
ámbar a temperatura ambiente durante 8 meses como mínimo. Medio completo: Se añaden a 1 000
ml de la disolución A, 100 ml de la disolución B y 10 ml de la disolución C, se ajusta el pH, si fuera
necesario, de manera que después de la esterilización sea de 5.2 ± 0.2, antes de su uso se reparte en
tubos de ensayo en cantidades de 10 ml, se esteriliza durante 15 min en el autoclave ajustado a 115
°C, se almacena el medio preparado a 3 °C ± 2 °C; el medio ha de utilizarse el día de su
preparación, la composición final del medio es: digerido enzimático de soya, 4.5 g/l; cloruro sódico,
7.2 g/l; fosfato diácido de potasio (KH2PO4 + K2HPO4), 1.44 g/l; cloruro de magnesio anhidro
(MgCl2), 13.4 g/l o cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2·6H2O), 28.6 g/l; oxalato verde de
malaquita, 0.036 g/l.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de Muller-Kauffmann tetrationato novobiocina (MKTTn) -

medio base.
Ingredientes:
183
Digerido
Cloruro sódico Carbonato cálcico
Ingredientes Extracto de carne enzimático de
(NaCl) (CaCO3)
caseína
Tiosulfato sódico
Bilis de buey para
Ingredientes pentahidrato Verde brillante Agua
uso bacteriológico
(Na2S2O3 · 5H20)
Cantidades 47.8 g 4.78 g 9.6 mg 1 000 ml
Preparación: Se disuelven los componentes básicos deshidratados o el medio completo

deshidratado en el agua mediante ebullición durante 5 min, se ajusta el pH, si fuera necesario, de
manera que sea de 8.2 ± 0.2 a 25 °C, se mezcla el medio completamente. El medio base puede ser
almacenado durante 4 semanas a 3 °C ± 2 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de yodo-yoduro.
Ingredientes:
Ingredientes Yodo Yoduro potásico (KI) Agua

Preparación: Se disuelve completamente el yoduro potásico en 10 ml de agua, luego se añade el

yodo y se diluye hasta 100 ml con agua estéril, no calentar, se almacena la disolución preparada en
la oscuridad a temperatura ambiente en un recipiente herméticamente cerrado.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de novobiocina.
Ingredientes:
Ingredientes Sal sódica de novobiocina Agua

Preparación: Se disuelve la sal sódica de novobiocina en el agua y se esteriliza por filtración. Se

puede almacenar hasta 4 semanas a 3 °C ± 2 °C.
Reactivo o Medio de cultivo: Caldo de Muller-Kauffmann tetrationato novobiocina (MKTTn) -

medio completo.
Ingredientes:
Disolución yodo- Disolución de

yoduro novobiocina
Cantidades 1000 ml 20.0 ml 5.0 ml
184
Preparación: Se añaden asépticamente 5 ml de la disolución de novobiocina a 1 000 ml del medio

base, se mezcla y luego se añaden 2 ml de la disolución yodo-yoduro, se mezcla bien, se reparte el
medio asépticamente en matraces estériles de capacidad adecuada para obtener las porciones
necesarias para los análisis, el medio completo debe utilizarse el día de su preparación.
Reactivo o medio de cultivo: Agar xilosa lisina desoxicolato (agar XLD).
Ingredientes:
Extracto de Cloruro
Hidrocloruro
Ingredientes levadura en sódico Xilosa Lactosa Sacarosa
de L-Lisina
polvo (NaCl)
Citrato
Tiosulfato Desoxicolato
Ingredientes amónico de Rojo fenol Agar Agua
sódico sódico
hierro (III)
Cantidades 6.8 g 0.8 g 0.08 g 1.0 g De (9 a 18) g 1 000 ml
Preparación: Se disuelven los componentes básicos deshidratados o el medio base completo

deshidratado en el agua mediante calentamiento, con agitación frecuente, hasta que el medio
comience a hervir, ha de evitarse el sobrecalentamiento, se ajusta el pH, si fuera necesario, de
manera que después de la esterilización sea de 7.4 ± 0.2 a 25 °C, se vierte el medio en tubos o
matraces de capacidad adecuada, se calienta con agitación frecuente hasta que el medio hierva y se
disuelva el agar, no sobrecalentar.
Ingredientes:

Cantidades 3.0 g 5.0 g De 9.0 g a 18.0 g 1 000 ml
Preparación: Se disuelven los componentes o el medio completo deshidratado en el agua,

calentando si fuera necesario, se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la
esterilización sea de 7.0 ± 0.2 a 25 °C, se reparte el medio de cultivo a tubos o frascos de capacidad
adecuada, se esteriliza en autoclave regulado a 121 °C durante 15 min.
Reactivo o mdio de cultivo: Agar triple azúcar hierro (agar TSI).
Ingredientes:
Extracto de Extracto de Cloruro sódico

Ingredientes Peptona Lactosa
carne levadura (NaCl)
Ingredientes Glucosa Citrato de Tiosulfato Rojo fenol Agar Agua

185
hierro (III) sódico
De 9.0 g a
18.0 g
Preparación: Se disuelven los componentes o el medio completo deshidratado en el agua,

calentando si fuera necesario, se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la
esterilización sea de 7.4 ± 0.2 a 25 °C, se reparte el medio en tubos de ensayo o placas en
cantidades de 10 ml, se esteriliza en autoclave regulado a 121 °C durante 15 min, se deja reposar en
posición inclinada de manera que se obtenga una parte profunda de unos 2.5 cm a 5 cm.
Reactivo o medio de cultivo: Agar urea (Christensen) - Medio base.
Ingredientes:
Fosfato
Cloruro
diácido de
Ingredientes Peptona Glucosa sódico Rojo fenol Agar Agua
potasio
(NaCl)
(KH2PO4)
De 9 g 1 000
a 18 g ml
Preparación: Se disuelven los componentes o la base completa deshidratada en el agua, calentando

si fuera necesario, se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea
de 6.8 ± 0.2 a 25 °C, se esteriliza en autoclave regulado a 121 °C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Agar urea (Christensen) - Disolución de urea.
Ingredientes:
Ingredientes Urea Agua

Cantidades 400.0 g Cantidad suficiente para un volumen final de 1 000 ml
Preparación: Se disuelve la urea en el agua, se esteriliza por filtración y se comprueba la

esterilidad. Véase la Norma ISO 7218: 1996.
Reactivo o medio de cultivo: Agar urea (Christensen) - Medio completo.
Ingredientes:
Ingredientes Medio base Disolución de urea

Cantidades 950 ml 50 ml
Preparación: Se añade, en condiciones asépticas, la disolución de urea a la base, fundida

previamente y luego enfriada entre 44 °C y 47 °C; se reparte el medio completo en tubos estériles
en cantidades de 10 ml, se deja reposar en posición inclinada.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo para la detección de la β-galactosidasa. Disolución tampón.
186
Ingredientes:
Fosfato diácido de sodio Hidróxido sódico,

Ingredientes Agua
(NaH2PO4) disolución 10 ml/l
Para un volumen
Cantidades 6.9 g Unos 3 ml
final de 50 ml
Preparación: Se disuelve el fosfato diácido de sodio en unos 45 ml de agua en un matraz aforado,

se ajusta el pH a 7.0 ± 0.2 a 25 °C con la disolución de hidróxido sódico, se añade agua para un
volumen final de 50 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo para la detección de la β-galactosidasa. Disolución ONPG.
Ingredientes:
Ingredientes ο-Nitrofenil β-D-galactopiranósido (ONPG) Agua

Preparación: Se disuelve el ONPG en el agua a 50 °C aproximadamente, se enfría la disolución.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo para la detección de la β-galactosidasa. Completo.
Ingredientes:
Ingredientes Disolución tampón Disolución de ONPG

Preparación: Se añade la disolución tampón a la disolución de ONPG.
Reactivo o Medio de cultivo: Reactivos para la reacción de Voges-Proskauer (VP). Medio VP.
Ingredientes:
Fosfato ácido de potasio

Ingredientes Peptona Glucosa Agua
(K2HPO4)
Preparación: Se disuelven los componentes en el agua, calentando si fuera necesario, se ajusta el

pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 6.9 ± 0.2 a 25 °C; se
reparte el medio en tubos en cantidades de 3 ml, se esteriliza en autoclave regulado a 121 °C
durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para la reacción de Voges-Proskauer (VP). Disolución de

creatina (N-amidinosarcosina).
Ingredientes:
187
Ingredientes Monohidrato de creatina Agua

Preparación: Se disuelve el monohidrato de creatina en el agua.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para la reacción de Voges-Proskauer (VP). 1-Naftol,

disolución etanólica.
Ingredientes:
Ingredientes 1-Naftol Etanol 96 % (fracción volumen)

Preparación: Se disuelve el 1-naftol en el etanol.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para la reacción de Voges-Proskauer (VP). Disolución de

hidróxido de potasio.
Ingredientes:
Ingredientes Hidróxido de potasio Agua

Preparación: Se disuelve el hidróxido de potasio en el agua.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para la reacción del indol. Medio triptona/triptófano.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona Cloruro sódico (NaCl) DL-Triptófano Agua

Preparación: Se disuelven los componentes en el agua hirviendo, se ajusta el pH, si fuera

necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7.5 ± 0.2 a 25 °C; se reparte el medio,
en cantidades de 5 ml, en los tubos, se esteriliza en autoclave regulado a 121 °C durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para la reacción del indol. Reactivo de Kovacs.
Ingredientes:
Ácido clorhídrico, ρ = 1.18 2-metil-2-

Ingredientes 4-Dimetilaminobenzaldehído
g/ml a 1.19 g/ml butanol
Preparación: Se mezclan los componentes.
188
Reactivo o medio de cultivo: Agar nutritivo semisólido.
Ingredientes:

Cantidades 3.0 g 5.0 g De 4 a 9 g 1 000 ml

pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7.0 ± 0.2 a 25 °C; se
reparte el medio en matraces de capacidad adecuada, se esteriliza en autoclave regulado a 121 °C
durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Agar nutritivo semisólido.
Ingredientes:

Cantidades 3.0 g 5.0 g De 4 g a 9 g 1 000 ml

pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7.0 ± 0.2 a 25 °C, se
reparte el medio en matraces de capacidad adecuada, se esteriliza en autoclave regulado a 121 °C
durante 15 min; se vierten unos 15 ml del medio recién preparado en placas de Petri pequeñas. No
hay que dejar que las placas se sequen.
Reactivo o Medio de cultivo: Disolución salina fisiológica.
Ingredientes:
Ingredientes Cloruro sódico (NaCl) Agua

Preparación: Se disuelve el cloruro sódico en el agua, se ajusta el pH, si fuera necesario, de

manera que después de la esterilización sea de 7.0 ± 0.2 a 25 °C, se reparten cantidades de la
disolución en matraces o tubos de manera que contengan de 90 ml a 100 ml después de la
esterilización; se esteriliza en autoclave regulado a 121 °C durante 15 min.
Reactivo o Medio de cultivo: Caldo lactosado.
Ingredientes:
Ingredientes Extracto de carne Peptona Lactosa Agua destilada

Preparación: Colocar porciones de 225 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml, esterilizar en

autoclave 15 min a 121 °C, pH final 6.9 ± 0.2.
189
Reactivo o medio de cultivo: Leche desgrasada en polvo.
Ingredientes:
Ingredientes Leche desgrasada en polvo Agua destilada

Preparación: Suspender la leche en el agua destilada, agitar hasta disolver, esterilizar en autoclave
por 15 min a 121 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo selenito cistina.
Ingredientes:
Selenito
Triptona o Fosfato
Ingredientes Lactosa ácido de L-cistina Agua
polipeptona disódico
sodio
Preparación: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y distribuir en

volúmenes de 10 ml en tubos de 16 mm x 150 mm, de preferencia usarlo el mismo día de su
preparación. NO ESTERILIZAR.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo tetrationato (TT).
Ingredientes:
Carbonato de Tiosulfato de
Ingredientes Polipeptona Sales biliares Agua destilada
calcio sodio.5H2O
Preparación: Suspender los ingredientes en agua destilada, mezclar y calentar hasta ebullición. NO
ESTERILIZAR, enfriar a 45 °C, pH final 8.4 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Vassiliadis-Rappaport.
Ingredientes:
Solución A:
Cloruro de Fosfato de potasio

Ingredientes Triptona Agua destilada
sodio dihidrogenado
Disolución B:
Ingredientes Cloruro de magnesio hexahidratado Agua destilada

190
Disolución C:
Ingredientes Oxalato de verde de malaquita Agua destilada

Medio completo:
Ingredientes Disolución A Disolución B Disolución C

Preparación: Disolución A: Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70 °C.
Disolución B: Disolver el cloruro de magnesio en agua, como esta sal es muy higroscópica es
conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio desde un recipiente recientemente
abierto de tal modo que la concentración de la disolución sea de 0.4 g/ml, conservar en frasco
ámbar a temperatura ambiente. Disolución C: Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua.
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. Medio completo: Adicionar 1 000 ml de la
disolución A, 100 ml de la disolución B y 10 ml de la disolución C, ajustar el pH si es necesario, de
tal manera que después de la esterilización sea de 5.2, distribuir antes de usar dentro de tubos en
cantidades de 10 ml, almacenar en refrigeración. Vida útil 1 mes.
Reactivo o medio de cultivo: Agar xilosa lisina desoxicolato (agar XLD).
Ingredientes:
Extracto de Cloruro
Ingredientes levadura en sódico Xilosa Lactosa Sacarosa L-Lisina
polvo (NaCl)
Citrato
Tiosulfato Desoxicolato
Ingredientes amónico de Rojo fenol Agar Agua
sódico sódico
hierro (III)
Preparación: Se disuelven los componentes básicos deshidratados en el agua mediante

calentamiento, con agitación frecuente, hasta que el medio comience a hervir, pH de 7.4 ± 0.2 a 25
°C, no sobrecalentar.
Reactivo o medio de cultivo: Agar entérico Hektoen.
Ingredientes:
Proteosa Extracto de Sales

Ingredientes Lactosa Sacarosa Salicina
peptona levadura biliares
191
Citrato
Cloruro Tiosulfato Azul de Fuscina
Ingredientes amónico Agar Agua
de sodio de sodio bromotimol ácida
férrico
Preparación: Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir con agitación hasta completa
disolución del agar, no sobrecalentar, dejar enfriar a 55 °C -60 °C y distribuir en cajas de Petri
estériles en condiciones asépticas, pH final: 7.5 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar con sulfito de bismuto.
Ingredientes:
Extracto Mezcla Fosfato Sulfato

Verde Agua
Ingredientes de carne de Dextrosa disódico de Agar
brillante destilada
de res peptonas (anhidro) bismuto
Cantidades 5.0 g 10.0 g 5.0 g 4.0 g 8.0 g 0.025 g 20.0 g 1 000 ml
Preparación: Suspender los ingredientes en un litro de agua, calentar hasta su disolución completa,
agitando frecuentemente, enfriar entre 45 °C y 50 °C y verter en cajas de Petri estériles,
distribuyendo de manera homogénea el precipitado propio del medio. El aspecto de las placas es
opaco, de color verde pálido y deben usarse el mismo día de su preparación; si la coloración es
parda, no deben utilizarse; el medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta
su selectividad, pH final: 7.7 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar triple azúcar hierro (agar TSI).
Ingredientes:
Extracto Cloruro
Extracto Peptona
Ingredientes de Peptona sódico Lactosa Sacarosa
de carne preoteosa
levadura (NaCl)
Sulfato Tiosulfato
Ingredientes Glucosa Rojo fenol Agar Agua
férrico sódico
Medio 2:
Ingredientes Polipeptona NaCl Lactosa Sacarosa Glucosa

192
Rojo Agua
Ingredientes Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O Na2S2O3 Agar
fenol destilada
Preparación: Puede utilizarse cualquiera de los dos medios. Medio 1: Se disuelven los
componentes o el medio completo deshidratado en el agua, calentando si fuera necesario, se reparte
el medio en tubos de ensayo, se esteriliza en autoclave regulado a 118 °C durante 15 min, pH 7.3 ±
0.2. Medio 2: Se prepara de la misma manera que el medio 1 pero se esteriliza en autoclave
regulado a 121 °C durante 15 min, pH 7.4 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo triptona, 1 %.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona o tripticasa Agua destilada

Preparación: Disolver y distribuir porciones de 5 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 125 mm o 16

mm x 150 mm; esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C durante 15 min, pH final 6.9 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de soya tripticasa.
Ingredientes:
Tripticasa o Cloruro de Agua

Ingredientes Fitona Glucosa K2HPO4
peptona sodio destilada
autoclave durante 15 min a 121 °C, pH final 7.3 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de soya tripticasa adicionado con sulfato de hierro.
Ingredientes:
Tripticasa Cloruro Sulfato de Agua

Ingredientes Fitona Glucosa K2HPO4
o peptona de sodio hierro destilada
Cantidades 17.0 g 3.0 g 2.5 g 5.0 g 2.5 g 35.0 mg 1 000 ml
autoclave durante 15 min a 121 °C, pH final 7.3 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo soya-triptosa tripticasa.
Ingredientes:
193
Caldo soya Extracto de

Ingredientes Caldo triptosa Agua destilada
tripticasa levadura
Preparación: Disolver ingredientes en agua destilada, calentar lentamente hasta disolver, distribuir
porciones de 5 ml en tubos de 16 mm x 150 mm, esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 °C,
pH final 7.2 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo MR-VP.
Ingredientes:
Medio 1:
Agua peptonada
Ingredientes amortiguada en Glucosa K2HP04 Agua destilada
polvo
Medio 2:
Digerido Digerido
Fosfato de
Ingredientes pancreático péptico de Dextrosa Agua destilada
potasio
de caseína tejido animal
Preparación: Disolver los ingredientes en agua con agitación y calentamiento moderado, distribuir
porciones de 10 ml en tubos de 16 mm x 150 mm, esterilizar en autoclave durante 15 min a 118 °C -
121 °C, pH final 6.9 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar citrato de Simmons.
Ingredientes:
Fosfato Citrato Sulfato

Fosfato Cloruro Azul de Agua
Ingredientes de de de Agar
dipotásico de sodio bromotimol destilada
amonio sodio magnesio

medio en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 mm x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121 °C
durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo urea.
Ingredientes:
194
Extracto de Fosfato Fosfato Rojo de

levadura monopotásico disódico fenol
Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR, esterilizar por

filtración a través de membrana 0.45 μm o en autoclave de 5 lb a 8 lb de presión durante 15 min,
distribuir asépticamente de 1.5 ml a 3 ml en tubos estériles de 13 mm x 100 mm, pH final: 6.8 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo de urea rápido.
Ingredientes:
Extracto de Fosfato Fosfato Rojo de

levadura monopotásico disódico fenol
Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada, NO CALENTAR, esterilizar por

filtración a través de membrana 0.45 μm o en autoclave de 5 lb a 8 lb de presión durante 15 min.
Distribuir asépticamente de 1.5 ml a 3 ml en tubos estériles de 13 mm x 100 mm, pH final: 6.8 ±
0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo malonato.
Ingredientes:
Extracto de Sulfato de Fosfato

Ingredientes Fosfato monopotásico
levadura amonio dipotásico
Cloruro de Malonato de Azul de

Ingredientes Glucosa Agua
sodio sodio bromotimol
Preparación: Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH, distribuir en tubos de 13
mm x 100 mm en cantidades de 3 ml, esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min, pH final:
6.7 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar de hierro y lisina (LIA).
Ingredientes:
Peptona de Extracto de Citrato férrico-

Ingredientes Glucosa L-lisina
gelatina levadura amónico
Ingredientes Tiosulfato de Púrpura de Agar Agua destilada

195
sodio anhidro bromocresol

Preparación: Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta
ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa, distribuir en volúmenes
de 4 ml en tubos de 13 mm x 100 mm, con tapón de rosca, esterilizar en autoclave a 121 °C durante
12 min, dejar que los tubos se enfríen en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas
de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm. pH final: 6.7 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo lisina descarboxilasa.
Ingredientes:

Ingredientes Peptona Glucosa L-lisina
Preparación: Calentar hasta disolver, distribuir en porciones de 5 ml en tubos con tapón de rosca
de 16 mm x 125 mm, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C, pH final 6.8 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Medio prueba de movilidad (semisólido).
Ingredientes:
Extracto de
carne
Preparación: Calentar con agitación y hervir de 1 min a 2 min hasta disolver el agar, distribuir
porciones de 20 ml en tubos de tapón de rosca de 20 mm x 150 mm, esterilizar en autoclave por 15
min a 121 °C, enfriar a 45 °C, pH final 7.4 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo cianuro de potasio (KCN).
Ingredientes:
Proteasa
Cianuro de
peptona N°
Ingredientes potasio NaCl KH2PO4 Na2HPO4 Agua destilada
3o
(KCN)
polipeptona
Preparación: Disolver los ingredientes excepto el cianuro de potasio, esterilizar en autoclave por
15 min a 121 °C, enfriar y refrigerar entre 5 °C y 8 °C, pH final 7.6 ± 0.2. Preparar el KCN
disolviendo 0.5 g de KCN en 100 ml de agua destilada estéril y a una temperatura entre 5 °C y 8 °C,
pipetear 15 ml de la disolución fría de KCN a 1 L del medio base estéril y frío, mezclar y distribuir
porciones de 1 ml -1.5 ml en tubos de ensayo estériles, utilizando una técnica aséptica tapar los
196
tubos con tapones de corcho impregnados con parafina, almacenar los tubos a 5 °C -8 °C, no
pipetear con la boca, usar guantes, no almacenar por más de 2 semanas.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo Rojo de fenol para fermentación de carbohidratos.
Ingredientes:
Tripticasa o
Extracto de
preteosa de Agua
Ingredientes NaCl carne Rojo fenol Carbohidrato
peptona N° destilada
(opcional)
3
5 g dulcitol o 10
Cantidades 10.0 g 5.0 g 1.0 g 0.018 g 1 000 ml g lactosa o 10 g
sacarosa
Preparación: Distribuir porciones de 2.5 ml en tubos de 13 mm x 100 mm con tubos de

fermentación invertidos de 6 mm x 50 mm, esterilizar en autoclave por 10 min a 118 °C, pH final
7.4 ± 0.2.
Ingredientes:
Peptona de Extracto de Púrpura de Agua

Ingredientes NaCl
proteosa N° 3 carne bromocresol destilada
Preparación: Distribuir porciones de 2.5 ml en tubos de 13 mm x 100 mm con tubos de

fermentación invertidos de 6 mm x 50 mm, esterilizar en autoclave por 10 min a 118 °C, pH final
7.4 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar MacConkey.
Ingredientes:
Peptona de
Sales biliares
Ingredientes proteosa o Peptona Lactosa NaCl
N° 3
polipeptona
Ingredientes Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua destilada

Preparación: Suspender los ingredientes y calentar con agitación hasta disolver, hervir de 1 min - 2
min, se esteriliza en autoclave regulado a 121 °C durante 15 min, enfriar de 45 °C a 50 °C y colocar
porciones de 20 ml en cajas Petri estériles, secar a temperatura ambiente sin la tapa cerrada, pH
final 7.1 ± 0.2, no usar placas mojadas.
197
Reactivo o medio de cultivo: Caldo nutritivo.
Ingredientes:
Ingredientes Extracto de carne Peptona Agua destilada

Preparación: Calentar hasta disolver, distribuir porciones de 10 ml en tubos o porciones de 250 ml

en matraces Erlenmeyer de 500 ml, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C, pH final 6.8 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo y agar de infusión cerebro-corazón (BHI).
Ingredientes:
Medio 1:
Infusión de Infusión de Cloruro

Mezcla de Agua
Ingredientes cerebro de corazón de de Na2HPO4 Dextrosa
peptonas destilada
ternera res sodio
A partir de A partir de
200 g 250 g
Medio 2:
Digerido
Infusión
enzimático Cloruro Peptona de Agua
Ingredientes cerebro- Dextrosa Na2HPO4
de tejidos de sodio gelatina destilada
corazón
animales
Preparación: Disolver el medio 1 en agua destilada con calentamiento moderado, suspender los
ingredientes del medio 2 en agua destilada y hervir por 1 min para disolver completamente,
distribuir ambos medios en tubos o botellas para almacenar, esterilizar por 15 min a 121 °C, pH
final 7.4 ± 0.2. Para preparar el agar añadir 15 g de agar a 1 L de medio BHI, calentar para disolver
completamente, distribuir en botellas o frascos para almacenar, esterilizar por 15 min a 121 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de papaína al 5 %.
Ingredientes:
Ingredientes Papaína Agua destilada

Preparación: Adicionar la papaína estéril al agua destilada y agitar hasta disolver completamente,
distribuir porciones de 100 ml en frascos.
198
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de celulasa.
Ingredientes:
Ingredientes Celulasa Agua destilada

Preparación: Disolver la celulasa en 99 ml de agua destilada estéril, esterilizar por filtración

utilizando papel filtro de 0.45 µm, almacenar a 2 °C -5° C por 2 semanas.
Reactivo o medio de cultivo: Agar base sangre triptosa.
Ingredientes:
Agua
Ingredientes Triptosa Extracto de carne NaCl Agar
destilada
Preparación: Suspender los ingredientes en el agua destilada, mezclar y calentar agitando

ocasionalmente, hervir cerca de 1 min, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C, dejar que los
tubos se enfríen en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm-5
cm y una superficie inclinada de 2 cm-3 cm.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo preenriquecimiento universal.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona Proteasa peptona KH2PO4 NaCl Dextrosa

Citrato de amonio
Ingredientes MgSO4 Piruvato de sodio Agua destilada
férrico
Preparación: Calentar con agitación hasta disolver, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C,
pH final 6.3 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo preenriquecimiento universal (sin citrato de amonio férrico).
Ingredientes:
Proteasa Piruvato Agua

Ingredientes Triptona KH2PO4 Na2HPO4 NaCl Dextrosa MgSO4
peptona de sodio destilada
1 000
Cantidades 5.0 g 5.0 g 15.0 g 7.0 g 5.0 g 0.5 g 0.25 g 0.2 g
ml
199
Preparación: Calentar con agitación hasta disolver, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C,
pH final 6.3Reactivo o medio de cultivo: Agua peptonada amortiguada.
Ingredientes:
Cloruro de Fosfato Fosfato mono

sodio disódico potásico
Preparación: Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C, pH final 7.2 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo Dey-Engley.
Ingredientes:
Extracto de Tioglicolato de Tiosulfato de

Ingredientes Triptona Glucosa
levadura sodio sodio
Bisulfito de Lecitina de Púrpura de

Ingredientes Polisorbato 80 Agua destilada
sodio soya bromocresol
Preparación: Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C, pH final 7.6 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Dilución de cloro, 200 mg/L, conteniendo sulfato de sodio dodecil al
0.1 %.
Ingredientes:
Blanqueador comercial Agua destilada (conteniendo 1.0

Ingredientes
(hipoclorito de sodio al 5.25 %) g de sulfato de sodio dodecil)
Preparación: Disolver el sulfato de sodio dodecil en el agua destilada, adicionar el blanqueador

comercial y mezclar, preparar inmediatamente antes de usar.
Reactivo o medio de cultivo: Etanol al 70 %.
Ingredientes:
Ingredientes Etanol al 95 % Agua destilada

Lo necesario para completar el volumen
Cantidades 700.0 ml
final de 960 ml
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo de Kovac.
Ingredientes:
200
Alcohol Ácido clorhídrico

Ingredientes p-dimetil-aminobenzaldehído
amílico concentrado
Preparación: Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehído en el alcohol amílico y después agregar el

ácido clorhídrico lentamente, conservar en frasco ámbar en refrigeración. Para la prueba de indol,
adicionar 0.2 ml-0.3 ml del reactivo a 5 ml del medio triptona de 24 h de cultivo.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivos para la prueba de Voges-Proskauer (VP).
Ingredientes:
Disolución 1:
Ingredientes α-Naftol Alcohol (absoluto) Ácido clorhídrico concentrado

Cantidades 5.0 g 100 ml 25.0 ml
Disolución 2:
Ácido clorhídrico
concentrado
Cantidades 40.0 g Para hacer 100 ml 25.0 ml
Preparación: Prueba de Voges-Proskauer (VP): Transferir 1 ml del cultivo de 48 h a un tubo de

ensayo y añadir 0.6 ml de la disolución 1 y 0.2 ml de la disolución 2, agitar después de la aplicación
de cada disolución. Para intensificar y apresurar la reacción, añadir unos cristales de creatina a la
mezcla, dejar a temperatura ambiente, leer resultados a 4 h después de haber agregado los reactivos.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de hidróxido de potasio al 40 %.
Ingredientes:
Ingredientes KOH Agua destilada

Cantidades 40.0 g Para hacer 100 ml
Preparación: No se especifíca.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de hidróxido de sodio 1N.
Ingredientes:
Ingredientes NaOH Agua destilada

Cantidades 40.0 g Para hacer 100 ml
Preparación: No se especifíca, unicamente se establece que su uso es para ajustar el pH del medio
de cultivo.
Reactivo o medio de cultivo: Ácido clorhídrico 1 N.

201
Ingredientes:
Ingredientes HCl (concentrado) Agua destilada

Cantidades 89.0 ml Para hacer 100 ml
Preparación: No se especifíca.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución colorante verde brillante al 1 %.
Ingredientes:
Ingredientes Tinta verde brillante Agua destilada (estéril)

Preparación: Disolver 1 g del colorante en el agua destilada estéril, diluirse a 100 ml. Antes de
usar, probar la toxicidad con todos los lotes de tinte con microorganismos de ensayo positivos y
negativos.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución colorante púrpura de bromocresol al 0.2 %.
Ingredientes:
Ingredientes Tinta púrpura de bromocresol Agua destilada

Preparación: Disolver 0.2 g del colorante en el agua destilada, diluir a 100 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Indicador rojo de metilo
Ingredientes:
Ingredientes Rojo de metilo Etanol al 95 % Agua destilada

Cantidades 0.1 g 300 ml Para hacer 500 ml
Preparación: Disolver el rojo de metilo en el etanol, ajustar el volumen a 500 ml con agua
destilada.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución salina fisiológica al 0.85 % (estéril).
Ingredientes:

Preparación: Disolver el NaCl en el agua, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C, almacenar
a temperatura ambiente.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución salina fisiológica formalinizada.

202
Ingredientes:
Disolución de
Ingredientes formaldehído (36 %-38 NaCl Agua destilada
%)
Cantidades 6.0 ml 8.5 ml 1 000 ml
Preparación: Disolver el NaCl en el agua destilada, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C,
enfriar a temperatura ambiente, adicionar la disolución de formaldehído; no esterilizar en autoclave
después de adicionar el formaldehído.
4.5 Vibrio
NOM-242-SSA1-2009
Medio de cultivo: Agua peptonada alcalina (APW).
Ingredientes:

Preparación: Disolver los ingredientes, ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar sea de
8.5, esterilizar en autoclave a 121 °C durante 10 minutos.
Medio de cultivo: Agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS).
Ingredientes:
Extracto de Tiosulfato de Sales Citrato de

Ingredientes Peptona Sacarosa
levadura sodio .5H2O biliares sodio.2H2O
Bilis de Citrato Azul de Azul de Agua

Ingredientes NaCl Agar
buey férrico bromotimol timol destilada
Preparación: Preparar en un matraz por lo menos 3 veces más grande que el volumen requerido de
medio, adicionar los ingredientes en agua destilada tibia y calentar con agitación constante hasta
ebullición e inmediatamente retirar del calor, no esterilizar, enfriar a 50 °C y colocar en cajas Petri,
dejar secar las placas de 37 °C -45 °C antes de usar.
Medio de cultivo: Agar modificado de celobiosa, polimixina B y colistina (mCPC).
Ingredientes:
203
Disolución
Extracto de Stock de Agua
Ingredientes Peptona NaCl Agar
carne colorante 1 destilada
000 X
Cantidades 10.0 g 5.0 g 20.0 g 1 ml 15.0 g 900 ml
Preparación: Ajustar el pH a 7.6, hierva hasta que se disuelva el agar, esterilizar por autoclave
durante 15 min a 121 °C, enfriar entre 48 °C -55 °C.
Medio de cultivo: Disolución stock de colorantes 1 000 X.
Ingredientes:
Ingredientes Azul de bromotimol Rojo de cresol Etanol al 95 %

Preparación: Para obtener un color firme del medio usar una disolución colorante stock en lugar de
estar pesando repetidamente los colores en polvo, disuelva el colorante en etanol hasta obtener una
disolución al 4 % (peso/volumen), agregue 1 ml de esta disolución a cada litro de agar mCPC, la
cual tendrá al final 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo de cresol por litro.
Medio de cultivo: Disolución de celobiosa, polimixina B y colistina.
Ingredientes:
Ingredientes Celobiosa Polimixina B Colistina Agua destilada

Cantidades 10.0 g 100 000 UI 400 000 UI 100 ml
Preparación: Disolver la celobiosa por calentamiento en agua destilada, enfrie y agregue los
antibióticos; esterilice por filtración, agregue esta disolución al agar, mezclar y distribuir en cajas
Petri.
Medio de cultivo: Agar triptona y sal (T1N1).
Ingredientes:
Triptona o
Ingredientes Cloruro de sodio Agar Agua destilada
tripticasa
Preparación: Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución del agar, si lo desea inclinado,
distribuya en tubos, esterilice en autoclave por 15 min a 121 °C. Deje solidificar los tubos
inclinados, para placas enfrie el medio de 45 °C -50 °C y distribuya en cajas de Petri estériles.
Medio de cultivo: Agar gelatina (GA).
Ingredientes:
Extracto de Agua
Ingredientes Peptona Gelatina Agar
levadura destilada
204
Preparación: Suspender los ingredientes y hervir hasta disolver la gelatina y el agar, ajustar el pH a
7.2, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C, enfriar entre 45 °C -50 °C y distribuir en cajas
Petri estériles.
Medio de cultivo: Agar gelatina con sal (GS).
Ingredientes:
Ingredientes Agar gelatina (GA) Cloruro de sodio

Cantidades 1 000 ml 30.0 g
Preparación: Preparar agar gelatina (GA), pero adicionando 30 g de cloruro de sodio por cada
litro, suspender los ingredientes y hervir hasta disolver la gelatina y el agar, ajustar el pH de 7.2,
esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 min, enfriar entre 45 °C -50 °C, colocar en cajas Petri. Si es
necesario para inhibir la diseminación de Vibrio spp. tal como V. alginolyticus, use de 25 g a 30 g
de agar por litro.
Medio de cultivo: Caldo glucosa de Hugh-Leifson.
Ingredientes:
Extracto
Cloruro Púrpura de Agua
Ingredientes Peptona de Dextrosa Agar
de sodio bromocresol destilada
levadura
Cantidades 2.0 g 0.5 g 20.0 g 10.0 g. 0.015 g 3.0 g 1 000 ml
Preparación: Suspender los ingredientes y hervir hasta disolver el agar, ajustar el pH a 7.4, colocar
en tubos y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min.
Medio de cultivo: Medio base de descarboxilasa (Arginina, lisina, ornitina).
Ingredientes:
Extracto de Dextrosa Púrpura de Agua

Ingredientes Peptona Agar
levadura (D-glucosa) bromocresol destilada
Cantidades 5.0 g 3.0 g 1.0 g. 0.02 g 3.0 g 1 000 ml
Preparación: Para caldo de arginina, lisina y ornitina, adicionar 5 g de L-aminoácido a 1 000 ml de

base. Como control, usar base sin suplemento (aminoácido); para Vibrio spp. halofílicos, adicionar
15 g de cloruro de sodio por litro, ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización sea de
6.5. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave por 10 minutos a 121 °C.
Medio de cultivo: Caldo triptona y caldos triptona sal T1N0, T1N1, T1N3 y T1N6, T1N8, y
T1N10.
Ingredientes:
205
Ingredientes Triptona o tripticasa Cloruro de sodio Agua destilada

0 g, 10.0 g, 30.0 g,
Cantidades 10.0 g 60.0 g, 80.0 g o 1 000 ml
100.0 g
Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada, para T1N0 no agregue cloruro de sodio,
para T1N1 usar 10 g de cloruro de sodio (1 % p/v concentración de cloruro de sodio); así
respectivamente. Para T1N3 usar 30 g de NaCl por litro (3 % p/v concentración de cloruro de
sodio); distribuir en tubos de tapón de rosca de 16 mm X 150 mm, tapar los tubos, esterilizar en
autoclave durante 15 min a 121 °C, ajustar el pH a 7.2.
Medio de cultivo: Caldo soya tripticasa (TSB).
Ingredientes:
Peptona de Peptona de
Cloruro de Fosfato Agua
Ingredientes tripticasa fitona Dextrosa
sodio dipotásico destilada
(triptona) (soytona)
Preparación: Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar hasta ebullición, distribuir
225 ml en matraces de 500 ml, esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 °C, el pH final debe ser
de 7.2.
Medio de cultivo: Agar soya tripticasa.
Ingredientes:
Peptona de Peptona de
Cloruro de Agua
Ingredientes tripticasa fitona Agar
sodio destilada
(triptona) (soytona)
Preparación: Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar hasta ebullición, distribuir en
tubos o matraces, esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 °C, dejar solidificar los tubos
inclinados o dejar enfria de 45 °C -50 °C y distribuir en cajas Petri, el pH final debe ser de 7.3.
Medio de cultivo: Agar de hierro Kligler (KIA).
Ingredientes:
Citrato Rojo
Peptona Clorur Tiosulfat Agua
Ingrediente Lactos Dextros férrico de Aga
polipepton o de o de destilad
s a a amoniaca feno r
a sodio sodio a
l l
0.02 1 000
Cantidades 20.0 g 20.0 g 1.0 g 5.0 g 0.5 g 0.5 g 15 g
5g ml
206
Preparación: Suspender los ingredientes y hervir hasta disolver el agar, distribuir en tubos de tapón
de rosca, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C, dejar solidificar los tubos inclinados, ajustar
el pH a 7.4.
Medio de cultivo: Agar arginina glucosa inclinado (AGS).
Ingredientes:
Extracto de Cloruro de Tiosulfato de

Ingredientes Peptona Tristona Glucosa
levadura sodio sodio
Citrato
Púrpura de L-Arginina Agua
Ingredientes férrico Agar
bromocresol (hidrocloruro) destilada
amónico
Preparación: Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir hasta disolver el agar y distribuir
en cantidades de 5 ml en tubos de 13 mm X 100 mm, ajustar el pH a 6.8 - 7.0, esterilizar en
autoclave de 10 min a 12 mina 121 °C, dejar solidificar el medio inclinado.
Medio de cultivo: Agar triple azúcar y hierro (TSI).
Ingredientes:
Cloruro de Tiosulfato de
Ingredientes Polipeptona Lactosa Sacarosa Glucosa
sodio sodio
Sulfato ferroso
Ingredientes Rojo de fenol Agar Agua destilada
amónico
Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada, mezclar bien y calentar a ebullición,
agitando ocasionalmente hasta completa disolución, enfriar a 60 °C y ajustar el pH a 7.3.
Medio de cultivo: Agar hierro y lisina (LIA).
Ingredientes:
Citrato
Peptona o Extracto de Tiosulfato de
Ingredientes L-lisina Glucosa férrico
gelisato levadura sodio
amónico
Ingredientes Púrpura de bromocresol Agar Agua destilada

207
Preparación: Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta
ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa, esterilizar en autoclave
por 12 min a 121 °C, enfriar a 50 °C -60 °C y ajustar el pH a 6.7, distribuir en volúmen de 13 mm X
100 mm. Los tubos se enfrian en posición inclinada, de tal modo que se obtangan columnas de
medio de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm.
Medio de cultivo: Agar rojo de metilo y Voges Proskauer (RM-VP).
Ingredientes:
Fosfato
Ingredientes Peptona Glucosa Agua destilada
dipotásico
Preparación: Disolver los ingredientes en 800 ml de agua tibia, filtrar, enfriar a 20 °C y diluir a 1
litro, distribuir en tubos, esterilizar en autoclave de 15 a 20 min a 121 °C, ajustar el pH a 6.9.
Medio de cultivo: Medio para prueba de movilidad (semisólida).
Ingredientes:
Extracto de Cloruro de Agar Agua destilada

Ingredientes Peptona
carne sodio
Preparación: Calentar con agitación y hervir de 1 a 2 minutos hasta disolución del agar, distribuir
en tubos con tapón de rosca, esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C, ajustar el pH a 7.4.
Medio de cultivo: Prueba rojo de metilo.
Ingredientes:
Ingredientes Rojo de metilo Alcohol etílico Agua destilada

Preparación: Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada. Para realizar la
prueba añadir 5 gotas de la disolución a 5 ml del cultivo problema; una coloración roja demuestra
un pH menor a 4.5 y la prueba es positiva; un color amarillo se reporta como prueba negativa.
Medio de cultivo: Prueba de Voges Proskauer.
Ingredientes:
Ingredientes Alfa-Naftol Alcohol etílico absoluto

Preparación: Añadir 0.6 ml de la disolución de alfa-naftol y 0.2 ml de una disolución acuosa al 40

% de KOH a 1 ml del cultivo. El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una
reacción positiva.
208
Medio de cultivo: Reactivo de Kovac.
Ingredientes:
p- Alcohol amílico o Ácido clorhídrico

Ingredientes
dimetilaminobenzaldehido alcohol isoamílico concentrado
Preparación: Disolver el p-dimetilaminobenzaldehido en el alcohol amílico y agregar el ácido

clorhídrico lentamente, gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco color ámbar con tapón
esmerilado, el color del reactivo va del amarillo al café claro; se debe conservar a 4 °C.
ISO/TS 21872-1:2007
Medio de cultivo: Agua salina peptonada alcalina (ASPW).
Ingredientes:

Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada, calentar si es necesario, mezclar bien
y distribuir en cantidades requeridas para la examinación en los recipientes finales, esterilizar en
autoclave a 121 °C durante 15 minutos, ajustar el pH de manera que después de la esterilización sea
de 8.6 ± 0.2.
Medio de cultivo: Agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS).
Ingredientes:
Extracto de Tiosulfato Citrato de Bilis seca

levadura de sodio sodio de bovino
Citrato Azul de Azul de Agua

Ingredientes NaCl Agar
férrico bromotimol timol destilada
8.0 g a 18.0
g
Preparación: Añadir los ingredientes al agua destilada y calentar para disolver; llevar a ebullición
y retirar inmediatamente del fuego. NO UTILIZAR AUTOCLAVE, enfriar a 50 °C y verter en
cajas Petri, ajustar el pH a 8.6 ± 0.2.
Medio de cultivo: Agar nutritivo salino (SNA).
Ingredientes:
209
Extracto de
carne
Cantidades 5.0 g 3.0 g 10 .0 g 8.0 g a 18.0 g 1 000 ml
Preparación: Disolver los componentes deshidratados o el medio completo deshidratado en el

agua, calentar si es necesario, ajustar el pH de manera que después de la esterilización sea de 7.2 ±
0.2, transferir el medio en contenedores de capacidad apropiada, esterilizar en autoclave por 15 min
a 121 °C.
Medio de cultivo: Reactivo para detección de oxidasa.
Ingredientes:
Ingredientes N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenilendiamina · 2HCl Agua destilada

Preparación: Disolver los componentes en agua fría inmediatamente antes de su uso.
Medio de cultivo: Agar triple azúcar hierro (TSI).
Ingredientes:
Extracto de Extracto de
Ingredientes Peptona NaCl Lactosa Sacarosa
carne levadura
Citrato de
Ingredientes Glucosa Rojo fenol Agar Agua destilada
hierro (III)
Cantidades 1.0 g 0.3 g 0.024 g 8.0 a 18.0 g 1 000 ml
Preparación: Disolver los componentes en el agua, si es necesario por medio de calentamiento,

distribuir el medio en cantidades de 10 ml en tubos de capacidad apropiada, esterilizar en autoclave
por 15 min a 121 °C, dejar solidificar en posición inclinada con un fondo de aproximadamente 5
cm, ajustar el pH para que el valor después de la esterilización sea de 7.4 ± 0.2.
Medio de cultivo: Medio salino para la detección de ornitina descarboxilasa (ODC).
Ingredientes:
L-ornitina Extracto de Púrpura de Agua

Ingredientes Glucosa NaCl
monoclorhidrato levadura bromocresol destilada
Preparación: Disolver los componentes en el agua, calentar si es necesario, distribuir el medio en

volúmenes de 2 ml-5 ml en tubos de ensayo, esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 min, mpH
final 6.8 ± 0.2.
210
Medio de cultivo: Medio salino para la detección de lisina descarboxilasa (LDC).
Ingredientes:
L-lisina Extracto de Púrpura de Agua


volúmenes de 2 ml-5 ml en tubos de ensayo, esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 min, pH final
6.8 ± 0.2.
Medio de cultivo: Medio salino para la detección de arginina dehidrolasa (ADH).
Ingredientes:
Arginina Extracto de Púrpura de Agua


volúmenes de 2 ml-5 ml en tubos de ensayo, esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 min, pH final
6.8 ± 0.2.
Medio de cultivo: Reactivos para detección de β-galactosidasa.
Ingredientes:
Disolución ONPG:
2-o-Nitrofenil-β-D-galactopiranósido
(ONPG)
Disolución Buffer:
Ingredientes NaH2PO4 NaOH 0.1 N Agua destilada

Cantidades 6.9 g Aprox. 3 ml Cantidad suficiente para aforar a 50 ml
Reactivo completo:
Ingredientes Disolución buffer Disolución ONPG

Preparación: Disolución ONPG: Disolver el ONPG en agua a aproximadamente a 50 °C, enfriar

la disolución. Disolución buffer: Disolver el NaH2PO4 en aproximadamente 45 ml de agua en un
matraz volumétrico, ajustar el pH a 7.0 ± 0.2 con la disolución de NaOH, aforar a 50 ml con agua
211
destilada. Reactivo completo: Añadir la disolución buffer a la disolución de ONPG, almacenar

entre 0 °C y 5 °C.
Medio de cultivo: Medio triptófano.
Ingredientes:
Digerido enzimático de D-L-

caseína Triptófano
Preparación: Disolver los componentes en el agua, si es necesario por medio de calentamiento y

filtrar, ajustar el pH de modo que después de la esterilización sea de 7.0 ± 0.2, distribuir el medio en
cantidades de 5 ml en tubos de capacidad adecuada, esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15
min.
Ingredientes:
4-
Ingredientes Ácido clorhídrico 2-Metilbutan-2-ol
Dimetilaminobenzaldehído
Preparación: Mezclar los componentes.
Medio de cultivo: Agua peptona salina.
Ingredientes:

Cantidades 10.0 g 0/20/60/80/100 g 1 000 ml
Preparación: Disolver los componentes en el agua, por calentamiento si es necesario, ajustar el pH

de modo que después de la esterilización, sea de 7.5 ± 0.2, distribuir en tubos de capacidad
adecuada, esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 min.
Medio de cultivo: Disolución de cloruro de sodio.
Ingredientes:

Preparación: Disolver el componente en el agua destilada, esterilizar en autoclave por 15 min a

121 °C, pH final 7.5 ± 0.2.
212
BS 5763: Part 14: 1991
Medio de cultivo: Caldo sal-polimixina B.
Ingredientes:
Extracto de
levadura
Disolución polimixina B:
Ingredientes Polimixina B Agua destilada

Cantidades 100 000 UI 100 ml
Medio completo:
Ingredientes Base Disolución polimixina B

Preparación: Disolver todos los componentes deshidratados en el agua destilada, calentar si es

necesario, ajustar el pH después de la esterilización a 7.4, esterilizar en autoclave a 121 °C durante
15 minutos. Disolución polimixina B: Disolver la polimixina B en el agua destilada, esterilizar por
filtración. Medio completo: Adicionar de manera aséptica el preparado fresco de disolución de
polimixina B a la base previamente enfriada, distribuir el medio en botellas o frascos de capacidad
adecuada, usar preferentemente el mismo día o almacenar durante la noche a 0 °C - 5 °C.
Medio de cultivo: Agua peptonada salina alcalina.
Ingredientes:

Preparación: Disolver los componentes en el agua, calentar si es necesario, ajustar el pH después

de la esterilización a 8.6, esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
Medio de cultivo: Medio de cultivo salino de glucosa con dodecil sulfato de sodio (GST).
Ingredientes:
Dodecil
Extracto Violeta de Agua
Ingredientes Peptona NaCl Glucosa sulfato de
de carne metilo destilada
sodio
213
Preparación: Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua destilada,

calentar si es necesario, distribuir el medio en botellas o frascos de capacidad apropiada, esterilizar
en autoclave a 121 °C durante 15 minutos, ajustar el pH de manera que después de la esterilización
sea de 8.6.
Medio de cultivo: Agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS).
Ingredientes:
Extracto de Citrato Tiosulfato de Citrato de Cloruro de

Ingredientes Peptona
levadura de sodio sodio hierro sodio
Bilis Azul de Azul de

Ingredientes Sacarosa Agar Agua destilada
disecada bromotimol timol
Cantidades 8.0 g 20.0 g 0.04 g 0.04 g 8.0-18.0 g 1 000 ml
Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada por ebullición, ajustar el pH a 8.6, no
esterilizar.
Medio de cultivo: Agar cloruro de trifeniltetrazolio triptona de soya (TSAT).
Ingredientes:
Peptona de Sales Agua

Ingredientes Triptona NaCl Sacarosa Agar
soya biliares destilada
Cantidades 15.0 g 5.0 g 30.0 g 20.0 g 0.05 g 8.0-18.0 g 1 000 ml
Disolución de cloruro de trifeniltetrazolio:
Ingredientes Cloruro de trifeniltetrazolio Agua destilada

Medio completo:
Disolución de cloruro de
Ingredientes Base
trifeniltetrazolio al 1 %
Cantidades 1 000 ml 3 ml
Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada, calentar si es necesario, distribuir el

medio en botellas o frascos de capacidad adecuada, esterilizar en autoclave 15 min a 121 °C, ajustar
el pH después de la esterilización a 7.1. Disolución de cloruro de trifeniltetrazolio: Disolver el
componente en el agua, esterilizar por filtración. Medio completo: Adicionar asépticamente al
medio base previamente enfriado a 45 °C, la disolución esterilizada de cloruro de trifeniltetrazolio y
mezclar.
214
Medio de cultivo: Agar nutriente salino.
Ingredientes:
Extracto de
carne
Cantidades 5.0 g 3.0 g 30.0 g 8.0 g -18.0 g 1 000 ml
Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada, calentar si es necesario, transferir el

medio a contenedores de capacidad apropiada, esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 min, pH
final 8.5.
Medio de cultivo: Agar salino triple azúcar hierro (Agar salino TSI).
Ingredientes:
Extracto
Extracto
Ingredientes Peptona de NaCl Lactosa Sacarosa Glucosa
de carne
levadura
Citrato de Tiosulfato de
Ingredientes Rojo fenol Agar Agua destilada
hierro sodio
Cantidades 0.03 g 0.024 g 0.03 g 8.0 g-18.0 g 1 000 ml
Preparación: Disolver los componentes en agua destilada, calentar si es necesario, transferir 10 ml

del medio a tubos de ensayo de capacidad apropiada, esterilizar en autoclave a 121 °C por 10 min,
ajustar el pH a 7.4.
Medio de cultivo: Agar salino carne-levadura.
Ingredientes:
Extracto
Extracto Hidrocloruro Agua
Ingredientes Peptona de NaCl Glucosa Agar
de carne de cisteína destilada
levadura
30.0 5.0 g-
g 8.0 g
Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada, calentar si es necesario, transferir el

medio en cantidades de 4 ml a tubos de ensayo de 9 mm X 180 mm, esterilizar en autoclave a 121
°C por 15 min, pH final 7.5. Antes de usar, calentar los tubos en baño de agua caliente por 10 min,
enfriar rápidamente a 45 °C.
.
Medio de cultivo: Medio salino para la detección de lisina descarboxilasa.
Ingredientes:
Ingredientes L-lisina Extracto Glucosa Purpura de NaCl Agua

215
monoclorhidrato de bromocresol destilada

levadura
Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada, calentar si es necesario, transferir

aproximadamente 2 ml del medio a tubos de ensayo de 9 mm X 180 mm, esterilizar en autoclave a
121 °C por 15 min, pH final 6.8.
Medio de cultivo: Reactivo para la detección de indol: Medio salino triptona/triptofano.
Ingredientes:
Ingredientes Triptona D-L-triptofano NaCl Agua destilada

Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada, calentar si es necesario y filtrar,

transferir el medio en cantidades de 5 ml a tubos de ensayo de capacidad apropiada, esterilizar en
autoclave a 121 °C por 15 min, pH final 7.5.
Medio de cultivo: Reactivo para la detección de indol: Reactivo de Kovacs.
Ingredientes:
(C) 2-
(B) Ácido
Ingredientes (A) 4-Dimetilaminobenzaldehido Metilbutan-2-
clorhídrico
ol
Preparación: Disolver A en C, después añadir lentamente B, almacenar el reactivo en la oscuridad.
Medio de cultivo: Reactivo para la detección de oxidasa.
Ingredientes:
N, N, N ', N'-tetrametil-p-
fenilendiamina.2HCl
Preparación: Disolver los componentes en agua fría inmediatamente antes de su uso
Medio de cultivo: Reactivo para la detección de β-galactosidasa.
Ingredientes:
Disolución ONPG:
2-o-Nitrofenil-β-D-galactopiranósido
(ONPG)
216
Disolución buffer:
Ingredientes NaH2PO4 Agua destilada

Cantidad suficiente
Cantidades 6.9 g
para aforar a 50 ml
Reactivo completo:
Ingredientes Disolución buffer Disolución ONPG

Preparación: Disolución ONPG: Disolver el ONPG en agua a aproximadamente 50 °C, enfriar la

disolución. Disolución buffer: Disolver el NaH2PO4 en aproximadamente 45 ml de agua en un
matraz volumétrico, ajustar el pH a 7.0 ± 0.2 con la disolución de NaOH, aforar a 50 ml con agua
destilada. Reactivo completo: Añadir la disolución buffer a la disolución de ONPG, almacenar
entre 0 °C y 5 °C.
Medio de cultivo: Disolución de cloruro de sodio.
Ingredientes:

Preparación: Disolver el componente en el agua destilada, esterilizar en autoclave por 20 min a

121 °C, pH final 7.5.
BAM Capítulo 9. V. cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus
Reactivo o Medio de cultivo: Agua peptonada alcalina (APW)
Ingredientes:

Preparación: Ajustar el pH de manera que después de la esterilización sea de 8.5 ± 0.2, distribuir
en tubos con tapón de rosca, esterilizar por 10 min a 121 °C.
Reactivo o Medio de cultivo: Medio AKI
Ingredientes:
217
NaHCO3(10 %
Extracto de Agua acuosa,
Ingredientes Peptona NaCl
levadura destilada esterilizada por
filtración)
Cantidades 15.0 g 4.0 g 5.0 g 970 ml 30 ml
Preparación: El día de su uso, disolver peptona, extracto de levadura y el NaCl en agua destilada,
autoclave 15 min a 121 °C, enfriar, adicionar el NaHCO3 recién preparado y esterilizado y mezclar,
distribuir asépticamente porciones de 15 ml en tubos con tapón de rosca de 16 mm x 125 mm, pH
final 7.4 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Medio inclinado arginina-glucosa (AGS)
Ingredientes:
Extracto de L-arginina
Ingredientes Peptona Triptona NaCl Glucosa
levadura (clorhidrato)
Citrato de Tiosulfato de Púrpura de

amonio férrico sodio bromocresol
Preparación: Suspender los ingredientes en el agua destilada y hervir para disolver, distribuir 5 ml
en tubos de 13 mm x 100 mm, esterilizar durante 10 min-12 min a 121 °C, pH final 6.8 ± 7.0.
Reactivo o medio de cultivo: Agar sangre
Ingredientes:
Fitona o
Ingredientes Triptona NaCl Agar Agua destilada
soytona
Preparación: Calentar con agitación hasta disolver el agar, esterilizar por 15 min a 121 °C, enfriar
a 50 °C, añadir 5 ml de glóbulos rojos de oveja desfibrinada a 100 ml de agar fundido, mezclar y
verter en porciones de 20 ml en cajas Petri estériles, el pH final del medio debe ser 7.3 ± 0.2. El
agar tripticasa soya, agar tripticaseína soya pueden ser usados como medio basal.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo casaminoácidos-extracto de levadura-sales (CAYE)
Ingredientes:
Disolución
de
Extracto de Agua
Ingredientes Casaminoácidos NaCl K2HPO4 elementos
levadura destilada
traza
(opcional)
218
Cantidades 20.0 g 6.0 g 2.5 g 8.71 g 1.0 ml 1 000 ml
Preparación: Ajustar el pH para que el valor después de la esterilización sea de 8.5 ± 0.2,
esterilizar por 15 min a 121 °C, disolución de elementos traza: MgSO4 50 g, MnCl2 5 g, FeCl2 5 g,
agua destilada 1 000 ml. Suspender los ingredientes. Adicionar suficiente H2SO4 0.1 N para
disolver, esterilizar por filtración a través de una membrana de 0.45 µ, añadir 1 ml a 100 ml del
medio base, distribuir en porciones de 10 ml en matraces de 50 ml.
Reactivo o medio de cultivo: Agar modificado celobiosa-polimixina B-colistina (mCPC)
Ingredientes:
Disolución 1:
Disolución
Extracto de stock de Agua
carne colorante destilada
1000X
Cantidades 10.0 g 5.0 g 20.0 g 1.0 ml 15.0 g 900 ml
Disolución 2:
Ingredientes Celobiosa Colistina Polimixina B Agua destilada

Cantidades 10.0 g 400 000 unidades 100 000 unidades 100 ml
Preparación:
Disolución 1: Ajustar el pH a 7.6, hervir para disolver el agar, enfriar a 48 °C -55 °C. Disolución 2:
Disolver la celobiosa en agua destilada con calentamiento suave, enfriar, añadir los antibióticos,
adicionar la disolución 2 a la disolución 1 enfriada, mezclar y distribuir en cajas Petri. Color final:
Verde oscuro a verde marrón.
Disolución stock de colorante 1000X: Azul de bromotimol 4 g, rojo de cresol 4 g, etanol al 95 %

100 ml. Disolver los colorantes en etanol para una disolución stock al 4 % (p/v). Utilizanto 1 ml de
esta disolución por litro de agar mCPC da 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo de cresol
por litro.
Disolución 2: Disolver la celobiosa en agua destilada calentando suavemente, enfriar, adicionar los
antibióticos y esterilizar por filtración, adicionar la disolución 2 a la disolución 1 enfriada, mezclar,
y distribuir en cajas Petri, el color final es de un verde oscuro a un verde café.
NOTA: Este medio como el TCBS es muy inhibitorio y no requiere de esterilización por autoclave.
El medio puede ser almacenado por 2 semanas a temperatura de refrigeración.
Reactivo o medio de cultivo: Agar celobiosa-colistina (CC).
Ingredientes:
Disolución 1:
219
Disolución
Extracto de stock Agua
carne colorante destilada
1000X
Cantidades 10.0 g 5.0 g 20.0 g 1.0 ml 15.0 g 900 ml
Disolución 2:
Ingredientes Celobiosa Colistina Agua destilada

Cantidades 10.0 g 400 000 unidades 100 ml
Preparación:
Disolución 1: Ajustar el pH a 7.6, hervir para disolver el agar, enfriar a 48 °C -55 °C. Disolución 2:
Disolver la celobiosa en agua destilada con calentamiento suave, enfriar, añadir el antibiótico,
adicionar la disolución 2 a la disolución 1 enfriada, mezclar y distribuir en cajas Petri. Color final:
Verde oscuro a verde marrón.
Disolución stock de colorante 1000X: Azul de bromotimol 4 g, rojo de cresol 4 g, etanol al 95 %

100 ml. Disolver los colorantes en etanol para una disolución stock al 4 % (p/v), utilizando 1 ml de
esta disolución por litro de agar mCPC da 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo de cresol
por litro.
Disolución 2: Disolver la celobiosa en agua destilada calentando suavemente, enfriar, adicionar los
antibióticos y esterilizar por filtración, adicionar la disolución 2 a la disolución 1 enfriada, mezclar,
y distribuir en cajas Petri. El color final es de un verde oscuro a un verde café.
NOTA: Este medio como el TCBS es muy inhibitorio y no requiere esterilización por autoclave. El
medio puede ser almacenado por 2 semanas a temperatura de refrigeración.
Reactivo o medio de cultivo: Medio prueba de motilidad (semisólido)
Ingredientes:
Extracto de
carne
Preparación: Añadir NaCl hasta una concentración final de 2 %-3 %, calentar con agitación y
hervir de 1 min-2 min para disolver el agar, distribuir 8 ml en tubos con tapón de rosca de 16 mm x
150 mm, esterilizar por 15 min a 121 °C, pH final 7.4 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Reactivo oxidasa
Ingredientes:
Ingredientes N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenilendiamina.2HCl Agua destilada

220
Preparación: El reactivo puede ser utilizado recién preparado o se puede utilizar en un máximo de
7 días, si se guarda en un frasco de vidrio oscuro en condiciones de refrigeración. Aplique la
disolución recién preparada directamente al cultivo joven (24 h) en la placa de agar.
Reactivo o medio de cultivo: Sal diluyente-peptona-tween (PTS)
Ingredientes:
Ingredientes Peptona Tween 80 Cloruro de sodio Agua destilada

Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada, ajustar el pH a 7.2, distribuir en botellas
de volumen deseado, esterilizar por 15 min a 121 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Tampón fosfato salino (PBS), pH 7.4
Ingredientes:
Ingredientes NaCl Na2HPO4 anhidro KH2PO4 Agua destilada

Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada, ajustar el pH a 7.4 (con NaOH 0.1 N),
esterilizar por 15 min a 121 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución salina fisiológica al 0.85 % (estéril)
Ingredientes:

Preparación: Disolver el NaCl en el agua destilada, esterilizar por 15 min a 121 °C, enfriar a
temperatura ambiente.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de cloruro de sodio al 2 % y 3 %.
Ingredientes y preparación: NaCl, agua destilada, disolución al 2 %: Disolver 20 g de NaCl en

1000 ml de agua destilada. Disolución al 3%: Disolver 30 g de NaCl en 1 000 ml de agua destilada,
esterilizar por 15 min a 121 °C.
Reactivo o medio de cultivo: Desoxicolato de sodio al 0.5 % en agua estéril.
Ingredientes:
Ingredientes Desoxicolato de sodio Agua destilada

Preparación: El pH de la disolución no tiene que ser ajustado y puede ser almacenado en una
botella con tapón de rosca a temperatura ambiente.
221
Reactivo o medio de cultivo: Agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS)
Ingredientes:
Extracto de Tiosulfato de Citrato de Colato

levadura sodio 5·H2O sodio 2·H2O de sodio
Citrato Azul de Azul de Agua

Ingredientes Oxgall NaCl
férrico bromotimol timol destilada
Preparación: Preparar en un matraz de al menos 3 veces más grande que el volúmen requerido de
medio, añadir los ingredientes al agua destilada y calentar para disolver. Llevar a ebullición y retirar
inmediatamente del fuego, NO UTILIZAR AUTOCLAVE, enfriar a 50 °C y verter en cajas Petri.
Reactivo o medio de cultivo: Agar triptona sal (T1 N agar1 y T1 N agar2).
Ingredientes:
Tripticasa o
Ingredientes NaCl Agar Agua destilada
triptona
Preparación: Suspender los ingredientes y hervir para disolver el agar, esterilizar por 15 min a 121
°C. Para T1 N agar2: usar 20 g de NaCl en lugar de los 10 g especificados para T1 N agar 1.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo triptona y caldo triptona sal (T1N0, T1N1, T1N3, T1N6,
T1N8, T1N10)
Ingredientes: Tripticasa o triptona 10 g, NaCl 0 g, 10 g, 30 g, 60 g, 80 g o 100 g, agua destilada 1

000 ml.
Ingredientes Tripticasa o triptona NaCl Agua destilada

0 g /10 g /30 g /60 g /80
g /100 g
Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada. Para T1N0 no añadir NaCl, para T1N1
usar 10 g de NaCl/l, para T1N3 usar 30 g de NaCl/l, etc. Distribuir en tubos con tapón de rosca de
16 mm x 125 mm, apretar las tapas para mantener la concentración correcta de sal en el tubo,
esterilizar por 15 min a 121 °C, pH final 7.2 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar tripticasa de soya (TSA)
Ingredientes:
Agua
Ingredientes Tripticasa o peptona Peptona de fitona NaCl Agar
destilada
222
Preparación: Calentar con agitación para disolver el agar, hervir 1 min, distribuir en tubos o
frascos adecuados, esterilizar por 15 min a 121 °C, pH final 7.3 ± 0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Caldo urea
Ingredientes:
Extracto de Agua
Ingredientes Urea Na2PO4 KH2PO4 Rojo fenol
levadura destilada
Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada, NO CALENTAR, esterilizar por

filtración con una membrana de 0.45 µ, distribuir asépticamente en tubos estériles, pH final 6.8 ±
0.2.
Reactivo o medio de cultivo: Agar urea de Christensen
Ingredientes:
Rojo Agua
Ingredientes Urea Peptona NaCl Dextrosa KH2PO4 Agar
fenol destilada
Preparación: Disolver todos los ingredientes excepto urea en 900 ml de agua destilada, esterilizar
por 15 min a 121 °C, enfriar a 50 °C -55 °C, disolver urea en 100 ml de agua destilada, filtrar por
esterilización, adicionar asépticamente al medio base enfriado, mezclar, pH final 6.8 ± 0.1,
distribuir en tubos o cajas Petri estériles.
Reactivo o medio de cultivo: Agar sacarosa Vibrio parahaemolyticus (VPSA)
Ingredientes:
Extracto de
Ingredientes Triptosa Triptona Sacarosa NaCl
levadura
Sales biliares N°. Azul de

3 bromotimol
Preparación: Hervir para disolver los ingredientes y enfriar a 50 °C -55 °C, ajustar el pH a 6.8 con
NaOH 1 N, distribuir en cajas Petri estériles.
223
Reactivo o medio de cultivo: Agar Vibrio vulnificus (VVA)
Ingredientes:
Disolución 1:
Disolución
stock de Agua
colorante destilada
100X
Cantidades 20.0 g 30.0 g 10 ml 25.0 g 900 ml
Disolución 2:
Ingredientes Celobiosa Agua destilada

Preparación: Disolución 1: Ajustar el pH 8.2, hervir para disolver el agar, esterilizar por 15 min a
121 °C. Disolución 2: Disolver la celobiosa en agua destilada con calentamiento suave, enfriar y
esterilizar por filtración. Disolución stock de colorante 100X: Azul de bromotimol 0.6 g, etanol al
70 % 100 ml, disolver el colorante en etanol.
4.6 Colección y transporte de muestras.
NOM-109-SSA1-1994
Reactivo o medio de cultivo: Etanol o isopropanol al 70 %.
Preparación: No especifica.
Reactivo o Medio de cultivo: Agua clorada y tiosulfato de sodio.
Preparación: No especifica.
BAM Capítulo 1. Muestreo de alimentos y preparación de la muestra homogeneizada
Reactivo o medio de cultivo: Agua de dilución amortiguador fosfato de Butterfield (Butterfield's

Phosphate-Buffered Dilution Water, R11).

Preparación: Ajustar el pH a 7.2 con 1 N NaOH, ajustar el volumen a un litro con agua destilada.
Esterilizar por 15 min a 121°C, almacenar en refrigerador.
224
4.7 Preparación de diluciones usando medios gravimétricos.
NOM-110-SSA1-1994
Reactivo o medio de cultivo: Disolución de hidróxido de sodio 1.0 N.
Ingredientes Hidróxido de sodio Agua destilada

Preparación: Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 ml con agua.
Reactivo o medio de cultivo: Disolución reguladora de fosfatos (disolución concentrada).
Ingredientes Fosfato de sodio monobásico Agua destilada

Preparación: Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7.2 con disolución de

hidróxido de sodio 1.0 N. Llevar a un litro con agua, esterilizar durante 15 minutos a 121°C ±
1.0°C. Conservar en refrigeración (disolución concentrada), tomar 1.25 ml de la disolución
concentrada y llevar a un litro con agua (disolución de trabajo), distribuir en porciones de 99 ml, 90
ml y 9 ml según se requiera, esterilizar a 121°C ± 1.0°C durante 15 minutos. Después de la
esterilización, el pH y los volúmenes finales de la disolución de trabajo deberán ser iguales a los
iniciales.
Reactivo o Medio de cultivo: Agua peptonada.
Ingredientes Peptona Cloruro de sodio Agua destilada

Preparación: Disolver los componentes en un litro de agua, ajustar el pH a 7 ± 0.1 con hidróxido
de sodio 1.0 N, distribuir en porciones de 99 ml, 90 ml y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de
nueve según se requiera, esterilizar a 121 °C ± 1.0 °C durante 15 minutos, después de la
esterilización, el pH y los volúmenes finales de la disolución de trabajo deberán ser iguales a los
iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una
temperatura entre 0 °C a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no
alteren su volumen o composición.
UNE-EN ISO 6887-1:2000
Reactivo o medio de cultivo: Disolución salina de peptona.
225
Digestato enzimático de
Ingredientes Cloruro de sodio Agua destilada
caseína
Preparación: Disolver los componentes en el agua, calentando si fuese necesario, ajustar el pH si

fuese necesario, de tal manera que tras la esterilización fuera de 7.0 ± 0.2 a 25 ºC. El disolvente se
repartirá en matraces de una capacidad conveniente, dispensando en ellos los volúmenes necesarios
para la preparación de las suspensiones iniciales; el disolvente se repartirá en tubos de ensayo o en
matraces, dispensando en ellos los volúmenes necesarios para la preparación de las diluciones
decimales. La cantidad a añadir será la necesaria para que, tras la esterilización, el volumen que
quedase en cada tubo o matraz sea de 9.0 ml. La imprecisión en la medida de este volumen final,
tras la esterilización, no deberá ser mayor del ± 2 %. Cerrar los tubos o los matraces, esterilizar en
el autoclave a 121 ºC durante 15 min.
Digestato
Cloruro de Na2HPO4 × Agua
Ingredientes enzimático de KH2PO4
sodio 12H2O destilada
tejidos animales

es necesario, de tal manera que tras la esterilización fuese de 7.0 ± 0.2 a 25 ºC. El disolvente se
para la preparación de las suspensiones iniciales; el disolvente se repartirá en tubos de ensayo o en
UNE-EN ISO 6887-2:2004
Reactivo o medio de cultivo: Disolución salina de peptona. Véase la norma ISO 6887-1:2000,
previamente descrita.
Reactivo o medio de cultivo: Agua de peptona tamponada. Véase la norma ISO 6887-1:2000,
Reactivo o medio de cultivo: Disolución salina de peptona con púrpura de bromocresol.
Digestato
Púrpura de
Ingredientes enzimático de Cloruro de sodio Agua destilada
bromocresol
caseína
disolución de
alcohol al 0.04
226
%, por ejemplo
disolución en
etanol 0.1 ml
Preparación: Se añaden 0.1 ml de púrpura de bromocresol a 1 000 ml de disolución salina de

peptona. Esta disolución puede emplearse para el análisis de ciertos productos ácidos, de tal forma
que se pueda realizar el ajuste del pH sin emplear una sonda de pH estéril. El púrpura de
bromocresol es amarillo a pH ácido, cambiando a púrpura a pH por encima de 6.8; el disolvente se
para la preparación de las suspensiones iniciales. El disolvente se repartirá en tubos de ensayo o en
UNE-EN ISO 6887-3:2004
Reactivo o medio de cultivo: Disolución salina de peptona con púrpura de bromocresol. Véase la
norma ISO 6887-2:2004, previamente descrita.
Reactivo o Medio de cultivo: Disolución de peptona.
Ingredientes Digerido enzimático de caseína Agua destilada


fuese necesario, de tal manera que tras la esterilización fuera de 7.0 ± 0.2 a 25 ºC. Esta disolución
puede emplearse para moluscos bivalvos, gasterópodos y otros mariscos marinos. El disolvente se
para la preparación de las suspensiones iniciales. El disolvente se repartirá en tubos de ensayo o en
UNE-EN ISO 6887-4:2003
227
Reactivo o medio de cultivo: Disolución salina de peptona con púrpura de bromocresol. Véase la
norma ISO 6887-2:2004, previamente descrita.
Reactivo o Medio de cultivo: Disolución de tampón fosfato.
Ingredientes Na2HPO4.12H2O KH2PO4 Agua destilada


pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7.0 ± 0.2 a 25 ºC. Se
reparten 180 ml en cada matraz, se esteriliza en autoclave regulado a 121 ºC durante 15 min, la
disolución de tampón fosfato se utiliza como diluyente para las muestras de gelatina y otras
muestras. El disolvente se repartirá en tubos de ensayo o en matraces, dispensando en ellos los
volúmenes necesarios para la preparación de las diluciones decimales. La cantidad a añadir será la
necesaria para que, tras la esterilización, el volumen que quedase en cada tubo o matraz sea de 9.0
ml. La imprecisión en la medida de este volumen final, tras la esterilización, no deberá ser mayor
del ± 2 %. Cerrar los tubos o los matraces, esterilizar en el autoclave a 121 ºC durante 15 min.
Reactivo o medio de cultivo: Oligos iniciadores para identificar especies de Vibrio.
Tabla 22. Oligos iniciadores para detectar genes de toxinas de V. vholerae, V.

parahaemolyticus y V. vulnificus.
Especie Gen objetivo Sentido Anti-sentido
V. cholerae Gen ctx 5'-tga aat aaa gca gtc agg 5'-ggt att ctg cac aca aat
(777 pb) tg-3' cag-3'
V. Gen tlh L-TL: 5' aaa gcg gat tat R-TL: 5' gct act ttc tag cat
parahaemolyticus (450 pb) gca gaa gca ctg 3' ttt ctc tgc 3'
Gen trh VPTRH-L: 5' ttg gct VPTRH-R: 5' cat aac
(500 pb) tcg ata ttt tca gta tct 3' aaa cat atg ccc att tcc g 3'
Gen tdh VPTDH-L: 5' gta aag VPTDH-R: 5' tgg aat
(270 pb) gtc tct gac ttt tgg ac 3' aga acc ttc atc ttc acc 3'
V. vulnificus Gen vvhA Vvh-785F: 5' ccg cgg Vvh-1303R 5'cgc cac
(519 pb) tac agg ttg gcg ca 3' cca ctt tcg ggc c 3'
Preparación: Preparar soluciones de trabajo a 10 pmol/µl.

228
229
DESCRIPCIÓN DE BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO
La implementación de un sistema de aseguramiento de la calidad en un laboratorio de microbiología

requiere la adopción de Buenas Prácticas de Laboratorio, las cuales son principios, normas o
directrices que proveen un marco de trabajo que asegura la confiabilidad de los resultados obtenidos
durante los estudios. Estas prácticas cubren aspectos del trabajo diario en el laboratorio tales como
el mantenimiento de las instalaciones, limpieza del material, mantenimiento de los equipos, etc.
5.1 INSTALACIONES
5.1.1Limpieza y desinfección
Tanto la limpieza como la desinfección son imprescindibles en un laboratorio de microbiología;

mientras que la primera remueve el polvo y la materia orgánica, la segunda elimina los
microorganismos.
Los procedimientos de limpieza deberán documentarse y monitorearse para asegurar su efectividad

(Pouch-Downes e Ito, 2001).
Los pasos básicos de cualquier procedimiento de limpieza son los siguientes:
1. Pre-enjuague para remover partículas, limpieza con un agente especial (para remover polvo,
mugre, materia orgánica), enjuague y desinfección (McLandsborough, 2005).
2. Limpieza del piso con trapeadores húmedos con una disolución desinfectante-detergente
(por ejemplo: las sales cuaternarias de amonio) para evitar la acumulación de polvo en el
piso. Se debe poner especial atención a esquinas y áreas escondidas. Se recomienda evitar
barrer ya que esta práctica contribuye al esparcimiento del polvo en el ambiente (Pouch-
Downes e Ito, 2001).
3. Limpieza y desinfección de las mesas de trabajo antes y después de su uso (Pouch-Downes

e Ito, 2001).
4. El personal encargado de realizar la limpieza y desinfección del laboratorio deberá recibir

un curso de inducción sobre seguridad para prevenir accidentes. Así mismo deberá reportar
cualquier incidente ocurrido durante las operaciones de limpieza (Pouch-Downes e Ito,
2001).
5.1.2 Orden
El orden en un laboratorio es imprescindible para evitar accidentes, reducir al mínimo los

desplazamientos y realizar los análisis con eficiencia. Los requisitos básicos de orden en un
laboratorio son los siguientes:
1. Los equipos y mesas de trabajo deberán distribuirse de tal forma que haya espacio
suficiente para desplazarse.
2. Las funciones básicas del laboratorio deben realizarse de preferencia en salas separadas o
en lugares definidos para:
a. Recepción y preparación de muestras
b. Manipulación de patógenos
230
c. Preparación y esterilización de medios de cultivo
d. Esterilización del material de vidrio
e. Limpieza de material de vidrio y equipo
f. Inoculación
g. Incubación
h. Lectura de cultivos de microorganismos
i. Interpretación y preparación de informes.
Nota: Si no es posible contar con diversas salas, basta con distinguir y diferenciar las zonas
limpias de las zonas sucias (Lightfoot y Maier, 1998).
j. Se deberá contar con un almacén de muestras, material de laboratorio y reactivos.
k. Las pertenencias personales deberán almacenarse en un guardarropa. Las batas, equipo

de seguridad y el resto de ropa de protección deberá ser almacenada en un lugar
especial.
l. Evitar usar las mesas de trabajo para almacenar equipos, medios de cultivo o material
de laboratorio.
m. Evitar colocar un equipo que produzca vibraciones (baño María) cerca de equipos
sensibles como las balanzas y microscopios (Lightfoot y Maier, 1998).
n. Evitar la exposición de equipo sensible (por ejemplo: las incubadoras) a los rayos
directos del sol (BS 5763-0:1986).
5.1.3 Condiciones ambientales y servicios
5.1.3.1 Ventilación, temperatura y humedad
El laboratorio debe contar con un sistema de ventilación controlado, que elimine el calor producido
por los equipos y minimice las variaciones de temperatura. El sistema debe ser limpiado con
regularidad para evitar la acumulación de microorganismos, polvo y partículas. Se recomienda
mantener una temperatura de 21°C a 23°C y una humedad del 45 % al 50 % en el laboratorio
(Lightfoot y Maier, 1998).
5.1.3.2 Iluminación
La ubicación de la iluminación debe de evitar la generación de sombras, contraluces y reflexiones

molestas en las superficies de trabajo. Se aconsejan sistemas fluorescentes para conseguir una
iluminación ambiental uniforme. Para zonas donde se requiere una luz más intensa deben utilizarse
sistemas incandescentes con un nivel de iluminación mínimo de 500 luxes (Lightfoot y Maier,
1998).
231
5.1.3.3 Agua
Se requiere que el agua de laboratorio se encuentre libre de partículas tóxicas o nutritivas que
inhiban o influyan en el crecimiento de microorganismos. Los parámetros de control de calidad del
agua deben incluir:
 Trazas de metales: (< a 0.05 mg/L)
 Metales totales: (hasta 1 mg/L).
 Conductividad eléctrica: (no mayor a 1μS/cm)
 pH de 5.5 a 7.5
 Cloro residual (< de 0.1 mg/L, Pouch-Downes e Ito, 2001).
5.1.4 Mantenimiento e inspección
Las instalaciones deben mantenerse en buen estado para evitar en la medida de lo posible
contaminaciones cruzadas, accidentes o cualquier otro incidente.
5.1.5 Monitoreo del medio ambiente del laboratorio
Para comprobar la eficacia de los procedimientos de limpieza y desinfección, y para establecer un

perfil microbiológico del medio ambiente del laboratorio se deberá establecer un sistema de
monitoreo regular de la calidad microbiológica del aire y de las superficies (mesas, estantes,
equipos).
5.2 PERSONAL
El laboratorio de microbiología deberá contar con personal calificado (formación académica,

competencias técnicas y experiencia) que cumpla con los requisitos y necesidades del laboratorio.
En la tabla 23 se describen algunas recomendaciones:
Tabla 23. Nivel de formación y cualificación requeridas para cada puesto.
Funciones Formación requerida
Limpieza de material y preparación de Personal sin cualificación formal, entrenado en

medios de cultivo y muestras. el laboratorio.
Análisis rutinarios siguiendo instrucciones Formación básica o capacitación para alcanzar

normalizadas. dicha formación.
Análisis complejos, trabajo independiente,

supervisión de programas de formación y Analistas con una formación técnica completa.
cualificación.
Profesionista con formación técnica completa y

Interpretación de resultados. experiencia práctica en análisis microbiológicos.
(Lic. en microbiología, QFB, IBQ, Biólogo, etc).
(Lightfoot y Maier, 1998)
232
5.2.2Capacitación
Deberá contarse con un programa y registros de capacitación del personal del laboratorio (esto
incluye tanto personal de nuevo ingreso como del personal actualmente en funciones).
Se deberá llevar a cabo una evaluación continua cualitativa y cuantitativa de la calidad del trabajo
del personal.
5.2.3 Higiene
Las prácticas de higiene personal tienen por objetivo evitar la contaminación de la muestra y del
medio de cultivo, pero a su vez evitar el riesgo de infección del personal que trabaja en el
laboratorio. Se recomienda tomar en cuenta los siguientes lineamientos para este fin:
1. Usar bata blanca de laboratorio, de preferencia de algodón u otra fibra natural que limite los
riesgos de flamabilidad. Deberá conservarse limpia y en buenas condiciones. Evitar usarla
fuera de las áreas de trabajo, sobre todo en zonas públicas donde se consuman alimentos y
bebidas. Conservarla en un lugar designado en el laboratorio.
2. Lavarse las manos meticulosamente y aplicar desinfectante (que debe conservarse en un

dispensador limpio). Realizar esta práctica con frecuencia: antes y después de los análisis
microbiológicos, inmediatamente después de acudir al sanitario y después de retirarse los
guantes. Secar las manos con toallas desechables.
3. Usar guantes desechables cuando se trabaje con microorganismos patógenos.
4. Mantener las uñas cortas y limpias.
5. Cuando se esté llevando a cabo la inoculación, evitar hablar, toser, estornudar y cualquier
acción que provoque flujo de aire brusco.
6. No tomar alimentos y bebidas en el laboratorio.
7. No mascar chicle, no fumar ni aplicar crema labial, evitar cualquier acción que tenga que
ver con introducir objetos a la boca.
8. No pipetear nunca con la boca, usar dispositivos de pipeteo.
9. Transportar los elementos contaminados (cultivos, medios de cultivo, residuos) en

recipientes herméticos y sellados.
10. Desinfectar/esterilizar los residuos y material de vidrio del laboratorio antes de lavar,
reutilizar o eliminar.
11. Se deberán tomar precauciones especiales con personas que presenten infecciones o
enfermedades, ya que los gérmenes presentes pueden invalidar los resultados obtenidos de
los análisis.
12. No se deberá colocar comida para consumo personal en los refrigeradores del laboratorio.
233
5.2.4 Seguridad
Con el objetivo de garantizar la seguridad personal los empleados del laboratorio deberán tomar en
cuenta las siguientes precauciones:
1. Mantener la mesa de trabajo libre de materiales, excepto los que se están utilizando.
2. Recogerse el cabello para evitar riesgos de incendio.
3. Permitir el acceso al laboratorio únicamente a las personas autorizadas.
4. Durante la realización de pruebas se debe limitar el acceso a las áreas de análisis

únicamente a las personas requeridas para conducir la prueba.
5. Usar equipo de protección personal: lentes de seguridad, guantes (acorde a la actividad),

máscaras. Los lentes de seguridad deben usarse cuando se trabajen cultivos que puedan
contener altos niveles de microorganismos patógenos. Para el personal que usa lentes de
contacto, los lentes de seguridad serán obligatorios.
6. Familiarizarse con el equipo de seguridad disponible que incluye: la localización del

botiquín de primeros auxilios, la localización de las salidas de emergencia, regaderas para
ojos, regaderas de seguridad, extintores, alarmas de incendio y teléfonos disponibles en el
laboratorio para contactar servicios de rescate.
7. Mantener las puertas y ventanas del laboratorio cerradas.
8. Usar los mecheros con seguridad. Apagarlos cuando no se estén utilizando y antes de salir
del laboratorio. Mantener los solventes y sustancias flamables mínimo a 45 cm de los
mecheros.
9. Emplear campanas de bioseguridad clase II tipo B2 con extracción para proteger las
muestras y reducir el riesgo de infección humana.
10. Mantener recipientes separados para desechar vidrios rotos, agujas de laboratorio,
disolventes y otros residuos peligrosos.
11. No permitir que un empleado trabaje solo en un laboratorio.
12. El personal deberá familiarizarse con las hojas de seguridad de los reactivos usados en el
laboratorio.
5.3 MANEJO DE MUESTRAS
La calidad de los resultados de un análisis microbiológico depende directamente de la calidad de la

muestra recogida y analizada (Lightfoot y Maier, 1998).
5.3.1 Recepción de la muestra
El personal de recepción deberá revisar la condición de la muestra y asegurarse de que no ha sido

dañada durante el transporte. Se recomienda tomar en cuenta los siguientes criterios de aceptación:
234
1. Que la muestra esté debidamente identificada y porte consigo la documentación que incluya: el
lugar de donde fue tomada, la fecha y hora del muestreo (en especial cuando la muestra es de
naturaleza perecedera), los motivos del muestreo (cumplimiento de especificaciones, análisis de
rutina, etc.), el tipo de muestreo realizado, los análisis requeridos y las condiciones de
almacenamiento.
2. Que la muestra se presente íntegra y en sus condiciones originales.
3. Que la cantidad de muestra sea suficiente para los análisis requeridos.
4. Que las condiciones de temperatura en las que la muestra fue transportada sean las adecuadas
para el tipo de producto, con el fin de evitar cualquier alteración el número de microorganismos
presentes. En la tabla 24 se presentan las temperaturas a las que deben ser almacenadas las
muestras dependiendo del tipo de producto.
Tabla 24. Temperatura a la que deben ser almacenadas las muestras.
Temperatura de
Tipo de producto
transporte/almacenamiento
Productos estables Temperatura ambiente
Productos frescos y refrigerados Entre 0 °C y 4 °C
Productos congelados Debajo de -18 °C
Productos pasteurizados y similares Entre 0 °C y 4 °C
Alimentos sensibles (como pescado fresco) Entre 0 °C y 2 °C
(BS 5763-0:1986)
Una vez que se aceptan las muestras deberá llevarse un registro que contenga los siguientes datos:
fecha de recepción, fecha del muestreo, características de la muestra, nombre del solicitante del
análisis, nombre de la empresa que requiere el análisis (si es de una empresa externa) y análisis
requeridos (BS 5763-0:1986).
5.3.2 Almacenamiento de las muestras
El manejo apropiado de las muestras una vez que entran al laboratorio permitirá evitar confusiones,
contaminación cruzada, contaminación del medio ambiente o infecciones del personal encargado.
Las muestras deben ser almacenadas bajo condiciones apropiadas que prevengan cualquier
alteración en el número de microorganismos presentes hasta que éstas sean analizadas. Se debe
tomar en consideración las temperaturas de almacenamiento (ver tabla 24) así como el tiempo en
que deben ser examinadas de acuerdo al tipo de producto (ver tabla 25).
235
Tabla 25. Tiempo en que deben ser examinadas las muestras.
Tipo de producto Tiempo en ser examinadas
Productos estables Tan pronto como sea posible
Dentro de las 24 h posteriores a su recepción. Si

Productos frescos y refrigerados no se pueden analizar en este tiempo congelar la
muestra tan pronto como sea posible a -18 °C.
Productos pasteurizados y similares Tan pronto como sea posible.
Tomado de BS 5763-0:1986
Las muestras almacenadas a temperatura ambiente deberán permanecer en contenedores sellados

para prevenir la proliferación de microorganismos (Pouch-Downes e Ito, 2001).
5.3.3 Instalaciones y personal encargado
El laboratorio deberá contar con un espacio específico para las muestras que aún no han sido
analizadas o están analizándose y otro espacio para las muestras que aún cuando ya se han
completado los análisis se requiere mantenerlas por un periodo de tiempo más largo.
También es recomendable designar a una persona encargada de llevar un registro de las muestras
que entran y salen del laboratorio además de monitorear el proceso completo que incluye:
1. Recepción de las muestras, verificar la identidad de las muestras y tomar en cuenta los criterios
de aceptación.
2. Registro de la entrada de una muestra al laboratorio.
3. Almacenamiento de las muestras de acuerdo a las instrucciones que acompañan a la muestra.
4. Registro de la fecha en que las muestras son destinadas a los analistas para ser examinadas.
5. Registro de la fecha en la que regresan a ser almacenadas.
6. Desecho de las muestras una vez que los resultados han sido entregados.
5.3.4 Toma de porciones de muestra para los análisis
Es recomendable que para evitar la contaminación del medio ambiente, el pesado de las porciones
de muestra requeridas para el análisis, se lleve a cabo en un espacio cerrado o en una cabina de
seguridad. Sin embargo, si no se cuenta con un espacio con estas características en el laboratorio,
las muestras deberán pesarse cerca de la flama. Las que contengan pocos microorganismos
(productos pasteurizados o térmicamente tratados) deberán ser examinadas antes que las muestras
que presenten contaminación elevada.
El manejo de las muestras debe prevenir cualquier tipo de contaminación por lo que se deberán
tomar en cuenta las siguientes precauciones:
 Si se trata de un producto empacado, se recomienda lavar el empaque con etanol al 70 % y

una vez abierto tomar la muestra cerca de la flama.
236
 Los instrumentos usados para abrir empaques (tijeras, sierra, etc.) deberán estar estériles.
Los instrumentos para la toma de muestras (cucharas, pinzas, pipetas, etc.) deberán estar estériles
(BS 5763-0:1986).
5.3.5 Desecho de las muestras
Las muestras deberán ser conservadas y almacenadas a la temperatura apropiada hasta que se
reporten los resultados del o los análisis. Una vez que se emitan los resultados, las muestras podrán
ser desechadas. El personal encargado deberá descontaminar las muestras que se encuentren en
estado de descomposición previo a su deshecho.
5.4 EQUIPO
Se recomienda el establecimiento de un programa de mantenimiento, inspección y calibración de

equipos e instrumentos de laboratorio tales como balanzas, termómetros, potenciómetros, baños de
agua, espectrofotómetros, micropipetas y todos aquellos involucrados en la precisión y exactitud del
resultado de una medición.
5.5 MATERIALES
Los materiales de laboratorio (pipetas, tubos de ensayo, cajas Petri) deben ser sometidos a un
proceso que garantice su limpieza y esterilidad hasta el momento de su uso.
5.5.1 Limpieza
Todo el material deberá permanecer limpio y libre de residuos de medios de cultivo. Deberá
almacenarse bajo condiciones que ayuden a conservar su limpieza y lo protejan del polvo y la
contaminación ambiental (BS 5763-0:1986).
Se recomienda tomar en cuenta el siguiente procedimiento de limpieza:
1. Lavar con detergente comercial a 70 °C. En ausencia de un detergente comercial puede

usarse una disolución de carbonato de sodio al 0.125 % (p/p), seguida de una inmersión en
ácido diluido (HCl 0.1 mol/l) (BS 5763-0:1986).
2. Enjuagar con agua a 80 °C.
3. Enjuagar con agua destilada o desionizada.
4. Secar el material.
Para los materiales nuevos es conveniente dejarlos reposar una noche en agua destilada,
comprobándose la neutralidad de su pH.
Para confirmar la ausencia de residuos ácidos o alcalinos (enjuague efectivo), se recomienda

realizar análisis rutinarios sobre el material aplicando azul de bomotimol, el cual es un indicador
que cambia de amarillo a verde-azul en un rango de pH de 6.5 a 7.3. Dado que las soluciones de
limpieza son en su mayoría ácidos o bases, la aplicación de unas gotas de este indicador sirve para
asegurar su ausencia (Lightfoot y Maier, 1998).
237
5.5.2 Esterilización
La esterilización del material de laboratorio puede realizarse siguiendo los lineamientos de los
estándares británicos (BS 5763-0:1986) que a continuación se describen:
1. Esterilización en autoclave: proceso térmico a 121 °C durante 15 minutos. Los envases y

material que tengan tapa deberán estar abiertos o con un cierre flojo para permitir la entrada
del vapor en el recipiente.
2. Esterilización en estufa de aire caliente: el material se esteriliza a 170 °C-180 °C durante al

menos una hora.
El material esterilizado deberá acomodarse en contenedores especiales o envuelto en un material

apropiado y almacenarse bajo condiciones que mantengan su esterilidad.
Cuando se esterilice un material deberá escribirse la fecha de caducidad de la esterilidad. El

material sellado herméticamente puede ser almacenado por 3 meses antes de ser usado. El material
empacado que no esté herméticamente sellado puede almacenarse por un periodo de tiempo más
corto, por ejemplo 8 días (BS 5763-0:1986).
Se puede hacer uso de materiales desechables (cajas Petri, pipetas, botellas). Sin embargo es
importante asegurarse con el productor de que el material es apropiado para llevar a cabo análisis
microbiológicos: que sea estéril y que no contenga sustancias que inhiban el crecimiento de los
microorganismos (BS 5763-0:1986).
5.5.3 Descontaminación
Después de uso (cultivo de microorganismos o contacto con microorganismos) y antes de ser

desechado o limpiado, el material y su contenido deberán ser descontaminados. El proceso de
descontaminación puede llevarse a cabo por medio de las dos técnicas siguientes:
1. Esterilización en autoclave por al menos 30 min a 121°C mínimo, para todo el material que
ha estado en contacto con cultivos de microorganismos.
2. Descontaminación por inmersión en una disolución desinfectante para materiales pequeños

resistentes a la corrosión como por ejemplo pipetas (BS 5763-0:1986).
El material desechable deberá descontaminarse antes de ser enviado a los residuos (BS 5763-
0:1986).
5.6 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
La calidad de los análisis microbiológicos depende también de la adecuada preparación de los

reactivos y medios de cultivo. Aunado a ello, es necesario almacenar los medios y reactivos en
condiciones adecuadas para evitar su degradación o transformación.
5.6.1 Recepción
238
Se deberá mantener un registro de todos los reactivos y medios de cultivo que entran al laboratorio
que contenga los siguientes datos:
a. Datos sobre el reactivo/medio: nombre del producto, código del fabricante, no. de lote y
fecha de caducidad.
b. Fecha de recepción.
c. Empleado que lo recibió.
d. Localización del almacén en que se encontrará el producto (Pouch-Downes e Ito, 2001).
Se recomienda etiquetar los envases de los medios/reactivos indicando la fecha de recepción,

apertura y fecha de caducidad para detectar los productos que deben desecharse.
5.6.2 Almacenamiento
Se recomienda tomar en cuenta las recomendaciones del fabricante para el almacenamiento de

medios y reactivos. En general se pueden tomar en consideración los siguientes lineamientos:
1. Los medios de cultivo contenidos en tubos, recipientes o cajas Petri deberán tener una
etiqueta que contenga la siguiente información: nombre del medio, fecha de preparación y
fecha de caducidad.
2. Mantener los envases con medios de cultivo deshidratados bien cerrados para evitar que se
humedezcan. Almacenarlos en un lugar fresco, seco y protegidos de la luz.
3. Todos los medios de cultivo y reactivos que se colocan en tubos y botellas y que no son
usados inmediatamente deben protegerse de la luz y desecación (BS 5763-0:1986).
4. Los medios de cultivo preparados pueden conservarse durante tres meses en refrigeración
(entre 4 °C y 6 °C) o un mes máximo a una temperatura entre los 18 °C y los 23 °C (BS
5763-0:1986).
5. Los medios de cultivo esterilizados en autoclave deben fundirse una sola vez y se podrán
mantener en este estado a 45 °C -50 °C durante un máximo de 8 horas antes de su uso
6. Evitar un almacenamiento mayor a seis meses de un medio o reactivo.
7. Los reactivos/medios que presenten cambios en la consistencia o color deben ser

desechados.
8. Los medios que contengan tintes deberán protegerse de la luz mediante su almacenamiento
en un cuarto oscuro, en envases oscuros o cubriéndolos con papel aluminio (Pouch-Downes
e Ito, 2001).
9. Las disoluciones de colorantes y antibióticos no deberán conservarse por más de tres meses
10. El almacenamiento de las cajas Petri debe ser en refrigeración y en la oscuridad, por una
semana máximo (BS 5763-0:1986).
5.6.3 Preparación de los medios de cultivo

239
Durante la preparación de los medios de cultivo debe tomarse en cuenta los siguientes aspectos:
1. Deberá usarse agua destilada y desionizada que cumpla con los parámetros mencionados en
el punto 1.3.3. Los recipientes deben estar limpios, ser neutros y no tóxicos (Lightfoot y
Maier, 1998).
2. Después de la esterilización y enfriamiento a 25 °C los medios deben ser monitoreados en

los siguientes parámetros: pH, color, esterilidad. El pH no debe modificarse después de
esterilizado el medio, en caso contrario deberá ajustarse al pH requerido usando HCl 1N o
NaOH 1N (Lightfoot y Maier, 1998).
3. Se debe llevar un registro de la preparación de los medios que contenga los siguientes
datos:
 Nombre del medio
 Fecha de preparación del medio
 Persona que lo preparó
 Fecha de caducidad del medio
 Número y volúmenes de contenedores preparados (tubos, frascos)
 Cantidad de polvo deshidratado y de cada componente
 Volumen de agua
 Condiciones de esterilización del autoclave
5.7 MANTENIMIENTO DE REGISTROS
Se recomienda contar con un sistema de organización que permita almacenar y recuperar

rápidamente los registros.
Los registros con los que debe contar un laboratorio son:
1. Registros (bitácoras) sobre información analítica de las muestras que incluye la descripción
de la muestra, las condiciones de almacenamiento de la muestra, la descripción de los
métodos analíticos utilizados, datos obtenidos, observaciones, cálculos y conclusiones.
2. Registros sobre investigaciones realizadas para desarrollar o actualizar métodos analíticos.
3. Registros sobre la información para el aseguramiento de la calidad que se expiden cuando

se realiza cualquiera de las siguientes operaciones:
 Calibración de instrumentos analíticos.
 Registro de temperaturas de baños de agua, refrigeradores, congeladores,

incubadoras, etc.
 Registro de presión y temperatura de las autoclaves.
240
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MANUAL INTEGRADO DE LA NORMATIVIDAD Y MÉTODOS DE DETECCIÓN Y MEDICIÓN DE ORGANISMOS

Centro Nacional de Metrología

Compilado y escrito por:

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®2013 por el Centro Nacional de Metrología

Primera Edición consta de 1000 ejemplares

Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida, almacenada en un sistema o

Agradecimientos por su contribución en la elaboración del presente manual

Dr. Cristóbal Chaidez Quiroz

Dra. Josefina León Félix

Dr. Osvaldo López Cueva

Dra. Hilda Karina Ramírez Medina

QFB Célida Isabel Martínez Rodríguez

QFB Jesús Hector Carrillo Yáñez

Dra. Nohelia Castro del Campo

Dr. Miguel Betancourt Lozano

M.C. Leobardo Montoya Rodriguez

M.C. Jesus Efren Astorga Rodriguez

Con el apoyo de los ayudantes de proyecto y tesistas de licenciatura:

p.IBQ Marycarmen Merino Sanchez . Instituto Tecnológico de Celaya

p.IBQ Alma Liliana Villarreal Cásares. Instituto Tecnológico de Durango

El Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) junto con la Secretaría de Agricultura,

ESTADO DEL ARTE

Un elemento clave para el reconocimiento y control de brotes es la capacidad de análisis de los

En el presente documento se condensan y se abordan diferentes normas para asegurar la inocuidad

En la actualidad existen en nuestro país ocho Normas Oficiales Mexicanas directamente

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NOM-114-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la determinación de Salmonella en

NOM-115-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la determinación de Staphylococcus aureus

NOM-143-SSA1-1995 Bienes y servicios. Método de prueba microbiológico para alimentos.

carbohidratos y la actividad hemolítica característica del género. El método sugiere un

NOM-113-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la cuenta de microorganismos coliformes

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La acreditación de esos organismos, laboratorios y unidades es realizada por las entidades de

En la Ley Federal sobre Metrología y Normalización (LFMN) Artículo 81 se instituye al Sistema

1. NORMAS OFICIALES Y REGULACIONES NACIONALES E

monocytogenes UNE/ISO 11290-1:1997

2. TÉRMINOS Y DEFINICIONES DE MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS

Asépticamente: forma de mantener la ausencia completa de microorganismos vivos en un medio.

Bloque; pieza: muestra cuya composición y dimensiones (superficie y espesor, pero

Coliformes: bacilos Gram negativos, no esporulados aerobios o anaerobios facultativos, que a 35

Detección de Salmonella: determinación de la presencia o ausencia de estos microorganismos en

Determinación del número de estafilococos coagulasa-positivos: determinación del número de

Detección de Listeria monocytogenes: determinación de la presencia o ausencia de estos

Diluciones decimales adicionales: las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un

Diluciones decimales sucesivas: suspensiones o disoluciones obtenidas al mezclar un volumen

Enterobacteriaceae: microorganismo que fermenta la glucosa y muestra reacción negativa a la

Estafilococos coagulasa-positivos: bacterias que forman colonias características y/o no

Norma específica: Norma internacional o documento de apoyo que describe el análisis de un

Productos perecederos: grupo de alimentos que por su naturaleza biológica y físico-química, su

Recuento de enterobacteriaceae: el número de Enterobacteriaceae encontrado por mililitro o por

Recuento de Listeria monocytogenes: determinación del número de unidades formadoras de

Salmonella: microorganismo patógeno perteneciente al grupo de las Enterobacterias. Bacilo gram

Suspensión inicial (dilución primaria): suspensión, disolución o emulsión obtenida cuando un

Vibrio parahaemolyticus: microorganismo halófilo que forma colonias características en medio

± más menos M molar

/ signo de división ml, mL mililitro

% por ciento min minuto

1/d inversa de la dilución N normal

ß beta NMP número más probable

cbp cuanto basta para p peso