PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO POR FERMENTACIÓN EN

ESTADO SÓLIDO USANDO BAGAZO DE CAÑA

Microorganismo utilizado: Aspergillus niger

Mantenido en tubos inclinados de agar de dextrosa de patata (PDA).
Almacenado a 4ºC, subcultivado cada dos semanas.
- Medio de preparación:
El bagazo debe ser secado en un horno, cortado en pedazos pequeños,
filtrado para recoger 4 fracciones de diferentes tamaños de partícula:
x<0.64 mm; 0.64<x<1.2 mm; 1.2mm<x<1.6mm; 1.6mm<x<2mm
Del tamaño de partícula de bagazo que se desee evaluar se toman 3 g
en un Erlenmeyer de 250 mL. Se humedece con:
15-20% sacarosa y melaza
0.25% NH4NO3
0.1% KH2PO4
0.025% MgSO4
0.004% CuSO4
pH=4
Ajustar el nivel de humedad deseado con los respectivos porcentajes.
En seguida, se debe esterilizar el medio a 121ºC por 60 min.
El bagazo de caña es clarificado por tratamiento con ferrocianuro de
potasio: La solución es diluida con agua destilada dos veces a la
concentración deseada y el pH se ajusta a 4.5. Los iones de metales
pesados son precipitados por adición de 0.1%(P/V) de ferrocianuro de
potasio seguido de un calentamiento a 90ºC por 20 min. Se filtran los
iones pesados y la solución filtrada es pasada a través de carbón
activado para obtener una solución de bagazo clarificado.
- Aislamiento del organismo:
El organismo se obtuvo al dejar pedazos de limón en el piso en
diferentes lugares, luego de un par de días el hongo creció en cada
pedazo de limón. Las esporas de cada pedazo fueron transferidas por
separado a una placa con PDA e incubadas a 30ºC. Luego de dos días
se puede ver el crecimiento en cada placa. Las suspensiones de esporas
son preparadas por separado para cada placa, se diluyen
convenientemente, transferidas en otra placa con PDA e incubadas a
30ºC por dos días. Las esporas de las colonias aisladas
independientemente son tomadas de cada placa transferidas de
manera estéril a otras placas de PDA e incubadas a 30ºC por dos días.
En total se obtuvieron 400 aislamientos y fueron almacenados a 4ºC
- Selección de las cepas:
Se colocan filtros de papel en placas de Petri, los cuales fueron
anteriormente esterilizados y remojados con el medio base de sacarosa
esterilizada. Las placas de Petri son inoculadas con las esporas de
diferentes cepas y son incubadas a 30ºC por 3 días. Se detectó
formación de ácido por la aparición de un color rosa alrededor de la
colonia, debido a que se introdujo una solución indicadora de pH con
rango 1-10.5.
El ácido cítrico fue producido a partir del cultivo de bagazo humedecido
con el medio base de sacarosa en matraces de 250 mL por 8 días. El
material fermentado fue extraído usando agua destilada y la cantidad
de ácido de los extractos fue determinada.
- Inóculo:
Un mililitro de suspensión de esporas de concentración 2*10 7
esporas/mL fueron usadas en cada experimento.
- Fermentación:
Cada matraz que contenía el medio fue inoculado con 1 mL de
suspensión de esporas seguido de un mezclado para luego ser incubado
a 30ºC, en una incubadora con control de humedad.
Se adicionó metanol al medio antes de la inoculación. Un matraz fue
seleccionado cada día para la estimación del ácido cítrico producido y el
azúcar que se consumió. Éste procedimiento se siguió haciendo cada
día hasta que todo el azúcar del medio fue consumido.
- Métodos analíticos:
La cantidad de azúcar fue estimada por el método de ácido sulfúrico
fenol de Dubois y el ácido cítrico por el método de anhídrido acético y
piridina de Marier y Boulet.

Fuente: Kumar, Jain, Shanker, Srivastava. Citric acid production by solid

state fermentation using sugarcane bagasse. Process biochemistry. 2003.
Pp 1731-1738.
- Crecimiento del hongo:

Poner esporas en PDA e incubar

a 30ºC.

2 días después, transferir las

esporas seleccionadas en otro
PDA e incubar a 30ºC por 2 días.

Las cepas finales deben ser

almacenadas a 4ºC.

- Preparación del medio: - Seleccionar la cepa: - Fermentación en estado sólido:

Elección del tamaño de partícula del
bagazo.
Erlenmeyer de 250 mL.
Preparar la solución del medio.
Esterilizar a 121ºC por 60 min.
Clarificar.
Poner filtros de papel esterilizados Matraces de 250 mL.
remojados con el medio.
Poner el medio de fermentación.
Introducir solución indicadora de pH (1-
Inocular con 1 mL de la suspensión de
10.5).
esporas.
Inocular las placas de Petri con 2*10 7
Mezclar e incubar a 30ºC por 8 días.
esp/mL de las esporas seleccionadas.
Almacenar a 30ºC por 3 días