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Scientia Agropecuaria

ISSN: 2077-9917
sci.agropecu@unitru.edu.pe
Universidad Nacional de Trujillo
Per

Castillo Caldern, Augusto; Chamy Maggi, Rolando


Produccin de inulinasa por levaduras de Kluyveromyces marxianus
Scientia Agropecuaria, vol. 1, nm. 3-4, 2010, pp. 235-245
Universidad Nacional de Trujillo
Trujillo, Per

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=357633696007

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Scientia Agropecuaria 1(2010) 235 - 245

Facultad de Ciencias
Scientia Agropecuaria Agropecuarias
Universidad Nacional de Trujillo

Produccin de inulinasa por levaduras de Kluyveromyces marxianus

Inulinase production by yeat Kluyveromyces marxianus


Augusto Castillo Caldern1,*, Rolando Chamy Maggi2
1
Escuela de Ingeniera Agroindustrial, Universidad Nacional del Santa. Av. Universitaria s/n, Urb. Bellamar, Chimbote, Per.
2
Escuela de Ingeniera Bioqumica, Pontificia Universidad Catlica de Valparaso. Av. Brasil 2950, Valparaso, Chile.
Recibido 04 agosto 2010; aceptado 22 octubre 2010
Resumen
En este trabajo se han revisado los principales avances alcanzados en los ltimos veinte aos, en el estudio de la
fermentacin de cepas de Kluyveromyces marxianus para la produccin de la enzima inulinasa a partir de inulina
pura y fuentes de inulina y la determinacin de las propiedades y caractersticas de la enzima. Con el propsito de
recopilar y esclarecer el mayor conocimiento de sta rea, la investigacin de sta materia ha sido dividida en tres
partes: sustratos fuentes de inulina; produccin microbiana de inulinasa y caracterizacin y propiedades de la
inulinasa. Se discute la informacin existente sobre los microorganismos capaces de producir inulinasa los que han
sido publicados con datos de rendimiento y en particular las condiciones de fermentacin de cepas de Kluyveromyces
marxianus para la produccin de inulinasa a partir de varias fuentes vegetales de inulina. Se concluye que si bien es
cierto existen cepas de Kluyveromyces marxianus capaces de producir satisfactoriamente inulinasa, la investigacin
para una fuente vegetal de inulina econmicamente interesante todava est en curso.
Palabras clave: Kluyveromyces marxianus, inulinasa, inulina.

Abstract
In this work the principal advances have been checked reached in the last twenty years, in the study of the
fermentation of strains of Kluyveromyces marxianus for the production of the enzyme inulinase from inulin pure and
sources of inulina and the determination of the properties and characteristics of the enzyme. With the aim of
gathering and clarifying the greater knowledge of this one area, the investigation of this matter has been divided into
three principal parts; substrate sources of inulin; microbial production of inulinase and characterization and
properties of the inulinase. There is discussed the existing information about the microorganisms capable of
producing inulinase those who have been brought by information of performance and especially the conditions of
fermentation of strains of Kluyveromyces marxianus for the production of inulinase from several vegetable sources
of inulin. One concludes that though it is true there exist strains of Kluyveromyces marxianus capable of producing
satisfactorily inulinase, the investigation for a vegetable source of inulin economically interesting still is in process.
Keywords: Kluyveromyces marxianus, inulinase, inulin.

1. Introduccin (Ricca et al., 2007). De ah el inters por su


estudio para producirla, purificarla y
La inulinasa es una enzima caracterizada por
caracterizarla a partir de cultivos microbianos
hidrolizar la inulina en fructosa prcticamente
en medios sintticos, siendo las levaduras
pura, ampliamente usada en la industria de
Kluyveromyces marxianus las ms estudiadas.
alimentos como edulcorante diettico con un
Recientemente se han publicado estudios de
poder de dulzor de 1.5 a 2 veces la sacarosa
produccin de inulinasa por fermentacin de
________________
* Autor para correspondencia
E-mail: acascal2002@yahoo.es (A. Castillo)
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Kluyveromyces marxianus en extractos de una cadena lineal de enlaces (2-1) fructosil-


yacn, de esprragos y de tubrculos de dalia, fructosa; al final de la cadena est presente
con altos rendimientos de actividad una unidad de glucosa a travs de un enlace
enzimtica (Cazetta et al., 2005; Singh y tipo sacarosa. En la inulina de origen vegetal,
Bhermi, 2008; Singh et al., 2007b). Por tanto las unidades de fructosas enlazados a la
es necesario determinar recientes evidencias glucosa terminal puede variar desde algunas
de mejoramiento de la produccin de unidades hasta 70, lo que significa que la
inulinasa por fermentacin de Kluyveromyces inulina es una mezcla de oligmeros y
marxianus, ya sea descubriendo nuevas cepas polmeros, definindose como un polifructano
salvajes de esta levadura, obteniendo otras con grado de polimerizacin (DP) mayor a 30
por insercin molecular u optimizando los unidades (Pedreschi et al., 2003; Ricca et al.,
componentes del medio de cultivo con 2007; Seminario et al., 2003).
nutrientes tantos sintticos orgnicos e La hidrlisis completa de la inulina genera
inorgnicos y sustratos complejos como el fructosa y glucosa con un grado de
extracto de yacn y evaluando las concentracin proporcional al DP inicial del
condiciones del cultivo microbiano como son polisacrido. El DP y la ramificacin
la temperatura, el pH y la velocidad de dependen del origen vegetal de la inulina.
agitacin. Comercialmente existe inulina de achicoria,
Este trabajo tiene como objetivo determinar el dalia y alcachofa Jerusalem, con un DP
avance cientfico y tecnolgico de la promedio de 28 (Ricca et al., 2007). Se han
fermentacin de cepas de Kluyveromyces publicado que las propiedades de la inulina
marxianus para la produccin de inulinasa no solo dependen del tipo de planta sino
logrados en los ltimos veinte aos, desde la tambin del manejo agronmico y
informacin a nivel de laboratorio como a almacenamiento que se haya dado, como son
escala piloto, que motiven realizar estudios de los casos de las races de achicoria,
factibilidad de instalacin de plantas de esprragos y yacn (Graefe et al., 2004; Irvin
produccin de enzimas, en el pas. En tal y Hurst, 1993; Siomos et al., 2010).
sentido, el trabajo comprendi el estudio de
Una propiedad limitante del uso de inulina es
las materias primas fuentes de inulina, su baja solubilidad en agua (6% a 10 C y 35
microorganismos productores de inulinasa, % a 90 C). Sin embargo el proceso de
con nfasis a la produccin por fermentacin extraccin a partir de vegetales es sencillo, tal
de cepas Kluyveromyces marxianus y la como lo de muestran la produccin de
determinacin de las caractersticas y extracto de yacn y concentrado de inulina de
propiedades de la enzima.
races de achicoria y dalia y turiones de
esprragos (Leite et al., 2007; Ricca et al.,
2. Sustratos fuente de inulina 2007; Singh y Bhermi, 2008; Kango, 2008).
La inulina es el componente base de un Ricca et al. (2007) muestran los contenidos
sustrato empleado como fuente de carbono de inulina de la cebolla, alcachofa, ajo,
para la produccin microbiana de inulinasa, pltano, y achicoria, observndose los que
sea como inulina pura o como extracto de tienen mayor contenido del polisacrido son
materiales vegetales o materias primas la alcachofa Jerusalem y la achicoria con 19 y
renovables (Cazetta et al., 2005; Rocha et al., 20 % peso respectivamente (base hmeda).
2006; Sangeetha et al., 2005; Singh y Bhermi, Los rendimientos en inulina de las races y
2008). tubrculos son altos.
La inulina es un fructano, un polisacrido Sin embargo, la mayora de las materias
almacenado en muchas plantas y consiste de primas investigadas son costosas o tienen

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limitada disponibilidad, a excepcin del La inulinasa puede ser obtenida a partir de


esprrago que contiene inulina sobre el 15% y especies vegetales y de muchos
su produccin anual mundial es superior a la microorganismos, siendo los ltimos capaces
achicoria, la alcachofa Jerusalem y la dalia. de producir suficiente enzima para
Por lo que generalmente, la factibilidad de aplicaciones industriales. Por esta razn en
escalamiento para la produccin de una stas tres ltimas dcadas se han realizado
enzima est basada en el alto rendimiento del esfuerzos significativos por encontrar u
microorganismo y la disponibilidad y lo obtener la mejor fuente microbiana para la
barato que signifiquen las materias primas produccin de inulinasa, incluyendo hongos
(Singh y Bhermi, 2008). filamentosos (Otha et al., 2004), levaduras
(Rouwenhorst et al., 1988; Singh et al.,
Se aprecia que estas fuentes de inulina han
2007a; Zhang et al., 2009; Yu et al., 2009) y
recibido especial atencin en la investigacin
bacterias (Zherebtsov et al., 2003; Ricca et
como materias primas renovables, para la
al., 2007).
produccin de bioetanol, inulooligosacridos
y jarabe de fructosa. El mejor procedimiento
promisorio para la obtencin de jarabe de 4. Microorganismos productores de
fructosa desde inulina y materiales vegetales inulinasa
que contienen inulina, incluye el uso de la La evaluacin de la produccin de una
enzima inulinasa microbiana que por enzima por fermentacin microbiana se
tratamiento hidroltico en un solo paso, se determina por los parmetros de rendimientos
obtienen rendimientos de hasta 95% de (unidad de actividad/ml de caldo de cultivo o
fructosa pura (Chi et al., 2009; Ricca et al., unidad de actividad/mg de clulas) de la
2007). enzima obtenida y por las propiedades de la
enzima que dependen del tipo de
3. Enzimas inulasa microorganismo empleado, del modo de
fermentacin, del medio de cultivo y las
La enzima que cataliza la hidrlisis de
condiciones de incubacin (Greasham y
enlaces -D-(2-1)- fructosdicos en la inulina
Inamine, 1986; Hensing et al., 1995; Liu et
originando fructosa y glucosa se le denomina
al., 2005; Xiong et al., 2007).
inulasa o -D-(2-1)- fructano fructohidrolasa
(E.C. 3.2.1.7), comnmente conocida como Muchas cepas de mohos, levaduras y
inulinasa, perteneciendo al grupo de bacterias son capaces de producir inulinasa y
clasificacin de enzimas hidrolasas varios de ellos han sido cultivados con xito y
glicosidasas (Kushi et al., 2000; Laloux et al., la enzima extrada, concentrada y purificada,
1991). como lo reportado en sendas publicaciones de
revisin (Chi et al., 2009; Pandey et al., 1999;
Las enzimas inulinasas se pueden dividir en
Otha et al., 2004; Ricca et al., 2007). Estos
exoinulinasas y endoinulinasas. Las
trabajos muestran cronolgicamente nuevos
exoinulinasas catalizan la remocin de
conocimientos sobre el mejoramiento de la
unidades de fructosa desde el inicio hasta el
produccin de inulinasas, caracterizacin de
final de la cadena con la hidrlisis del residuo
nuevas inulinasas, clonacin y expresin de
de sacarosa. Las endoinulinasas catalizan la
genes de inulinasas y sus respectivas
hidrlisis de los enlaces internos de la
aplicaciones. Tambin se confirm que los
molcula de inulina, originando inulotriosa,
microorganismos ms comnmente utilizados
inulotetrosa e inulopentosa sin actividad
son las cepas de mohos como el Aspergillus
invertasa para hidrolizar el residuo de
sp y cepas de levadura como Kluyveromyces
sacarosa (Rouwenhorst et al., 1990).
sp, aunque las cepas de levadura producen

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ms inulinasa que las cepas de hongos y hemiascomyceto, es filogenticamente


bacterias. relacionada a Saccharomyces cerevisiae y es
una especie hermana de la mejor conocida
Entre las levaduras, adems de
Kluyveromyces lactis (Lane y Morrissey,
Kluyveromyces marxianus que tienen alto
2010). Una fotografa de Kluyveromyces
potencial para producir inulinasa con altos
marxianus se muestra en la figura 1.
rendimientos aceptables comercialmente, se
han publicado ltimamente que, se han
seleccionado y mutado nuevas cepas como
Geotrichum candidum (Mughal et al., 2009);
la levadura marina Pichia guilliermondii (Yu
et al., 2009) y se han clonado genes de
inulinasa INU1 de Pichia guilliermondii en
Pichia pastoris X-33 (Zhang et al., 2009)
alcanzndose rendimientos de: 71,85 U/ml en
48 h de cultivo; 127. 7 U/ml en 120 h y 286.8
U/ml en 120 h de fermentacin
respectivamente, siendo estos valores los ms
altos publicados a la fecha, aunque esto
involucra mayores tiempos de fermentacin.
Figura 1. Clulas de levadura Kluyveromyces
Considerando que los mayores esfuerzos marxianus creciendo en glucosa, bajo
estn dirigidos a producir inulinasa para condiciones aerbicas, cultivadas en matraces
aplicarlos en la produccin de jarabe shaker a 45 C y 120 rpm (Madeira, 2004).
enriquecido de fructosa, como un edulcorante
de bajo poder calrico, las cepas de 5. Produccin de inulinasa por cepas de
Kluyveromyces marxianus que tienen el Kluyveromyces marxianus
status de GRAS (Generally Recognized as
Safe) y QPS (Qualified Presumption of Segn Pandey et al. (1999), los mejores
Safety) en los Estados Unidos y en la Unin resultados de produccin de inulinasa son
Europea respectivamente, son preferidos para dados por los mohos Aspergillus nger (75
la produccin de inulinasa con fines U/ml) y A. nger A42 (4600 U/g). Tambin
alimentarios y biotecnolgicos (Lane y algunas cepas mutantes de levaduras, como
Morrissey, 2010). K. marxianus var. marxianus CBS 6556,
exhibieron rendimientos de 3000 U/ml;
Adems de ser la inulinasa una enzima nativa mientras que las bacterias no mostraron
de la levadura lechera Kluyveromyces comparables rendimientos de inulinasa.
marxianus, es especialmente adecuada para la
aplicacin industrial, por tener la mejor Las levaduras tienen la ventaja sobre los
velocidad de crecimiento que cualquier otro mohos de tener una mayor velocidad de
microbio eucariote, termotolerante, con generacin celular y adaptabilidad a
habilidad para crecer sobre los 52 C, diferentes condiciones y modos de cultivo, y
capacidad de asimilar un amplio rango de en esto las cepas de Kluyveromyces
azcares claves, como la lactosa e inulina y marxianus han sido ltimamente ms
una alta capacidad secretoria de enzimas estudiados. Cruz-Guerrero et al. (1995)
lticas, hacen de ste microorganismo lder de demostraron que la Kluyveromyces marxianus
todas las levaduras para muchos procesos CDBB-L-278 fue una levadura hper
biotecnolgicos. Kluyveromyces marxianus es productora de inulinasa parcialmente
una especie que incorpora muchos sinnimos, constitutiva y, aunque la cepa mostr tener
se describe como una levadura homotlica, una alta resistencia al 2-desoxiglucosa, la

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produccin de inulinasa fue reprimida Se ha evaluado la fermentacin de


catablicamente, al confirmarse que en una Kluyveromyces sp. Y-85 en un medio
fermentacin en un medio de 4 % de glucosa optimizado usando como fuente de carbono
y 4 % de inulina, la inulinasa comenz a extracto de alcachofa, la experiencia primero
producirse cuando los niveles de glucosa fue realizada en matraces a 30 C por 24
fueron lo suficientemente bajos, alcanzndose horas, alcanzndose el mximo rendimiento
un rendimiento de 82 U/ml al trmino de las de 59.5 U/ ml de medio compuesto por 8.0%
24 horas. de extracto de alcachofa; 2% de rea; 0.2%
extracto de carne y 4% de licor dulce de maz.
Tambin una levadura de Kluyveromyces
Posteriormente se evalu el efecto de la
marxianus var. bulgaricus fue evaluada
aireacin variando los volmenes de medio
primero en cultivo continuo en medios con
sobre la produccin de inulinasa, infiriendo
diferentes fuentes de carbono, en que los ms
que el oxgeno no influenci mucho en el
altos rendimientos de inulinasa fueron
rendimiento. Esta propiedad sera muy
obtenidos con sacarosa como sustrato
importante para el caso de una produccin
limitante, resultando valores de 107 U/ml
industrial, en cuanto se ahorrara costos de
para una velocidad de dilucin de 0.05 h-1 y
produccin (Wei et al., 1998).
0.81 U/ml para un valor de 0.45 h-1,
precisndose que los niveles de actividad de Con el medio optimizado se escal la
inulinasa en cultivos con sacarosa fueron fermentacin en un fermentador de 15 litros,
fuertemente dependientes de la velocidad de con un volumen de medio de 7 L, inculo 5%
dilucin y la levadura regulada por el azcar (v/v), a 30 C, aireacin 1.5 vvm y velocidad
residual en el cultivo continuo. Despus en de agitacin 400 rpm, alcanzndose un
cultivos en matraces de 250 ml, 50 ml de rendimiento promedio de 67.6 U/ml. Las
medio a 30 C, velocidad de agitacin 200 cinticas de fermentacin muestran que la
rpm, despus de 72 horas y de las respectivas sntesis de inulinasa se inhibi por la alta
etapas de purificacin se alcanzaron concentracin de carbohidrato reductor (> 2
actividades especficas con inulina de 170 g/l) en el medio de cultivo. Cuando la
U/mg, la ms alta, respecto con fructosa 94.2 experiencia se realiz en un fermentador de
U/mg, o con glucosa 59.5 U/mg o con torre de 1000 L se obtuvo un rendimiento
sacarosa 35.5 U/mg (Kushi et al., 2000). mximo de 68.9 U/ml, el ms alto reportado a
la fecha (Wei et al., 1998).
Kalil et al. (2001) en un estudio de
optimizacin de la produccin de inulinasa Se ha publicado la produccin de inulinasa
por Kluyveromyces marxianus ATCC 16045 por Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus
determinaron que las condiciones de cultivo en extracto de yacn al 30 % (v/v), habiendo
fueron: 14 g/l de sacarosa, 10 g/l de extracto mostrado esta levadura un alto potencial de
de levadura, 20 g/l de peptona, 1 g/l de produccin (4.1 U/ml a las 16 horas de
K2HPO4 y pH 3.5. La actividad enzimtica incubacin) y su gran capacidad de
fue de 127 U/ml. El K2HPO4 tuvo un efecto adaptacin en diferentes sustratos y su gran
positivo dbil sobre la actividad enzimtica crecimiento a diferentes valores de pH (pH
aunque estadsticamente fue significativa. 3,5 fue el ptimo) y en amplios rangos de
temperatura (20 a 40 C) (Cazetta et al.,
Desde un punto de vista industrial es
2005).
importante sealar que la inulina proveniente
de materias primas vegetales es considerada Xion et al. (2007) determinaron un medio de
como la mayor fuente de carbono, ms que la cultivo adecuado para obtener el mayor
inulina pura, como ha sido comprobado en rendimiento de inulinasa por Kluyveromyces
estudios reportados y que se describen a S120. El medio de fermentacin estuvo
continuacin. compuesto de 12.72 % de inulina, 10.76% de
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licor de maceracin de maz como fuente de marxianus YS-1 en matraces, demostraron


nitrgeno y 1.61% (NH4)2SO4, empleando que el rendimiento de enzima aument con el
salvado de trigo como sustrato slido, incremento del pH inicial del medio hasta un
alcanzndose un mximo rendimiento de valor de 6.5 a una produccin mxima de
inulinasa de 409.8 U/g de sustrato seco enzima de 24.5 U/ml y de ah el rendimiento
inicial, constituyndose el valor ms alto declin. Se recomend trabajar a un intervalo
publicado en la literatura de esa fecha. En la de pH inicial de 6.4 a 6.5 y temperatura de
cintica de fermentacin se observa que el 30C para una produccin ptima con esta
mximo rendimiento lo alcanz despus de cepa. En este estudio tambin se evalu el
las 96 horas de cultivo. Debido al efecto de la aireacin y agitacin sobre la
decaimiento del crecimiento celular despus produccin de inulinasa. La velocidad de
de 84 h o la degradacin parcial de inulinasa agitacin de 150 rpm y una aireacin de 1
por enzimas proteolticas, la produccin de vvm ha sido reportada como ptima para
inulinasa decay despus de 96 h; por lo que cultivos en matraces. La variacin de la
sugirieron que la inulinasa producida por velocidad de agitacin no solo afecta la
Kluyveromyces S120 pudo ser un ejemplo de disponibilidad de oxgeno, si no tambin
un producto asociado al crecimiento. ejerce influencia sobre la disponibilidad de
otros nutrientes en el medio. Por tanto la
Singh y Bhermi (2008) obtuvieron una alta
aireacin y agitacin son factores crticos
actividad de inulinasa (50.2 U/ml) a partir de
para K. marxianus, los que son responsables
la fermentacin K. marxianus YS-1 usando
de la viabilidad y produccin enzimtica.
extracto pulverizado de raz de esprrago (con
4 % de inulina), en un reactor de 1.5 Litros, Cuando K. marxianus NRRL Y-7571 creci
bajo agitacin de 1200 rpm y 0.75 vvm a 30 en un cultivo slido conteniendo bagazo de
C y despus de 60 horas de fermentacin, caa de azcar como soporte y fuente de
por lo que se concluy utilizar esta fuente carbono y suplementado con licor de maz
como materia prima, por ser abundante y como fuente de nitrgeno, la concentracin
barato. Adems se demostr por fermentacin de inulinasa extracelular alcanz el valor de
de K. marxianus YS-1 en matraces 391.9 U/g de bagazo seco fermentado
Erlenmeyer sobre el extracto de esprrago (Bender et al., 2006). Cuando se us salvado
conteniendo un mximo de 1.54% de inulina, de soja el tiempo de fermentacin para
que los mtodos de extraccin de inulina alcanzar la actividad mxima decreci de 96 a
desde los tubrculos de raz de esprragos, 24 h y la productividad mxima alcanzada
ejercieron tambin efecto sobre el por K. marxianus NRRL Y-7571 fue de 8.87
rendimiento de inulinasa. U/ g.h (Mazutti et al., 2006).
Se ha demostrado que el tipo de sustrato tiene Mazutti et al. (2010) evaluaron la cintica del
efecto sobre la naturaleza extra e intracelular crecimiento celular y produccin de inulinasa
de la enzima. Esta propiedad depende por K. marxianus NRRL Y-7571 en un
principalmente de la clase de microorganismo reactor de lecho empacado con bagazo de
empleado, particularmente, la mayora de caa, melaza de caa, licor de maz y salvado
hongos produce enzima extracelular, mientras de soja por efecto de la temperatura del aire
que las levaduras producen ambas, tanto en el de ingreso y el caudal volumtrico de aire, los
medio de cultivo como en el interior de la mismos que correspondieron a valores
clula (Rouwenhorst et al., 1990). ptimos de 30 C y 3 m3/h, alcanzando una
actividad promedio de 463 U/g de slido
Singh et al. (2007b), en un estudio de
seco. Concluyeron que estos resultados
optimizacin de medio y parmetros de
pueden ser usados para el escalamiento y
proceso para la produccin de inulinasa a
optimizacin de la configuracin de
partir de una nueva cepa de Kluyveromyces
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bioreactores de lecho empacado para la produccin de inulinasa y utilizar fuentes


produccin de inulinasa. naturales de inulina como extractos de yacn,
esprragos y alcachofas. Por tanto la
Una lista resumen de cepas de K. marxianus
factibilidad del escalamiento para la
productoras de inulinasa se reporta en la tabla
produccin enzimtica industrial est basada
1, notndose que ellas producen inulinasa con
grandemente en el alto rendimiento del
una alta actividad enzimtica. Para mejorar
microorganismo, el sustrato base a emplear y
los resultados mostrados es importante evitar
el diseo del proceso de fermentacin.
los efectos de represin por glucosa sobre la

Tabla 1
Cepas de Kluyveromyces marxianus y rendimientos en inulinasa.

Tipo de Rendimiento
Microorganismo Referencia
cultivo U/ml
Kluyveromyces sp. Y-85 Lquido 59.5 Wei et al., 1998
K. marxianus Liquido 43.7 Pandey et al., 1999
K. marxianus ATCC 36907 Lquido 260 Pandey et al., 1999
K. marxianus ATCC 52466 Lquido 0.418 Pandey et al., 1999
K. marxianus CDBB-L-278 Lquido 82 Cruz-Guerrero et al., 1995
K. marxianus var. marxianus CBS 6556 Lquido 3000 Pandey et al., 1999
K. marxianus UCD(FST) 55-82 Lquido 212 Pandey et al., 1999
K. marxianus var.bulgaricus Continuo 107 Kushi et al., 2000
K. marxianus ATCC 16045 Lquido 121 Silva-Santisteban y Filho, 2005
K. marxianus var.bulgaricus Lquido 4.1 Cazzeta et al., 2005
K. marxianus (A1 y A2) Lquido 32 Cruz-Guerrero et al., 2006
K. marxianus NRRL Y-7571 Slido 3 91.9 U/g Bender et al., 2006
K. marxianus NRRL Y-7571 Lquido 8.87 U/g.h Mazutti et al., 2006
Kluyveromyces S120 Slido 409.8 U/g Chen et al., 2007
K. marxianus YS-1 Lquido 24.5 Singh et al., 2007b
K. marxianus YS-1 Lquido 50.2 Singh y Bhermi, 2008
K. marxianus NRRL Y-7571 Slido 463 U/g Mazutti et al., 2010

6. Caracterizacin y propiedades de la El proceso de extraccin de la inulinasa,


inulinasa adems de determinar el rendimiento y si la
La inulinasa (E.C. 3.2.1.7) es una enzima enzima es extracelular o intracelular,
miembro de la familia de glicsido hidrolasa determina otras caractersticas como su peso
32(GH32), la cual catalisa la hidrlisis de molecular (MW), su modo de accin sobre la
inulina a fructosa. La purificacin de molcula de inulina, su actividad hidroltica
inulinasa microbiana extracelular es hecha sobre la sacarosa, respuesta a los cambios de
por mtodos convencionales de pH y temperatura, propiedades cinticas y
centrifugacin, ultrafiltracin, precipitacin efecto de la concentracin de sustrato (Chi et
con solventes o sales, cromatografa de al., 2009).
intercambio inico y de permeacin en gel, Se ha reportado diferentes valores de MW
mientras que las inulinasa intracelular
dependiendo de la fuente de microorganismo,
requiere disrupcin celular antes de practicar del mtodo de determinacin, as por ejemplo
los mtodos reportados para las enzimas para la K. marxianus var. bulgricus vara de
extracelulares (Kushi et al., 2000).

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57 a 77 KDa (Kushi et al., 2000) y para K. y pH dependen del tipo de microorganismo


marxianus CBS 6556 se determin un valor usado como fuente, generalmente se da
de 64 KDa (Rouwenhorst et al., 1990). valores ms altos para bacterias y levaduras
que mohos. As se tienen los rango de valores
Se ha determinado que las inulinasas pueden
de pH, para mohos 4.5 7.0, para levaduras
ejercer dos modos de accin diferentes sobre
4.4- 6.5 y para las bacterias 4.8 7.0 (Ricca
la molcula de inulina, una accin extrema y
et al., 2007). Singh et al. (2007b),
una accin interna, correspondiendo dos
determinaron que la exo-inulinasa de
clases de inulinasas llamadas exo-inulinasas y
Kluyveromyces marxianus YS-1 exhibi
endo-inulinasas respectivamente. Las exo-
considerable actividad a un valor de pH
inulinasas (74 KDa, pH 5.1 7.0) empiezan
ptimo de 5.5 en que mantuvo estable su
con la separacin de la primera molcula de
actividad cataltica al 100% durante 3 h a la
D-fructosa y va hasta el ltimo enlace para
temperatura ptima de 50 C. Se observa que
liberar glucosa de la unidad de sacarosa y la
todava existe la necesidad de investigar la
endo-inulinasa (64 KDa) acta sobre enlaces
actividad y estabilidad de la inulinasa contra
internos y rinde un conjunto de inulo-
la temperatura, as como los modelamientos y
oligosacridos (inulotriosa, inulotetrosa y
simulacin de procesos o cintica de
inulopentosa) pero sin actividad invertasa.
desactivacin de la enzima.
Estas propiedades dependen del origen
microbiano de la enzima. De este punto de Por otra parte se han evaluado los parmetros
vista la mejor cepa sera la que tenga ambas cinticos de inulinasas provenientes de
propiedades, como el caso del A. ficuum diferentes fuentes de microorganismos en
(Pandey et al., 1999), dado que una mezcla de torno a solo un valor de temperatura ptima.
endo y exo inulinasa puede resultar en una Kushi et al. (2000) determinaron los valores
mejor conversin de inulina a fructosa que de los parmetros cinticos aparentes Km y
solo utilizar enzimas puras aisladas, dado que Vmax de la inulinasa purificada por HPLC de
las endo-inulinasas romperan las molculas Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus
de inulina en muchos oligosacridos, ATCC 16045 en presencia de inulina y
aumentando as los puntos de ataque para las sacarosa siendo 86.9 mg/ml y 53.7 U/mg de
exo-inulinasas, con el consecuente protena y 4.58 mg/ml y 441.0 U/mg de
incremento de la velocidad de reaccin de protena a 55 C y pH 4.4 ptimos,
inulina a fructosa. respectivamente, demostrando que la enzima
producida es una exo-inulinasa con ms alta
Por tanto queda probado que las exo-
afinidad y reactividad por la sacarosa que por
inulinasas tambin ejercen actividad cataltica
la inulina. De Paula et al. (2008) tambin
sobre la sacarosa, desdoblndola en glucosa y
determinaron los valores de los parmetros
fructosa, es decir tienen actividad de
cinticos de un caldo crudo exento de clulas
invertasa. Se afirma que la actividad invertasa
conteniendo inulinasa de Kluyveromyces
es mayor en enzimas producidas por
marxianus var. bulgaricus ATCC 16045
levaduras que en aquellas obtenidas a partir
siendo de Km igual a 61.83 mM y Vmax igual a
de mohos (Ricca et al., 2007). Notoriamente
37.60 U/mg de protena a 55 C y pH 3.5
una actividad invertasa de inulinasa es
ptimos.
deseable. Laloux et al. (1991) sostienen que
las inulinasas poseen sitios catalticos
comunes, pero diferentes sitios de enlace para 7. Inmovilizacin
la hidrlisis de inulina y sacarosa. Un medio crudo libre de clulas de un cultivo
La actividad y estabilidad depende de la de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus
respuesta de la enzima a los cambios de ATCC 16045 fue inmovilizado en gelatina
temperatura y pH. Los valores de temperatura tratado con glutaraldehdo resultando con una
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actividad de inulinasa del 82.20 %. Sus hidrlisis fue del 93 % alcanzndose una
parmetros cinticos fueron de Km igual a concentracin de fructosa de 42 g/l al trmino
149.28 mM y Vmax igual a 31.45 U/mg de de 3 horas. Estos mismos resultados se
protena a 55 C y pH 3.5 ptimos. La obtuvieron cuando las clulas inmovilizadas
inulinasa inmovilizada actu con una se reusaron durante 10 lotes. Cuando se oper
eficiencia de conversin de sacarosa del el reactor continuo con 65.7 g/l de clulas
58.12 % en un reactor continuo de lecho fijo inmovilizadas se obtuvo un aproximado del
operando por 33 das (de Paula et al., 2008). 100 % de hidrlisis, a velocidades de dilucin
Clulas de Kluyveromyces marxianus con menores a 1.26 h-1.
actividad de inulinasa, fueron inmovilizados
en alginato de bario tratado con
glutaraldehdo, mantenindose una actividad 8. Conclusiones
residual del 85 % y una eficiencia del sistema
() de 0.79 para un dimetro de partcula de En este estudio de revisin, se han
1.43 mm. El coeficiente de difusin (DE) de determinado a la actualidad, un conjunto
la inulina hacia el interior del soporte fue de cepas de Kluyveromyces marxianus con gran
2.5x10-6 cm2s-1 mientras que el mdulo de potencial biotecnolgico para producir
Thiele () fue cercano a 1, confirmndose inulinasa, pero la investigacin para una
que el factor limitante del sistema fue la fuente vegetal de inulina econmicamente
resistencia difusional del sustrato. Sus interesante todava est en curso. Desde un
parmetros cinticos fueron de Km igual a punto de vista industrial, el uso de inulina de
0.522 mM y Vmax igual a 113.7 molmin-1 de vegetales como materia prima para la
protena (Barranco-Florido et al., 2001). produccin de inulinasa por fermentacin, se
vislumbra como promisorio, sobre todo para
Pratima y Argyrios (1985a) inmovilizaron el esprrago por ser uno de los cultivos de
clulas Kluyveromyces marxianus con mayor produccin mundial, respecto a las
actividad de inulinasa en una matriz de materias primas comerciales actuales y de
gelatina de poro abierto tratado con alto contenido de inulina. Para propsitos de
glutaraldehdo, mantenindose una actividad escalamiento del bioproceso ser necesario
residual mayor al 90 %. El procedimiento de tener en cuenta que, la aireacin y agitacin
inmovilizacin no alter el valor del pH que son factores crticos para la fermentacin de
fue de 6.0 tanto para las clulas libres como Kluyveromyces maxianus, los que son
para las inmovilizadas. La temperatura de responsables de la viabilidad y produccin
hidrlisis de la inulina fue 10 C ms alto para enzimtica. Se ha visto que hay necesidad de
las clulas inmovilizadas. Los valores de K m investigar la actividad y estabilidad de la
fueron de 8 y 9.52 mM para las clulas libres inulinasa frente a la temperatura, modelando
e inmovilizadas respectivamente. Estas y simulando la cintica de desactivacin. Los
clulas inmovilizadas conservaron su parmetros cinticos de la inulinasa estn en
actividad hasta por 30 das cuando se le funcin al tipo de microorganismo, las
conserv a 4 C. condiciones ambientales de la fermentacin y
Tambin Pratima y Argyrios (1985b) del modo de accin de la enzima.
evaluaron la produccin por lotes y en
continuo de jarabe de fructosa a partir de Referencias
alcachofa Jerusalem con clulas
inmovilizadas de Kluyveromyces marxianus Barraco-Florido, E.; Garca- Garibay, M.; Gmez-Ruz, L.;
Azaola, A. 2001. Immobilization system of
con actividad de inulinasa, en una matriz de Kluyveromyces marxianus cells in barium alginate for
gelatina de poro abierto tratado con inulin hydrolysis. Process Biochem, 37: 513-519.
glutaraldehdo. En el reactor por lotes la Bender, J.; Mazutti, M. Treichel, H.; Di Luccio, M. 2006.
Inulinase production by Kluyveromyces marxianus

-243-
Castillo y Chamy / Scientia Agropecuaria 1(2010) 235 - 245

NRRL Y - 7571 using solid state fermentation. Appl Liu, Y.; Liu, Q.; Tay, J. 2005. Initial conditions-dependent
Biochem Biotechnol, 32:951-958. growth kinetics in microbial batch culture. Process
Cazetta, M.; Martins, P.; Monti,;R.; Contiero, J. 2005. Yacon Biochemistry, 40:155-160.
(Polymnia sanchifolia) extract as a substrate to produce Madeira, E. 2004. Kinetic analysis of Kluyveromyces
inulinase by Kluyveromyces marxianus var. Bulgaricus. marxianus yeast strain. Louisiana State University.
Journal of Food Engineering, 66: 301-305. Disponible en: htt://etd.lsu.edu/docs/available/etd-
Chen, X.; Wang, J.; Li, D. 2007. Optimization of solid-state 04152004-161117/unrestricted/Reeves_thesis.pdf.
medium for the production of inulinase by Mazutti, M.; Bender, J.; M. Treichel, H. y Di Luccio. 2006.
Kluyveromyces S120 using response surface Optimization of inulinase production by solid-state
methodology. Biochem. Eng. J. 34: 179-184. fermentation using sugarcane bagasse as substrate.
Chi, Z.; Chi, Z.; Zhang, T. ; Liu, G. 2009. Inulinase- Enzyme Microb Technol, 39:56-59.
expressing microorganisms and applications of Mazutti, M.; Zabot, G.; Boni, G.; Skovronski, A.; de
inulinases. J Appl Glycosci, 51: 247-254. Oliveira, D.; Di Luccio, M.; Rodrigues, M.; Treichel, H.;
Cruz-Guerrero, A.; Garca-Pea, I.; Barzana, E.; Garca- Maugeri, F. 2010. Kinetics of inulinase production by
Garibay, M.; Gmez-Ruz, L. 1995. Kluyveromyces solid-state fermentation in a packed-bed bioreactor. Food
marxianus CDBB-L-278: A wild inulinase Chemistry, 120: 163-173.
hyperproducing strain. J. Ferment. Bioeng, 80 : 159-163. Mughal, M.; Ali, S.; Ashiq, M.; Talish, A. 2009. Kinetics of
Cruz-Guerrero, A.; Olvera, J.; Garca-Garibay, M.; Gmez- an extracellular exo-inulinase production from a 5-
Ruz, L. 2006. Inulinase hyperproducing strains of flourocytosine resistant mutant of Geotrichum candidum
Kluyveromyces sp. Isolated from aguamiel (Agave sap) using two-factorial design. Bioresour Technol, 100:
and pulque. World J. Microbiol Biotechnol, 22 :115-117. 3657-3662.
de Paula, F.; Cazetta, M.; Monti, R.; Contiero, J. 2008. Otha, K.; Akimoto, H.; Moriyama S. 2004. Fangal
Sucrose hydrolysis by gelatin-immobilized inulinase Inclinases: Enzymology, Molecular Biology and
from Kluyveromyces marxianus var. Bulgaricus. Food Biotechnology, 51: 247-254.
Chemistry, 111: 691-695. Pandey, A.; Soccol, C.; Selvakumar, P.; Soccol, V.; Krieger,
Graefe, S.; Hermann, M.; Manrique, I.; Golombek, S.; N.; Fontana, J. 1999. Recent Developments in Microbial
Buerkert, A. 2004. Effects of post-harvest treatments on Inulinases. Appl Biochem Biotechnol, 81: 35-52.
the carbohydrate composition of yacn roots in the Pedreschi, R.; Campos, D.; Noratto, G.; Chirinos, R.;
Peruvian Andes. Field Crops Research, 86: 157-165. Cisneros-Zevallos, L. 2003. Andean Yacn Root
Greasham, R.; Inamine, E.. 1986. Nutritional Improvement (Smallanthus sonchifolius Poepp. Endl)
of Processes. En Manual of Industrial Microbiology and Fructooligosaccharides as a Potential Novel Source of
Biotechnology, (Ed. Demain & Solomon); pp 59-65. Prebiotics. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
American Society for Microbiology, Washington, D.C. 51: 5278-5284.
Hensing, M.; Vrouwenvelder, J.; Hellinga, C.; Van Dijken, Pratima, B.; Argyrios, M. 1985a. Immobilization of
J.; Pronk, J. 1995. Use of chemostat data for medelling Kluyveromyces marxianus cells containing inclinase
extracellular inulinase production by Kluyveromyces activity in open pore gelatin matriz: 1. Preparation and
marxianus in a high cell density fed batch process. enzymatic properties. Enzyme Microb Technol, 7 (8):
Journal of Fermentation and Bioengineering, 79: 54 58. 373-376.
Irving, D.; Hurst, P. 1993. Respiration, soluble carbohydrates Pratima, B.; Argyrios, M. 1985b. Immobilization of
and enzymes of carbohydrate metabolism in tips of Kluyveromyces marxianus cells containing inclinase
harvested asparagus spears. Plant Science, 94: 89-97. activity in open pore gelatin matriz: 2. Application for
Kalil, S.; Suzan, R.; Maugeri, F.; Rodrigues, M. 2001. high fructose syrup production. Enzyme Microb Technol,
Optimization of inulinase production by Kluyveromyces 7 (9): 459-461.
marxianus using factorial design. Appl Biochem Ricca, E.; Calabr, V.; Curcio, S.; Dorio, G. 2007. The State
Biotechnol, 94:257-264. of the Art in the Production of Fructose from inulin
Kango, N. 2008. Production of inulinase using tap roots of Enzymatic Hydrolysis. Crit Rev Biotechnol, 27: 129-145.
dandelion (Taraxacum officinale) by Aspergillus niger. Rocha, J.; Catana, R.; Ferreira, B.; Cabral, J.; Fernandes, P.
Journal of food Engineering, 85: 473 478. 2006. Design and characterisation of an enzyme system
Kushi, R.; Monti, R.; Contiero, J. 2000. Production, for inulin hydrolysis. Food Chemistry, 95:77-82.
purification and characterization of an extracellular Rouwenhorst, R. Hensing, M.; Verbakel, J.; Scheffers, W.;
inulinase from Kluyveromyces marxianus var. Van Dijken, J. 1988. Production, distribution, and kinetic
bulgaricus. Journal of Industrial Microbiology & properties of inulinase in continuous cultures of
Biotechnology, 25: 63-69. Kluyveromyces marxianus CBS 6556. Appl. Environ.
Laloux, O.; Cassart, J.; Delcour, J.; Van Beeumen, J.; Microbiol.54(5):1131-1137.
Vandenhaute, J. 1991. Clonig and sequencing of the Rouwenhorst, R.; Hensing, M.; Verbakel, J.; Scheffers, W.;
inulinase gene of Kluyvemomyces marxianus var. Van Dijken, J. 1990. Structure and Properties of the
Marxianus ATCC 12424. FEBS LETTERS, 289: 64 Extracellular Inulinase of Kluyveromyces marxianus
68. CBS 6556. Applied and Environmental Microbiology,
Lane, M.; Morrissey, J. 2010. Kluyveromyces marxianus: A 56: 3337-3345.
yeast emerging from its sister`s shadow. Fungal Biology Sangeetha, P.; Armes, M.; Prapulla, S. 2005. Recent trends in
Reviews, doi:10.1016/j.fbr.2010.01.001. the microbial production, analysis and application of
Leite, J.; Murr, F.; Martinelli, P. Dal, I.; Park, K. 2007. fructooligosaccharides. Trends in Food Science &
Optimization of a physical concentration process for Technology, 16: 442-457.
inulin. Journal of Food Engineering, 80: 832-838.

-244-
Castillo y Chamy / Scientia Agropecuaria 1(2010) 235 - 245

Seminario, J.; Valderrama, M.; Manrique, I. 2003. El Yacn Wei, W.; Zheng, Z.; Liu, Y.; Zhu, X. 1998. Optimizing the
fundamentos para el aprovechamiento de un recurso culture conditions for higher inulinase production by
promisorio. CIP y COSUDE, Lima Per, 60p. Kluyveromyces sp. Y-85 and scaling up fermentation. J.
Silva-Santisteban, B.; Filho F. 2005. Agitation, aeration and Ferment. Bioeng, 86 (4): 395 -399.
shear stress as key factors in inulinase production by Xiong, Ch.; Jinhua, W.; Dongsheng, L. 2007. Optimization
Kluyveromyces marxianus. Enzyme Microb Technol, of solid.state medium for the production of inulinase by
36:717-724. Kluyveromyces S120 using response surface
Singh, R.; Bhermi, H. 2008. Production of extracellular methodology. Biochemical Engineering Journal, 34: 179
exoinulinase from Kluyveromyces marxianus YS-I using 184.
root tubers of Asparagus officinalis. Bioresource Yu, X.; Guo, N.; Chi, Z.; Gong, F. 2009. Inclinase
Technology, 99: 7418 7423. overproduction by a mutant of the marine yeast Pichia
Singh, R.; Dhaliwal, R.; Puri, M. 2007a. Partial purafication guilliermondii using surface response methodology and
and characterization of exoinulinase from Kluyveromyces inulin hydrolysis. Biochem Eng J, 43: 266-271.
marxianus YS-1 for preparation of high-fructose syrup. J Zhang, T.; Gong, F.; Peng, Y.; Chi, Z. 2009. Optimization
Microbiol Biotechnol, 17(5): 733-738. for high-level expression of the Pichia guilliermondii
Singh, R.; Singh, B.; Puri, M. 2007b. Optimization of recombinant inulinase in Pichia pastoris and
medium and process paramenters for the production of characterization of the recombinant inulinase.Process
inulinase from a newly isolated Kluyveromyces Biochem, doi:10.1016/j.procbio.2009.07.008.
marxianus YS-I. Bioresource Technology, 98: 2518 Zherebtsov, N.; Abramova, I.; Shelamova, S.; Popova, T.
2525. 2003. Identification of Catalytically Active Groups in
Siomos, A.; Gerasopoulos, D.; Tsouvaltzis, P.; Koukounaras, Inulinase from Bacillus polymyxa 722.Applied
A. 2010. Effects of heat treatment on atmospheric Biochemistry and Microbiology, 39 (6): 544-548.
composition and color of peeled white asparagus in
modified atmosphere packaging. Innovative Food
Science & Emerging Technologies, 11 (1): 118-122.

-245-

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