ACTIVADORES E INHIBIDORES

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL

FACULTAD DE BIOQUÍMICA Y CIENCIAS BIOLÓGICAS
Santa Fe, Argentina
 Control de la actividad enzimática
• Producción de la enzima (a nivel de la transcripción o la traducción): la síntesis de
una enzima puede ser favorecida o desfavorecida en respuesta a determinados
estímulos recibidos por la célula.

• Compartimentación de la enzima: las enzimas pueden localizarse en diferentes

compartimentos celulares, de modo que puedan tener lugar diferentes rutas
metabólicas de forma independiente.

• Inhibidores y activadores enzimáticos: las enzimas pueden ser activadas o

inhibidas por moléculas diferentes al sustrato.

• Modificación post-traduccional de enzimas: las enzimas pueden experimentar

diversas modificaciones post-traduccionales, tales como fosforilación, oxidación,
etc.

• Activación dependiente del ambiente: algunas enzimas pueden ser activadas

cuando pasan de un ambiente a otro con condiciones diferentes, como puede ser
el paso del ambiente reductor del citoplasma al ambiente oxidativo del espacio
extracelular, el paso de un ambiente con elevado pH a otro con bajo pH, etc.
 Regulación de la actividad enzimática

• Gruesa/lenta
– Control de la cantidad/disponibilidad de enzima
• Fina/rápida
– Control de la cinética enzimática
• Regulación de los niveles de sustratos
• Activación
• Inhibición reversible por S, P o I
• Regulación alostérica
– Encendido/Apagado (switch on/off)
• Unión a proteínas regulatorias
• Modificación covalente
• Escisión proteolítica
 Enzimas regulatorias
• Las vías metabólicas están compuestas por grupos coordinados de
enzimas que realizan un determinado proceso metabólico.

• De las enzimas que los componen, sólo algunas están reguladas.

• Las enzimas regulatorias catalizan reacciones que limitan la

velocidad de todo el proceso o son un paso comprometido, es decir
que luego de sorteado dicho paso el proceso llegará hasta el final.

• Las enzimas regulatorias frecuentemente están en o cerca de las

etapas iniciales de un camino metabólico o en una ramificación. La
lógica operacional es conservar energía, de modo que las
reacciones biosintéticas no serán activas a menos que realmente se
necesite el metabolito producto de ese camino.
 Efectores heterotrópicos
• Los efectores alostéricos (inhibidores o activadores), pueden
modificar la unión de los sustratos, la catálisis o ambos.
• Si bien los mecanismos de reacción son más complejos, en
muchos casos se puede efectuar una caracterización
preliminar de estos efectores en base a las curvas de
saturación con el sustrato, en presencia de concentraciones
fijas del efector.
– Si el efecto es sobre la unión (Km) se denominan efectores tipo K
– Si el efecto es sobre la catálisis (Vmax) se denominan efectores tipo V
– Si actúan sobre ambos se llaman V/K.
• En presencia de estos efectores la forma de la curva de v vs.
[S] puede conservarse o alterarse.
Efectores heterotrópicos

Efectores tipo K: Se observa la curva en

ausencia de efectores y alternativamente en
presencia de efectores positivos o negativos
que modifican la Km.

Efectores tipo V: Se observa la curva en

ausencia de efectores y alternativamente en
presencia de efectores positivos o negativos
que modifican la Vmax.
 Activadores enzimáticos
• Ligandos que no son modificados durante la catálisis y que
incrementan la actividad de la enzima.
• Pueden ser:
– Esenciales: En su ausencia no hay actividad catalítica. Cinéticamente
son tratados como sustratos. Generalmente son iones, tales como
Mg2+ o Mn2+.
– No-esenciales. En su ausencia la enzima es activa. Pueden ser de tipo
V, K o V/K. Cinéticamente se analizan considerando el incremento de
velocidad a distintas concentraciones del activador. Suelen ser
componentes metabólicos que regulan la actividad de enzimas clave
para determinadas rutas metabólicas.
• Se determina Ka o A0,5 (en forma análoga al estudio de los sustratos,
donde se determina Km o S0,5).
• También se determinan las veces de activación, evaluando el valor
de Vmax en presencia y ausencia del activador. Cuando es esencial se
puede obtener considerando variación de v en función de [A].
Cuando es no esencial hay que utilizar ∆v.
 Inhibidores enzimáticos
• Moléculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad.
• Se clasifican en:
– Irreversibles: Cuando se unen covalentemente (o no covalentemente
pero muy fuertemente) a la proteína (en este caso se habla de
inactivación). Son útiles para modificación química, identificación de
dominios estructurales y desarrollar fármacos.
– Reversibles: Cuando se unen no covalentemente de tal forma que
pueden separarse (disociarse) de la proteína (por ejemplo, por diálisis
o dilución). Son útiles para estudiar mecanismos, regulación y
desarrollar fármacos.
• Inhibidores reversibles:
– Competitivos
– No-competitivos
– Acompetitivos
– Mixtos
• Se determina Ki o I0,5 (en forma análoga al estudio de los sustratos,
donde se determina Km o S0,5).
 Amax 14
12

Activity (U/mg)
10
8
½ Amax v
6
4

v0 2
0
0 2 4 6 8 10

A0,5 3-PGA (mM)

0.8
v0
Activity (U/mg)

0.7
0.6
0.5
½ Imax
0.4
0.3
0.2
Imax 0.1
0 5 10 15 20
I0,5 Pi (mM)
 Inhibición competitiva

• El inhibidor (I) tiene afinidad por el sitio activo de

una enzima, en el que también se une el sustrato
(S).
• El sustrato y el inhibidor compiten por el sitio
activo de la enzima.
• Los inhibidores competitivos suelen ser similares
en estructura al sustrato verdadero.
• Aumentan la Km sin modificar la Vmax.
• Ejemplos: análogos no metabolizables o
derivados del sustrato verdadero, sustratos
alternativos o productos de la reacción.
 KS

Ki

Ki = [E] [I] / [EI]

Ks = [E] [S] / [ES]
k2 = kcat = constante cinética para la ruptura de ES en E + P
 Inhibición competitiva
• La velocidad inicial de reacción es proporcional a la [ES] en el estado
estacionario.
• Todas las especies enzimáticas están conectadas reversiblemente.
• A una dada [I] no saturante:
– La vi (velocidad inicial en presencia del inhibidor) se puede hacer igual
a la v0 (velocidad inicial en ausencia del inhibidor), pero se necesita
mayor [S] para obtener la misma [ES].
– En presencia de [S] saturante, toda la enzima se puede desplazar a la
forma ES.
• Por lo tanto, la Vmax en presencia del inhibidor es igual a la Vmax en
su ausencia.
• Sin embargo, la Km aparente (Km app), medida como la [S] necesaria
para ½ Vmax, aumenta en presencia de un inhibidor competitivo
porque una parte de la enzima existe en la forma EI, la cual no tiene
afinidad por S.
Deducción de la ecuación de velocidad para
inhibición competitiva

𝑣 = 𝑘2 [ES]

𝑣 𝑘2 [ES]
=
E𝑡 E + ES + [EI]

[S]
E 𝑡 𝑘2 𝐾
S
𝑣=
[S] [I] En condiciones de estado
1+𝐾 +𝐾
S i estacionario Km reemplaza a KS

𝑉max [S] 𝑉max [S]

𝑣= 𝑣=
I I
𝐾S 1 + 𝐾 + [S] 𝐾m 1 + 𝐾 + [S]
i i
 Inhibición competitiva

• El término Km está multiplicado por el factor (1+[I]/Ki).

• Esto confirma la presunción original de que la Vmax no
se encuentra afectada.
• La Km app se encuentra aumentada.
• Esto no significa que el complejo EI tenga menor
afinidad por el sustrato, sino que el mismo no puede
unir sustrato.
• La afinidad de E por S (Km) no se encuentra alterada.

[I] 𝐾m
𝐾m app = 𝐾m 1 + = I + 𝐾m
𝐾i 𝐾i
Dobles recíprocos para inhibición competitiva

1 𝐾m [I] 1 1
= 1+ +
𝑣 𝑉max 𝐾i [S] 𝑉max
Representaciones secundarias (I competitivo)

𝐾m app 𝐾m [I] 𝐾m 𝐾m
𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = = 1+ = I +
𝑉max 𝑉max 𝐾i 𝑉max 𝐾i 𝑉max

[I] 𝐾m
𝐾m app = 𝐾m 1 + = I + 𝐾m
𝐾i 𝐾i

𝐾m app
Km app
𝑉max
pte=Km/Ki
pte=Km/KiVmax

Km/Vmax
Km
-Ki -Ki
[I] [I]
 Inhibición no competitiva
• Los inhibidores no competitivos se unen a la enzima
en un lugar diferente del sitio de unión del sustrato.
Es decir, I se une a E y ES, mientras que S se une a E y
EI.
• El I no competitivo no tiene efecto sobre la unión de
S y viceversa. Es decir, la unión de I no afecta KS y la
unión de S no afecta Ki.
• Los complejos EI y ESI son catalíticamente inactivos.
• Se asume que la unión de I distorsiona el sitio activo,
lo que impide la formación de producto.
• Esta forma de inhibición causa una disminución de
Vmax sin afectar Km.
 KS

Ki Ki
Ki = [E] [I] / [EI] = [ES] [I] / [ESI]
Ks = [E] [S] / [ES] = [EI] [S] / [ESI]
k2 = kcat = constante cinética para la
ruptura de ES en E + P
KS
 Inhibición no competitiva
• Del equilibrio podemos observar que el aumento de [S]
no puede llevar toda la E a la forma productiva ES.
• A una dada [I] una determinada porción de E se
encuentra formando el complejo ESI.
• Por lo tanto, podemos predecir que la Vmax en
presencia de I (Vmax app) será menor que en ausencia del
mismo.
• La Km ([S] necesaria para lograr ½ Vmax) no varía,
porque la afinidad de E y EI por S es la misma.
• El efecto global de un inhibidor no competitivo se
asemeja a tener menos E (no confundir con inhibición
irreversible o inactivación).
Deducción de la ecuación de velocidad para
inhibición no competitiva

𝑣 = 𝑘2 [ES] Al dividir ambos términos por (1+[I]/Ki)

𝑣 𝑘2 [ES] 𝑉max
[S]
= I
E𝑡 E + ES + EI + [ESI] 1+𝐾
i
𝑣=
𝐾S + S
[S]
E 𝑡 𝑘2 𝐾
S En condiciones de estado
𝑣=
[S] [I] I [S] estacionario Km reemplaza a KS
1+𝐾 +𝐾 + 𝐾 𝐾
S i S i

𝑉max
[S]
𝑉max [S] I
𝑣= 1+ 𝐾 𝑉max app [S]
I [I] 𝑣= i
=
𝐾S 1+ 𝐾 + S 1+𝐾 𝐾m + S 𝐾m + S
i i
 Inhibición no competitiva

• El término Vmax está dividido por el factor

(1+[I]/Ki).
• Esto confirma la presunción original de que la Km
no se encuentra afectada.
• La Vmax app se encuentra disminuída.
• Esto no significa que el complejo ES tenga una
menor constante catalítica, sino que el nivel del
mismo en el estado estacionario es menor.
• La k2 (kcat) no se encuentra alterada.
𝑉max
𝑉max app =
I
1+
𝐾i
Dobles recíprocos para inhibición no competitiva

1 𝐾m [I] 1 1 [I]
= 1+ + 1+
𝑣 𝑉max 𝐾i [S] 𝑉max 𝐾i
Representaciones secundarias (I no competitivo)

𝐾m 𝐾m [I] 𝐾m 𝐾m
𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = = 1+ = I +
𝑉max app 𝑉max 𝐾i 𝑉max 𝐾i 𝑉max

𝑉max 1 1 1
𝑉max app = ∴ = I +
I 𝑉max app 𝑉max 𝐾i 𝑉max
1+𝐾
i

𝐾m 1
𝑉max app 𝑉max app
pte=1/VmaxKi
pte=Km/KiVmax

Km/Vmax
1/Vmax
-Ki -Ki
[I] [I]
 Inhibición acompetitiva
• La inhibición acompetitiva se produce cuando
el I se une sólo al complejo ES, no a la E.
• La unión de S a la E genera un cambio
conformacional que forma o expone el sitio de
unión de I.
• El complejo ESI es catalíticamente inactivo.
• Esta forma de inhibición es rara y causa una
disminución tanto en el valor de Vmax como en
el de Km.
 KS

Ki

Ki = [E] [I] / [EI]

Ks = [E] [S] / [ES]
k2 = kcat = constante cinética para la ruptura de ES en E + P
 Inhibición acompetitiva

• Del equilibrio podemos observar que el aumento de [S]

no puede llevar toda la E a la forma productiva ES.
• A una dada [I] una determinada porción de E se
encuentra formando el complejo ESI.
• Por lo tanto, podemos predecir que la Vmax en
presencia de I (Vmax app) será menor que en ausencia del
mismo.
• El valor de Km también decrece. Esto ocurre porque la
formación del complejo ESI remueve ES, desplazando
la reacción E + S hacia la derecha.
Deducción de la ecuación de velocidad para
inhibición acompetitiva

𝑣 = 𝑘2 [ES] Al dividir ambos términos por (1+[I]/Ki)

𝑉max
[S]
𝑣 𝑘2 [ES] I
= 1+ 𝐾
i
E𝑡 E + ES + [ESI] 𝑣=
𝐾S
+ S
I
1+ 𝐾
i
[S]
E 𝑡 𝑘2 𝐾
S
𝑣= En condiciones de estado
[S] I [S] estacionario Km reemplaza a KS
1+ 𝐾 + 𝐾 𝐾
S S i
𝑉max
[S]
I
𝑉max [S] 1+𝐾 𝑉max app [S]
𝑣= i
[I] 𝑣= =
𝐾m 𝐾m app + S
𝐾S + S 1+𝐾 + S
i I
1+𝐾
i
 Inhibición acompetitiva
• Los términos Vmax y Km están divididos por el factor
(1+[I]/Ki).
• Esto confirma la presunción original de que la Vmax se
encuentra disminuída, pero también lo hace la Km.
• A mayor [S], mayor inhibición. Esto se debe a que el I se
une sólo al complejo ES, cuyo nivel aumenta al aumentar la
[S].
• El I acompetitivo inhibe por su efecto sobre la Vmax (Vmax app
< Vmax). Pero si se tiene en cuenta su efecto sobre la Km
puede ser considerado un activador tipo K (Km app < Km).

𝑉max 𝐾m
𝑉max app = 𝐾m app =
I I
1+ 1+
𝐾i 𝐾i
Dobles recíprocos para inhibición acompetitiva

1 𝐾m 1 1 [I]
= + 1+
𝑣 𝑉max [S] 𝑉max 𝐾i
Representaciones secundarias (I acompetitivo)
𝑉max 1 1 1
𝑉max app = ∴ = I +
I 𝑉max app 𝑉max 𝐾i 𝑉max
1+𝐾
i

𝐾m 1 1 1
𝐾m app = ∴ = I +
I 𝐾m app 𝐾m 𝐾i 𝐾m
1+𝐾
i

1 1
𝑉max app 𝐾m app
pte=1/KiKm
pte=1/KiVmax

1/Vmax
1/Km
-Ki -Ki
[I] [I]
 Inhibición mixta
• Como su nombre lo indica, un inhibidor mixto afecta tanto
la Vmax como la Km.
• Se llama inhibición mixta porque es una mezcla conceptual
entre inhibiciones competitiva (I se une sólo a E) y
acompetitiva (I sólo se une a ES).
• Existen varios ejemplos. En el caso más sencillo, el
complejo EI tiene menos afinidad que E por S, y el complejo
ESI es no productivo.
• En este caso la Km app > Km y la Vmax app < Vmax.
• Si la afinidad de I por ambas formas (E y EI) es idéntica
(=1), se conoce como inhibición no competitiva. Es decir,
la inhibición no competitiva es un tipo especial de
inhibición mixta.
 KS

Ki k-5 k5 Ki

k5
k-5
KS

Ki = [E] [I] / [EI] = [ES] [I] / [ESI]

Ks = [E] [S] / [ES] = [EI] [S] / [ESI]
k2 = kcat = constante cinética para la
ruptura de ES en E + P
>1
 Inhibición mixta
• Del equilibrio podemos observar que el aumento de [S] no
puede llevar toda la E a la forma productiva ES.
• A una dada [I] una determinada porción de E se encuentra
formando el complejo ESI.
• Por lo tanto, podemos predecir que la Vmax en presencia de
I (Vmax app) será menor que en ausencia del mismo.
• Además, una porción de E se encontrará formando el
complejo EI, que puede unir S (con menor afinidad que E).
Por lo tanto, la Km app > Km.
• A [I] saturante, toda la E se puede llevar a las formas EI o
ESI, como ESI es no productivo, la v puede llegar a cero.
 Deducción de la ecuación de velocidad para
inhibición mixta
𝑉max
𝑣 = 𝑘2 [ES] [S]
I
1 + α𝐾
i
𝑣=
𝑣 𝑘2 [ES] I
= 1+𝐾
E𝑡 E + ES + EI + [ESI] 𝐾S i
+ S
I
1 + α𝐾
i
[S]
E 𝑡 𝑘2 𝐾
S
𝑣= En condiciones de estado
[S] [I] I [S] estacionario Km reemplaza a KS
1 + 𝐾 + 𝐾 + α𝐾 𝐾
S i S i

𝑉max
𝑉max [S] [S]
I
𝑣= 1 + α𝐾 𝑉max app [S]
I [I] 𝑣= i
=
𝐾S 1 + 𝐾 + S 1 + α𝐾 I
i i 𝐾m app + S
1+𝐾
i
𝐾m + S
I
Al dividir ambos términos por (1+[I]/Ki) 1 + α𝐾
i
 Inhibición mixta

• El término Vmax está dividido por el factor

(1+[I]/Ki). Esto confirma la presunción original
de que la Vmax app < Vmax.
• El término Km está multiplicado por
(1+[I]/Ki)/(1+[I]/Ki). Si >1, entonces Km app > Km.

I
𝑉max 1+
𝐾i
𝑉max app = 𝐾m app = 𝐾m
I I
1+ 1+
α𝐾i α𝐾i
Dobles recíprocos para inhibición mixta

1 𝐾m [I] 1 1 [I]
= 1+ + 1+
𝑣 𝑉max 𝐾i [S] 𝑉max α𝐾i

1/v
[I] > 0

1/Vmax app
[I] = 0

1/Vmax

-1/Km 1/[S]
-1/Km app
 Representaciones secundarias (I mixto)

𝐾m app 𝐾m [I] 𝐾m 𝐾m
𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = = 1+ = I +
𝑉max app 𝑉max 𝐾i 𝑉max 𝐾i 𝑉max

𝑉max 1 1 1
𝑉max app = ∴ = I +
I 𝑉max app 𝑉max α𝐾i 𝑉max
1 + α𝐾
i

𝐾m app 1
𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 =
𝑉max app 𝑉max app

Km/Vmax
1/Vmax
-Ki
[I] -Ki [I]
 Inhibidores irreversibles
• Son moléculas que usualmente modifican la E de forma
covalente, por lo cual la inhibición no se puede revertir (por
dilución o diálisis).
• La inhibición irreversible específica es diferente de la
inactivación inespecífica.
– Específica: los inhibidores actúan sobre ciertas proteínas y
generalmente lo hacen modificando el sitio activo del blanco.
– Inespecífica: los valores extremos de temperatura y pH
desnaturalizan la estructura de la proteína.
• Los inhibidores muestran inhibición dependiente de tiempo
y, por lo tanto, su potencia no se puede analizar por I0,5.
• La cantidad de enzima activa remanente a una dada [I]
dependerá del tiempo de incubación E+I.
 Estudio de inhibidores irreversibles

• Se incuba la E con diferentes [I], se toman alícuotas a

diferentes tiempos y se mide la actividad enzimática
remanente.
• Se grafica v/v0 vs. t (exponencial decayente) y del
ajuste a v/v0 = e (-kobs*t) se obtiene la kobs, una constante
de pseudo-primer orden que da una idea de la
velocidad de inactivación a una determinada [I].
• Luego se grafica kobs vs. [I]. De esta forma se pueden
obtener dos tipos de gráfico:
– Lineal: inactivación en un paso
– Hiperbólico: inactivación en dos pasos
Reaction of the irreversible inhibitor
diisopropylfluorophosphate (DFP)
with a serine protease
 Modelo de Kitz y Wilson (I irreversibles)

Ki kinac 𝑘inac [I] 𝑘inac

𝑘obs = ′′
E + I  EI  E-I 𝑘 =
𝐾i + [I] 𝐾i

kinac = máxima velocidad de inactivación que se alcanza a una [I]

saturante ([I] >> [E])
Tiene unidades de t-1 (s-1)

Ki = [I] que produce ½ kinac

Tiene unidades de concentración (M)

k” = constante de segundo orden, considerada la mejor medida

de la “potencia del inhibidor”
Tiene unidades de concentración-1 t-1 (M-1 s-1)
Inhibición en un paso Inhibición en dos pasos

kinac Ki kinac
E + I  E-I E + I  EI  E-I
𝑘inac 𝑘inac [I]
𝑘obs = [I] 𝑘obs =
𝐾i 𝐾i + [I]
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL
FACULTAD DE BIOQUÍMICA Y CIENCIAS BIOLÓGICAS
www.fbcb.unl.edu.ar