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Tema 15

INHIBICIN ENZIMTICA I

1. Introduccin
2. Inhibicin reversible
2.1 Inhibicin competitiva (inhibicin
especfica)
2.2 Inhibicin no-competitiva
2.3 Inhibicin incompetitiva o acompetitiva
2.4. Representacin de Dixon
2.5 Inhibicin por sustrato

1. Introduccin
Desde el principio de la Enzimologa se sabia de sustancias que
disminuan la velocidad de la reaccin catalizada por los
catalizadores, envenenando o dificultando la actuacin de
stos.
Las sustancias que disminuyen la velocidad de reaccin, qumica
o enzimtica, se denominan inhibidores.
Los inhibidores se pueden dividir en tres grandes grupos:
- Inhibidores reversibles,
- Inhibidores pseudorreversibles
- Inhibidores irreversibles

INHIBIDORES REVERSIBLES la unin del


inhibidor a la enzima es dbil.
INHIBIDORES PSEUDOIRREVERSIBLES la unin
del inhibidor a la enzima es fuerte.
INHIBIDORES IRREVERSIBLES la unin del
inhibidor a la enzima es prcticamente irreversible,
generalmente covalente (inhibidores suicidas).

2. INHIBICIN REVERSIBLE
Los inhibidores reversibles son sustancias que forman
complejos dinmicos o reversibles con la enzima (
interacciones de tipo dbil) y que presentan propiedades
catalticas diferentes a las de la enzima libre.
Cumplen las condiciones impuestas al Substrato para la
deduccin de la ecuacin cintica de M&M:
La concentracin inicial de inhibidor [Io]

>> [Eo]

que para resolver la ecuacin de velocidad en presencia de


inhibidor,

[EI] o [ESI] es despreciable frente a la de [I o].


Por lo tanto, en todo momento,

[I] = [Io]

Por otra parte, la formacin de los complejos EI o ESI es muy


rpida, de forma que se alcanza rpidamente el siguiente
equilibrio:

E + I <=====> EI
y podemos definir la constante de disociacin del complejo
EI:

[E] [I]

Ki =
------------

Donde.
[E] concentracin de enzima libre
[I] concentracin de inhibidor libre
[EI] concentracin del complejo EI
-As mismo, debemos tener en cuenta:

i) que la actividad de la enzima se afecta por la


presencia del inhibidor
ii) que las velocidades medidas son velocidades
iniciales
iii) que estamos en una situacin de estado
estacionario
Consecuentemente, la concentracin de las diferentes
especies qumicas en que puede encontrarse la enzima: [E],
[ES], [EI] y en su caso [ESI] son constantes respecto del
tiempo, d[EX]/dt = 0.

Si la enzima, a concentraciones saturante de inhibidor, no


presenta actividad cataltica alguna (v = 0) se dice que la
inhibicin es completa o total.
Sin embargo, frecuentemente nos referimos a este tipo de
inhibicin como inhibicin lineal, ya que la representacin de
Kmap/Vmaxap o de 1/Vmaxap frente a [I] nos da una linea recta.
Con menor frecuencia est el caso en que el complejo EI s
presenta cierta actividad cataltica residual (v 0) a
concentraciones saturantes de inhibidor.
Este tipo de inhibicin se conoce como inhibicin parcial, o
inhibicin hiperblica, ya que la curva resultante al representar
Kmap/Vmaxap o 1/Vmaxap frente a la [I], nos da una curva
hiperblica.

* Ambos tipos de inhibicin, lineal e hiperblica, pueden a su vez


subclasificarse de acuerdo con los parmetros cinticos
aparentes de Michaelis-Menten que se vean afectados, si bien, en
lo que sigue, nos referiremos principalmente a la inhibicin lineal.
* La inhibicin por inhibidores reversibles lineales,
tradicionalmente, y de acuerdo con el mecanismo de reaccin,
se suele clasificar en tres grupos:

- Inhibicin competitiva --> Inhibidores competitivos


- Inhibicin no-competitiva --> Inhibidores no-competitivos
- Inhibicin acompetitiva --> Inhibidores acompetitivos

2.1. Inhibicin competitiva


En la inhibicin competitiva o inhibicin especfica, el
inhibidor compite con el sustrato por el mismo centro activo
de la enzima.
La molcula del inhibidor es, generalmente, en todo o en parte,
un isstero del sustrato, excluyendose mutuamente del centro
activo de la enzima.

Isstero --> Molculas que tienen formas y tamaos similares

Km

kcat

<=====>

E + S <====> ES
----------> E + P
Kic
I
EI -------->
- As pues, la enzima total, Eo, puede estar como enzima libre, E,
unida al sustrato formando el complejo-ES, ES o como enzima
unida al inhibidor formando el complejo-EI, (EI).
Pero solamente el complejo ES puede dar producto.
- Y de acuerdo con la ecuacin de conservacin de masas
podemos escribir:

[Eo] = [E] + [ES] + [EI]


Vic = kcat [ES]
Velocidad inicial en presencia de inhibidor competitivo

El valor de la [ES] lo podemos obtener a partir de la cte de


Michaelis:
[E] [S]
Km =
-----------[ES]

[E] [S]
[ES] =
----------Km

Y anlogamente, el valor de la [EI] lo podemos obtener a partir de


la definicin de la constante de disociacin del complejo EI:

Kic

[E] [I]
[E] [I]
Kic =
[EI] =
----------------------Kic
[EI]
Sustituyendo estos valores en la ec. de balance de masas,
tenemos:

Eo = E + ES + EI
[E] [S]
[E] [I]
[Eo] = [E] + ------------ + -----------Km
Kic

E Eo

Valor de la Enzima libre

[E] [S]
[ES] =
----------Km

Vic=Kcat [ES]
vic kcatEo

1
1

I
S

Ki Km

S
ES Eo
I
S Km
1

Ki Km

S
S
V max
I
S Km
IKm
1

Km
S
Ki Km
Ki

vic V max

I
Km 1 S
Ki

Ecuacin representa el comportamiento cintico de un inhibidor


competitivo puro

As pues, la velocidad de reaccin inicial, en presencia de


inhibidor competitivo vendr dada por la ecuacin:

[S]
vic = Vmax
----------------[S]
Km
- Ecuacin semejante
a la+ec.
de ap
M&M, pero donde el valor de
Kmap depende de la concentracin del inhibidor (I) y de la cte de
inhibicin Kic.

I
Kmap Km 1

Kic

* En este tipo de inhibicin reversible, los valores de las ctes de


inhibicin, Kic, suelen ser del mismo orden que las Km. Oscilando
entre 10-3 y 10-6 M.

- Algunos inhibidores de este tipo suelen tener aplicaciones


medico-farmacuticas.
Cules sern los mejores?
aquellos que tengan un valor de Ki pequeo
* En estos casos, adems de interesante, es necesario
determinar el valor IC50 o concentracin de inhibidor que en unas
condiciones dadas produce una inhibicin del 50%.
Clculo del grado de inhibicin,

i:

Vic
a
V
ic 1 a

S
I Kic 1

Km

Tarea
Calclalo

Grado de inhibicin es un valor entre 0-1


Razn entre la velocidad en presencia de I y en ausencia.
a

- El anlisis de la ec. anterior nos indica que el valor del grado


de inhibicin, i, depende:
i) de la concentracin de inhibidor, [I];
ii) del valor de la Kic;
iii) de la concentracin de sustrato, [S]
iv) de la constante de Michaelis, Km
- A concentraciones altas de sustrato, [S], el valor de inhibicin
puede ser no significativo.
- Cuando i = 0,5, es decir cuando hay una inhibicin del 50% , el
valor de IC50 viene dado por la ec. que hemos indicado
anteriormente.

As pues, el valor IC50 para una inhibicin competitiva no puede


considerarse como un valor caracterstico del inhibidor, ya que
depende de la concentracin actual de sustrato, [S] y de la Km
de la enzima para dicho sustrato.
Pero realmente lo que es til es calcular la concentracin de
inhibidor, [I], que causa un determinado grado de inhibicin.

Calculemos la concentracin de un inhibidor competitivo que

causa una inhibicin del 60% de la enzima E; sabiendo que la [S]


= 2 10-3 M, Km = 10-3 M y que la Kic = 5 10-3 M

Determinacin grfica de los parmetros cinticos


en una inhibicin competitiva
Podemos utilizar las mismas linealizaciones que para la ecuacin
de Michaelis-Menten; por ejemplo:
* 1/vic vs 1/[S] --> Representacin de Linenweaver-Burk
* vic vs vic/[S] --> Representacin de Eadie-Hoftee
* [S]/vic vs [S] --> Representacin de Hanes
* vic vs [S] --> Representacin directa o de EisenthalCornish

1/v

[I] > 0

[I] = 0

Representacin de
Linenweaver-Burk
- 1/Km
1/Vmax

-1/Kmap

1/[S]

Representacin de EadieHoftee

Vmax

m = tg = -Kmap

m = tg = -Km

Vmax/Km

[I] > 0
v/[S]
Vmax/Kmap

[S]/v

Representacin
de Hanes

[I] > 0

I=0

m = tg = 1/Vmax

- Km

Kmap/Vmax
Km/Vmax

-Kmap

[S]

Representacin directa o de Eisenthal-Cornish


Vmax

v0
I=0

[I] > 0

-S1

-S2

Km

Kmap S0

2.2. Inhibicin no-competitiva


En una inhibicin no-competitiva el inhibidor se une a la enzima
en un centro de unin diferente al centro activo de la enzima.

Consecuentemente, las especies qumicas en las que puede


encontrarse la enzima sern:
- la enzima libre, E,
- la enzima unida al sustrato, ES (complejo-ES)
- la enzima unida al inhibidor, EI (complejo-EI)
- la enzima unida al sustrato y al inhibidor, ESI o EIS
(complejo- ESI o EIS)
En el caso de la inhibicin no-competitiva pura suponemos que
tanto la enzima libre, E, como el complejo-ES pueden unirse al
inhibidor, y que la constante de disociacin, Ki, es igual en ambos
casos.
E y EI unen al sustrato sin que afecten a las constantes
de disociacin (Km)
- En este caso, tambin, slo el complejo-ES evoluciona dando
producto

Los inhibidores no-competitivos,


generalmente no presentan
relacin estructural con el sustrato,
y se unen a la enzima en un sitio
distinto del centro activo.

Cuando [S]

no desaparece la inhibicin.

Km

kcat

Km

<=====>

<=====>

E + S <====> ES
----------> E + P
I Ki
I Ki
EI <=====> ESI ---------->
* La deduccin de la velocidad de reaccin, en este caso, es
anloga a la realizada en el caso de la inhibicin competitiva:

vinc = kcat (ES)


[Eo] = [E] + [ES] + [EI]+ [ESI]

[S]
vinc = Vmaxap
-------------------[S] + Km
- As pues, en una inhibicin no-competitiva pura, la Km de la
enzima por el sustrato no se modifica, sin embargo, la Vmax s se
modifica, transformndose en una Vmaxap.

V max ap

V max
I
1
Ki

* Determinacin grfica de los parmetros cinticos en una


inhibicin no-competitiva
- Podemos utilizar las mismas linealizaciones que para la
ecuacin de Michaelis-Menten, por ejemplo:
*1/vinc vs 1/[S] --> Representacion de Linenweaver-Burk
vinc vs vinc/[S] --> Representacin de Eadie-Hoffte
vinc vs [S] --> Representacin directa o de EisenthalCornish

Representacin de Linenweaver-Burk
1/vinc

(I) > 0

(I) = 0
1/Vmaxap

1/Vmax
- (1/Km)

1/S

Representacin de Eadie-Hoffte
Vmax/Km
vinc/S

m = -(1/Km)
I=0
Vmaxap
I>0

Vmaxap/Km

Vmax

vinc

Representacin directa o de Eisenthal-Cornish


v0

Vmax
(I) = 0
Vmaxap

(I) > 0

-S1

-S2

Km

S0

Clculo del grado de inhibicin,

i:

[I]
i = ------------------[I] + Ki

Valor de la IC50 caracterstica propia del


inhibidor
No depende de la [S] ni de la Km

Valor IC50 es igual a la Ki

2.3. Inhibicin acompetitiva


* El tercer tipo de inhibicin reversible es la inhibicin
acompetitiva, en la que el inhibidor slo puede unirse al
complejo-ES, formando un complejo-ESI, que no da producto.
* En este caso como en los dos anteriores, nicamente el complejo-ES da producto de
reaccin.

- De acuerdo con el siguiente esquema:


Km

kcat

<=====>

E + S <====> ES

----------> E + P
I

Ki

ESI ---------->
* Al igual que los otros dos casos, en este la velocidad de
reaccin viene dada por:

viac = kcat (ES)

[Eo] = [E] + [ES] + [ESI]


Y por tanto su deduccin se realizar de manera anloga.

* As pues, en una inhibicin acompetitiva se modifica tanto Vmax como Km, y ambas se ven
afectadas por el mismo factor multiplicativo

viac

Donde:

Vmax
S
Km
I
S

1
K iac 1 I

K
iac

[S]
viac = Vmaxap
---------------Kmap + [S]

Vmap

Vmax
I
1
K iac

K map

Km
I

1
K iac

Del anlisis de la anterior figura as como de la ecuacin que nos da v iac


podemos observar que tanto la Vmax como la Km estn disminuidas por un
mismo factor:

I
1
Ki
No les parece paradjico que un inhibidor disminuya la Km de
una enzima por el sustrato?
Es decir, que aumente la afinidad de la enzima por el sustrato!
- La respuesta la podramos tener en el mecanismo de
inhibicin
* Al unirse el inhibidor al complejo-ES desplaza el equilibrio y,
aparentemente, por lo tanto, la constante de disociacin Km ap
disminuye.

Determinacin grfica de los parmetros cinticos en una inhibicin


acompetitiva

Representacion de Linenweaver-Burk
(I) > 0

1/viac

1/Vmaxap

(I) = 0

Tarea. Realiza
representaciones
grficas con las
otras
representaciones

1/Vmax
- (1/Kmap)

- (1/Km)

1/S

2.4. Representacin de Dixon-Webb


Dixon y Webb propusieron una representacin grfica alternativa de la
ecuacin de inhibicin competitiva y no-competitiva
Representando

1/vi frente a [I], manteniendo constante la (S).


1/vi

S1
S2 > S1
S2

-Ki

(I)

En el caso de una inhibicin competitiva, para dos


concentraciones de sustrato fijas, (S1) y (S2), tendremos:
S1

Km 1
Km
----- = --------- + ---------- ------ +
---------------------- [I]
vic1 Vmax
Vmax [S1]
S Vmax Ki [S1]
2

Km 1
Km
----- = ---------- + --------- ------ +
---------------------- [I]
vic2 Vmax
Vmax
[S2]
Vmax Ki [S2]

- Estas dos rectas se cortarn en el nico punto comn que


tienen, el correspondiente a 1/Vmax.
La condicin de corte de estas dos rectas es que 1/vic1 = 1/vic2

- As pues, igualando ambas ecuaciones, simplificando y


reordenando, llegamos a la siguiente ecuacin:

1
I
1
I
1
1
S1
Ki S2
Ki

- Por definicin

1
1

S1 S 2

Luego, la solucin a la anterior ecuacin ser:

- De donde:

I Ki

I
1
0
Ki

* La representacin grfica de estas dos rectas:


1/vic

S1
S2 > S1
S2

1/Vmax
-Ki

(I)

* En el caso de una inhibicin no-competitiva:


S1

S2

-------- ------ (1+[I]/Ki)


Vmax (S1)
1
1

Km
1
----- = --------- (1+[I]/K i) +
vinc1
Vmax

Km
1
----- = --------- (1+
[I]/Ki) + -------- ------ (1+[I]/Ki)
v inc2
Vmax
Vmax (S2)

- Estas dos rectas se cortarn cuando 1/vinc1 = 1/vinc2.

* Operando de manera anloga al caso de la inhibicin


competitiva, obtenemos:

1
1

S1 S 2
- Como por definicin:

1
I
1
I
1
1
S1
Ki S2
Ki

=> 1

+ (I)/Ki = 0

Luego:

(I) = -Ki

-Sustituyendo este valor en la ecuacin que define 1/vinc,


obtenemos:
1/v = 1/v = 0
inc1

inc2

- Luego las rectas se cortan en un punto, sobre el eje (I), tal que
(I) = -Ki
1/vinc1

S1
S2 > S1
S2

-Ki

[I]

2.5. Inhibicin por exceso de sustrato


* Este es otro tipo de inhibicin reversible en el que un exceso de sustrato provoca una
prdida de actividad de la enzima.
* En este caso, el modelo cintico presupone que una segunda molcula de substrato
puede unirse al complejo-ES dando lugar a la formacin del complejo-ES2 que no da
producto:

Km

kcat

<=====>

E + S <====> ES

----------> E + P
S

Ks

Suponemos que la constante de


disociacin del segundo complejo
[ES2] es diferente a la Km
Se denomina Ks

ES2 ---------->

- La ecuacin de velocidad, como siempre, la podemos deducir a


partir de:

v = kcat (ES)

E S
ES
E S
Ks`
ES 2

Ecuacin de conservacin de la enzima

Km

Eo = E + ES + ES2
2

S
ES
Eo E E

Km KmKs`
v = kcat [ES]
v kcatEo

S
Km

S
S2
1

Km KmKs
1
S
v V max
S
S 2 Km
1

Km KmKs

E Eo

1
S
S2
1

Km KmKs

[E] [S]
[ES] =
----------Km

La representacin de v frente a (S) muestra una curva que presenta un mximo:

La concentracin de sustrato
a la cual se obtiene el
mximo el ptimo de
velocidad

Igualando a cero la
primera derivada
con respecto a la [S]

Vmax

S op KmKs
(S)op

(S)

- La representacin de 1/v frente a 1/S es una hiprbola


cuadrtica, que tiene un mnimo correspondiente al inverso de
(S)op.
1/v

1/Vmax
-1/Km

1/[S]op

1/[S]

Succinato produce inhibicin por substrato de la succinato


deshidrogenasa.
Comenta cual podra ser el mecanismo de inhibicin
Un mecanismo de inhibicin podra:
Una molcula de sustrato se une a la enzima, despus una
segunda molcula del S se une formando un complejo inactivo.
qu tipo de inhibicin de los que hemos estudiado se ajusta a
la inhibicin por sustrato?

-OOC
I
CH2
I
CH2
I
-OOC

-OOC
I
CH
II
CH
I
-OOC

Sustituyendo [I] por [S]


viac

Vmax
I

1
K iac

viac

Km
S

K iac

Vmax

S
1

K iac

viac

A bajos valores de [S]

Vmax S

Km S 1
K iac

M-M

S/Kiac tiende a cero

A altos valores de [S]

viac

Km
S

K iac

Km se desprecia

Vmax
S
1
K iac

Vmax

(S)

RESUMEN
Inhibidores aquellos compuestos disminuyen la actividad de una enzima. Se agrupan en
tres clases: Reversibles, Pseudoirreversibles y suicidas.
Inhibidores reversibles cumplen las condiciones de Michaelis, la [I o] es muy superior a la
[Eo] siendo el complejo enzima-inhibidor [EI] despreciable frente a [I]
Tres tipos de inhibicin reversible:
a)Inhibicin competitiva el inhibidor compite por el mismo lugar que el substrato. La
velocidad mxima queda inafectada por el inhibidor que aumenta la Kmap al
multiplicarse la Km de la enzima por el factor (1+ I/Ki). El grado de inhibicin depende
de las concentraciones de I y S, as como de la Km y Ki.
b)Inhibicin no competitva el inhibidor se une a la enzima en un lugar diferente al de
la unin al substrato. La inhibicin afecta a la velocidad mxima disminuyendo su .
valor al ser dividida por (1+ I/Ki). El grado de inhibicin depende solamente de la [I] y
de la constante Ki.
c)Inhibicin acompetitiva el inhibidor se une solamente al complejo EnzimaSubstrato, disminuye la velocidad mxima por el factor (1+ I/Ki) y, paradjicamente,
disminuye la Km por el mismo valor obtenindose una Kmap menor.
Inhibicin por exceso de substrato puede ocurrir. La curva de velocidad en funcin de
diferentes concentraciones de substrato presenta un mximo. En general se da este tipo
de inhibicin cuando el substrato a grandes concentraciones puede reaccionar con la
protena enzimtica en lugar diferente al de la unin enzima substrato

Imaginemos que estamos estudiando una reaccin S P


catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes
resultados:
[S] (mmol L-1)

v(mol L-1 min-1)


[I] = 0

v(mol L-1 min-1)


[I] = 2 10-3 M

0,30
0,57
0.36
0,50
0,85
0.55
0,75
1,18
0.75
1,50
1,82
1.33
3,00
2,50
2.22
7,50
3,23
3.13
A partir de estos datos calcular, mediante la representacin
adecuada: Vmax, Kmap, Kic y grado de inhibicin (i) para [S] =
0,65 mM. Qu concentracin de inhibidor habra que utilizar para
inhibir la enzima un 25% a la misma concentracin de sustrato?