TEMA 3

PRETRATAMIENTO, EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN

 Ácidos nucleicos → LOCALIZACIÓN: Interior celular → Núcleo, mitocondrias y/o

cloroplastos.

 Necesario: Destrucción de membranas y paredes para lograr acceder al material

genético.

 Ácidos nucleicos → Necesitan ser extraídos y purificados

PRETRATAMIENTO
Obtener una suspensión celular a partir de una muestra biológica

EXRTRACCIÓN
Hacemos accesibles a los ácidos nucleicos

PURIFICACIÓN
Eliminamos sustancias que interfieran en las técnicas

PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS BIOLÓGICAS

 Cualquier muestra biológica → Ácidos nucleicos.

 Material de trabajo biológico: Suspensiones celulares → Necesario: ”Pretratamiento

de muestra”

 Suspensiones celulares: Células libres y agregados celulares que flotan dispersos en

un medio líquido.

 Muestras más habituales:

 Sangre.

 Cultivos celulares.

 Tejidos animales o vegetales frescos.

 Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina.

 Esputos, bacterias, levaduras, células de la mucosa oral.

Sangre

 Muestra biológica de las más habituales.

 Purificación de ácidos nucleicos → Leucocitos;

Eritrocitos → ¿Complicación?

 Consideraciones:

 A partir de: Sangre anticoagulada: EDTA, heparina, citrato sódico.

  Extracción: 24 horas siguientes al momento de obtención de la muestra.

Si no → Conservación a 4ºC (5 días).

Hematíes

 Lisis de los hematíes:

 Lisis de los eritrocitos (solución/tampón de lisis 1(sangre:3 tampón)

 Centrifugado de la muestra.

 Eliminación del sobrenadante (componentes plasma y hemoglobina).

 Conservar el sedimento (pellet). → Células (linfocitos) → Extracción

Células mononucleadas

 Aplicación: Aislar y estudiar ácidos nucleicos de retrovirus: VIH y HTLV.

 Células mononucleadas: Linfocitos y Monocitos.

 Técnica: Centrifugación en gradiente de densidad:

 Tubo de separación: Sangre + Medio separación.

 Centrifugación: (20-30 m a 1900-2700 rpm).

 Eliminación sobrenadante + Aspiración capa PBMC (células

mononucleadas) (pipeta Pasteur)

 Lavado con tampón/solución salina.

Continuación de proceso de extracción.

Cultivos celulares

 Objetivo: Obtener células in vitro → Recolección de células antes de extraer ADN.

 Técnica: Siembra controlada en medios adecuados.

 Aplicación: Estudios genómicos y de expresión génica.

 Muestras:

> Cultivos en suspensión.

Recolección de células en tubo

Centrifugación (para eliminar medio)

Lavado de células con tampón fisiológico

> Cultivos en monocapa.

Despegar monocapa de células (mecánica con raspador o usando enzimas)

Recolección células en tubo

Lavado de células (tampón fisiológico)

Tejidos animales o vegetales frescos

 Muestra inicial: Tejido (distinto de la sangre)

 Homogeneización: Tratamiento mecánico/químico al que se somete un tejido para

liberar las células que lo integran.

 ¿Cuánta cantidad?: Depende...

Tipo de tejido

Método de homogeneización

Procedimiento de extracción/purificación de ácidos nucleicos.

 Tipos de homogeneización:

 Mecánica: Consiste en someter al tejido a una acción trituradora o abrasiva

para desmenuzarlo. Tipos: Automatizada o manual.

 Química: Someter el tejido a la acción de proteasas y detergentes que

degradan los componentes tisulares, y con ello, las células.
  Homogeneización automatizada:

 Corte del tejido en pequeños fragmentos.

 Homogeneización: Uso de trituradores mecánicos, adición de agentes

abrasivos y agitación, esferas de vidrio o cerámica.

 Transferencia a tubo limpio para iniciar la extracción.

 ¡Atención! Puede haber liberación de enzimas degradadoras. Se recomienda

añadir inhibidores, o realizar los procesos en frío y rápidamente.

 Homogeneización manual:

 Cortar el tejido en fragmentos Luego, se cubren con nitrógeno líquido

(congelación).

 Homogeneización: Uso de mortero y se minimiza el problema de la

degradación. Conseguir un polvo fino.

 Transferencia de polvo a tubo y se inicia el proceso de extracción.

 Homogeneización química:

 Se recurre a ella en casos de muestras pequeñas y para muestras obtenidas de

un criostato.

PROCEDIMIENTO:

 Se añade a la muestra la mezcla de incubación (proteasas y detergentes).

 Se lleva la muestra a la incubadora (37-56ºC. 12-24 horas).

 Tras el período de incubación, se retira la muestra y se continúa con el proceso

de extracción.

Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina

 Útil para la realización de estudios retrospectivos.

 INCONVENIENTE: La calidad de los ácidos nucleicos recuperados es peor. La fijación

del ADN en formol o parafina fragmenta el ADN

 PRETRATAMIENTO → Desparafinización: Eliminación de la parafina en este tipo de

tejidos.

 Cortes finos del tejido con un microtomo.

 Transferencia de 5-10 mg de cortes a un tubo eppendorf.

 Incubación con: agente desparafinante, etanoles de concentración decreciente

y agua destilada.

 El tejido desparafinado y rehidratado se somete a una homogeneización

química junto con el primer paso de la extracción de ácidos nucleicos.
Cultivos de bacterias y levaduras

 PRETRATAMIENTO: Bacterias y levaduras en un tampón de suspensión.

 CULTIVOS EN MEDIO LÍQUIDO:

 Centrifugación del tubo para eliminar el medio de cultivo

sobrenadante.

 Resuspensión del sedimento en el tampón de suspensión.

 COLONIAS AISLADAS EN UN MEDIO SÓLIDO:

 Se recoge una colonia con un asa de siembra estéril.

 Resuspensión de la colonia en el tampón de suspensión.

Células de la mucosa oral

 Obtención de células:

 Raspado de la mucosa oral con torunda o cepillo y sumergir en solución

conservante para que las células se desprendan.
Kits comerciales para
 Mediante enjuague con una solución conservante. recogida y conservación
 Recolectando saliva.
CENTRIFUGACIÓN Y ELIMINACIÓN SOBRENADANTE
Esputo

 Material proveniente de las vías respiratorias.

 Aplicación: Detectar o confirmar la presencia de microorganismos patógenos →

Infecciones respiratorias

 PRETRATAMIENTO:

 Fluidificación con un agente mucolítico en una disolución de citrato sódico.

 En caso de micobacterias: hidróxido sódico.

 EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

La extracción implica... Incubación en “Solución de lisis”

➢ Lisis / Rotura celular → Liberación de ácidos nucleicos

➢ Inactivación de nucleasas celulares (ADNasas y ARNasas)

Las paredes celulares (en caso de bacterias) implican una mayor dificultad para la lisis.
Variaciones de lisis celular

Extracción: Obtención de un lisado celular de aspecto homogéneo en el que los ácidos

nucleicos se encuentran libres, sin estructuras que los aíslen.

SOLUCIÓN DE LISIS CELULAR

Detergentes

 Componentes principales de la solución de lisis.

 Función: Desestructuran la bicapa lipídica y desnaturalizan sus proteínas.

 Detergente más utilizado: dodecil-sulfato-sódico (SDS). Se usa combinado con EDTA.

EDTA

 Quelante de cationes divalentes: calcio y magnesio.

 Magnesio: cofactor de ADNasas.

 EDTA atrapa al magnesio e inhibe la actividad de ADNasas.

PROTEASAS

 Se le pueden añadir a la solución de lisis.

 Función: Digestión de proteínas → Facilitando la rotura y disolución de membranas, y

eliminan nucleasas.

 Se emplean en tejidos frescos y tejidos fijados en formol e incluidos en parafina.

AGENTES CAOTRÓPICOS

 Función: Inactivación de las nucleasas

 Por desnaturalización inactivan a las nucleasas para que no realicen su actividad.

 Ejemplos: isotiocianato de guanidinio.

TRATAMIENTO ANTE PAREDES CELULARES

Tratamiento enzimático
Tratamiento mecánico

Tratamiento con CTAB

Tratamiento enzimático

 Enzimas específicas requeridas para la degradación de la pared celular:

 Lisozima o lisostafin: degradan la pared de bacterias Gram-positivas.

 Liticasa o zimolasa: células vegetales, levaduras y hongos.

 Pueden usarse simultáneamente a la solución de lisis con detergente.

Tratamiento mecánico

 En bacterias es posible romper la pared celular mediante métodos mecánicos:

 Ebullición en agua destilada o tampón.

 Ciclos de congelación-descongelación.

 Sonicación (ultrasonido).

Tratamiento con CTAB

 Se utiliza para realizar la lisis celular en aquellas células con pared celular poseen alto
contenido en polisacáridos y derivados polifenólicos, los cuales, interfieren en
procesos utilizados en biología molecular.

 Se sustituye el SDS por CTAB, capaz de eliminar los compuestos citados anteriormente.

Verificación del resultado de la lisis

 Garantizar el éxito de la lisis / rotura celular

 Si la lisis celular no ha sido suficiente → Se prolongará hasta conseguir una completa

homogeneización de la muestra.

 Si tras el período de incubación estándar la lisis continúa sin ser homogénea, se añade
más y se vuelve a incubar la muestra.

 Solución homogénea → Buen resultado de lisis celular

Consideraciones en la extracción del ADN

 En ocasiones, se elimina el ARN, debido a que puede interferir en estudios

posteriores.

 El ARN se elimina después de la lisis celular y antes de la purificación.

 Influye el tipo de muestra.

 Sangre: No suele ser necesario. Contaminación mínima.

 Saliva, tejidos y raspados: Necesario.

 Proceso:

 Se añade ARNasa A al medio de reacción.

 Incubación a 37ºC durante 15-45 minutos.

TEMA 3
PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

¿Qué es purificación?

 Los ácidos nucleicos se encuentran inmersos en un extracto celular complejo junto a

proteínas, sales minerales, componentes celulares solubles y los propios reactivos
empleados en la extracción.

 Purificación → Necesario → Separar los ácidos nucleicos de los demás componentes

del lisado.

TÉCNICAS

CROMATOGRAFÍA DE PURIFICACIÓN
PURIFICACIÓN CON PRECIPITACIÓN MEDIANTE
INTERCAMBIO CROMATOGRAFÍA ULTRAFILTRACIÓN
SOLVENTES CON SALES ESFERAS
IÓNICO DE ADSORCIÓN
ORGÁNICOS MAGNÉTICAS

Purificación con solventes orgánicos

 BASE: Diferencia de solubilidad de los compuestos integrantes del lisado celular en

solventes orgánicos.

 PROCEDIMIENTO:

1. Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos.

2. Precipitación del ADN.

3. Lavado del ADN.

4. Resuspensión del ADN.

1. Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos

 Solventes orgánicos más habituales: Fenol, cloroformo y alcohol isoamílico en

proporciones 25:24:1.

 PASOS:

 Mezcla: Lisado + reactivo.

 Agitación con vórtex.

 Lisado: fase acuosa.

 Cloroformo: disuelve lípidos y proporciona fase orgánica a la mezcla.

 Fenol: desnaturaliza y disuelve proteínas del lisado, se integra a fase

orgánica.

 Centrifugación: Separación en:

 Fase acuosa (parte superior del tubo): ácidos nucleicos, sales y

componentes hidrosolubles.

 Fase orgánica (parte inferior del tubo): proteínas y lípidos.

2. Precipitación del ADN

 PASOS:

 Fase acuosa a tubo limpio.

 Adición de acetato sódico e isopropanol/etanol 100% frío → Precipitación

ADN

 Centrifugación:

 Sobrenadante: Componentes contaminantes hidrosolubles

 ADN precipita en el fondo del tubo.

Cargas negativas hacen Etanol: Capta moléculas de agua

ADN → Molécula (no se unen a ADN)
que moléculas de ADN
polianiónica se repelan. Reaccionan
con el agua Sodio: Neutraliza cargas negativas →
Se forma red / maraña entre
moléculas de ADN (visible)

Etanol: Capta moléculas de agua (no se unen a ADN)

Sodio: Neutraliza cargas negativas → Se forma red / maraña entre moléculas de ADN
(visible)
3. Lavado del ADN

 Tras eliminar el sobrenadante, el pellet de ADN se lava con etanol

 Centrifugación:

 Parte insoluble (pellet): ADN insoluble en etanol

 Parte soluble (sobrenadante): Restos de sales y posibles contaminantes.

4. Resuspensión del ADN

 Pellet de ADN se deja secar con el tubo abierto a temperatura ambiente.

 Resuspensión con agua destilada o tampón de baja fuerza iónica a pH neutro o poco
alcalino (Tris-EDTA).

 Rehidratación del ADN:

 Incubación inicial a 55-65ºC.

 Segunda incubación (Temperatura suave) con agitación o incubación en

nevera durante un día a 4ºC.

Precipitación con sales

 BASE: Precipitación debido a altas concentraciones salinas.

 Concentraciones salinas producen elevada fuerza iónica → Dificultan solubilidad →

Precipitación.

 PASOS:

1. Precipitación de proteínas.

2. Precipitación del ADN.

3. Lavado y resuspensión del ADN.

1. Precipitación de proteínas

 Se añade al lisado un volumen igual de solución salina concentrada

 Agitación (vórtex): 20-30 segundos.

 Centrifugación:

 Proteínas en el fondo del tubo (pellet proteico).

Sobrenadante: ácidos nucleicos, sales y componentes hidrosolubles

2. Precipitación del ADN

 Transferencia del sobrenadante a un tubo limpio.

 Adición de isopropanol y mezclado (inversión tubo).

 Precipitación de ADN (hebras blanquecinas)

 Centrifugación → Sedimentación de ADN.

3. Lavado y resuspensión del ADN.

 Eliminación del sobrenadante

 Lavado del ADN con etanol.

 Resuspensión en agua destilada o tampón tris-EDTA (TE).

Cromatografía de intercambio iónico

 BASE: Unión electroestática reversible de iones en solución a grupos funcionales

cargados que están unidos covalentemente a una fase estacionaria/sólida.

 INTERCAMBIADORES ANIÓNICOS: Grupos de la fase estacionaria con carga neta

positiva.

 INTERCAMBIADORES CATIÓNICOS: Grupos de la fase estacionaria con carga neta

negativa.

 ¿Cómo funciona?

 Fase estacionaria: matrices de sílice o celulosa empaquetadas en columnas de

polipropileno.

 A la matriz se une covalentemente un intercambiador aniónico (positivo).

 metilaminoetanol (MAE) y dietilaminoetil (DEAE).

 Unión de ácidos nucleicos a la columna (carga negativa).

 Otras moléculas (proteínas, polisacáridos, contaminantes) poseen carga

positiva y no se unen.
  Lavado de la columna con tampones de concentración salina creciente, eliminando
contaminantes con carga negativa débil.

 Separación de ADN de la columna con → Tampón de máxima salinidad y alto pH.

 Precipitación de ADN con isopropanol o etanol (eliminar sales).

 Lavado con etanol (eliminar restos de etanol)

 Resuspensión en agua destilada o tampón.

Cromatografía de adsorción

BASE: Capacidad de adsorción de los ácidos nucleicos al vidrio y a la sílice en presencia de

sales caotrópicas.

Estas sales retienen moléculas de agua → Permiten unión / interacción entre ácido nucleico
y superficie (ej: vidrio)

Procedimiento

 SOPORTE: Se utilizan membranas de lana de vidrio o perlas de sílice empaquetadas

en columnas de polipropileno. Todo ello en tubos colectores.

 Primer paso:

 Columna se carga con el lisado diluido en un tampón con agentes caotrópicos

y se centrifuga.

 Los ácidos nucleicos se unen a la columna, mientras que el medio líquido con
proteínas y otros componentes se recogen en el tubo colector y se eliminan.

 Segundo paso:

 Lavado de la columna con etanol, centrifugación y eliminación del contenido

del tubo colector.

 Centrifugación para eliminar restos de alcohol y se desecha el tubo colector.

 Tercer paso:

 Columna a un tubo limpio

 Adición de agua destilada o tampón tris-EDTA.

 El ADN recupera su cobertura hidratante → Se separa de la columna.

 Incubación de 3-5 min para favorecer resuspensión del ácido nucleico.

 Centrifugación y se desecha la columna

 Tubo de eppendorf con ácido nucleico recolectado.

Purificación mediante esferas magnéticas

 BASE: Unión de los ácidos nucleicos a microesferas magnéticas que pueden ser
retenidas mediante un imán.

 Características de microesferas: Constituidas por nanopartículas de magnetita

encapsuladas en una matriz inerte.

 Unión de ácidos nucleicos se hace por adsorción o afinidad.

Adsorción de ácidos nucleicos a esferas magnéticas

 Se mezclan esferas, lisado, agente caotrópico → Se produce la adsorción.

 Mezcla en tubo con un soporte con un imán → Esferas atraídas hacia pared del tubo
por el imán.

 Eliminación del resto (pipeteo/decantación).

 Se retira el tubo del soporte con imán.

 Se añade etanol y se agita.

 Se vuelve a colocar en el soporte → Unión de esferas a la pared → Resto se elimina.

 Se retira el tubo → Se añade agua destilada o tampón TE → Incubación (10 minutos)

→ Separación de ácidos nucleicos y resuspensión.

 Tubo en el separador magnético → Esferas libres se unen a pared → Ácidos nucleicos

en solución se pipetean y se transfieren a un tubo limpio.

Separación magnética por afinidad

 Esferas recubiertas con polímeros con alta afinidad por ácidos nucleicos. Ejemplo:
oligonucleótidos poli-T (purifica ARNm eucariota con cola poli-A).

 Esferas se añaden al lisado con tampón → Hibridación poli-T con cola poli-A.

 Tubo en soporte con imán: Unión de ARNm a esferas y lisado se elimina.

 Lavado de esferas con etanol → Adición de agua destilada o tampón TE → Se eleva la

temperatura (desnaturalización térmica).

 Tubo en separador magnético → Esferas libres se unen a pared → ARNm en solución

se transfiere a un tubo limpio.
Ultrafiltración

 BASE: Retención por tamaño de las moléculas de ácidos nucleicos usando membranas
con tamaño de poro determinado. Se colocan en base de columnas.

 APLICACIÓN: Purificar productos de PCR (tamaño superior a 150 pb).

 PROCEDIMIENTO:

 La muestra (mezcla de reacción de PCR) se carga en la columna → CENTRIFUGACIÓN

→ Retención de productos amplificados de PCR en filtro → Contaminantes a tubo
colector pasan.

 Lavado de filtro con etanol (eliminar restos de contaminantes).

 Adición a columna agua destilada o tampón TE → Incubación (Tª ambiente) →

Resuspensión → Transferencia a nuevo tubo (pipeteo).

Purificación de plásmidos

Técnicas

 Plásmidos: Molécula de ADN que se replica de forma

independiente.
Centrifugación
 Herramienta muy útil por su uso como vectores para
en gradiente de clonar secuencias genéticas de interés.
densidad
 Es necesario separarlos del ADN cromosómico y del
ARN bacteriano.

Lisis alcalina

Centrifugación en gradiente de densidad

 BASE: Diferencia de densidad de ambos tipos de moléculas.

 Tras purificación del ADN bicatenario (cromosómico + plasmídico) →

Ultracentrifugación en gradiente de densidad.

 ADN cromosómico y plasmídico se separan por diferencias de densidad (bandas

diferenciadas).

 INCONVENIENTE: Técnica laboriosa y duradera.

Lisis alcalina

 Más usado.

 BASE: Diferencias en el proceso desnaturalización/renaturalización.

 Fases:

 1. Lisis alcalina.

 Bacterias en suspensión.

 Adición de solución de lisis (detergente aniónico SDS e hidróxido de sodio).

 Incubación → Lisis de las bacterias por acción del SDS y desnaturalización del ADN.

 2. Neutralización rápida.

 Adición de solución de acetato potásico que produce:

 Uniones aleatorias entre las moléculas de ADN cromosómico →

Precipitación. El ADN plasmídico se renaturaliza correctamente (menor
tamaño).

 Precipitación proteica → Agregados que atrapan el ADN cromosómico.

 Centrifugación → ADN plasmídico en sobrenadante (menor tamaño).

 3. Purificación del ADN plasmídico.

 Sobrenadante a un tubo limpio.

 Tratamiento con ARNasa (eliminar ARN contaminante).

 Purificación del ADN: esferas magnéticas, cromatografía de adsorción, etc.

 TEMA 4
CONCEPTOS Y BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN

¿Qué es la hibridación?

Consiste en la unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos, por la

complementariedad de su secuencia de bases nitrogenadas → Originando una molécula
híbrida bicatenaria.

Opciones

Dos cadenas de ADN Dos cadenas de ARN Una cadena de

ADN y otra de ARN

APLICACIONES

 Detección de secuencias concretas (dianas) de ácidos nucleicos (ADN o ARN) usando

sondas marcadas (fragmentos complementarios-9.

 Dianas: Secuencia concreta de bases nitrogenadas que se pretende detectar en la

muestra problema.

 Sonda: Cadena de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es

complementaria a la secuencia diana.

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

CRITERIOS

Ácido nucleico Marcaje de la El medio o

que se quiere Sonda utilizada soporte de
sonda
detectar hibridación
DESNATURALIZACIÓN

 Propiedad del ADN consistente en la separación de las dos cadenas (molécula

bicatenaria) → Ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases
complementarias.

 ¿Cómo se consigue?

 Aumentando el pH.

Aumentando la temperatura.

CURVA DE FUSIÓN DEL ADN

 Curva que representa la desnaturalización.

 BASE: Medición de la absorbancia a 260 nm de molécula bicatenaria de ADN en

función de cómo va cambiando la temperatura.

 Curva sigmoide.

Se distinguen 3 zonas:

Primera zona o zona A.

Segunda zona o zona B.

Tercera zona o zona C.

Zona A

 TRAMO RECTO.

 Absorbancia a 260 nm con VALOR CONSTANTE (Valor

basal).

El valor basal depende únicamente de la concentración

molecular del ADN en solución.

Zona B

 Aumento de la absorbancia a medida que aumenta la temperatura.

 Comienza la desnaturalización. Se distinguen 3 partes

 Forma lenta (curva cóncava).

 Forma rápida (recta con pendiente elevada).

 Forma lenta (curva convexa) → Se alcanza valor de absorbancia máxima.

 Absorbancia máxima →100% de desnaturalización.

 El aumento de la absorbancia se conoce como efecto hipercrómico.

Zona C

 Recta con pendiente prácticamente nula.

 Temperatura aumenta pero absorbancia no.

 ADN desnaturalizado al 100%.

Temperatura de fusión (Tm)

 Es la temperatura a la cual la desnaturalización es del 50%.

 Puede influir:

 LONGITUD DEL ADN → Mayor tamaño de la molécula, mayor cantidad de energía para
separar las dos cadenas (moléculas pequeñas).

 PROPORCIÓN DE PARES G-C → Cuanto más proporción de GC posea la molécula,

mayor cantidad de energía habrá que suministrar para separar las dos cadenas.

RENATURALIZACIÓN

Proceso por el cual dos cadenas de una molécula de ADN separadas vuelven a reasociarse

¿Cómo se consigue?

Bajando lentamente la temperatura, hasta formar la doble hélice original.

VELOCIDAD DE RENATURALIZACIÓN

 Es NECESARIO un choque entre las cadenas complementarias que se van a unir.

Cuanto mayor sea la concentración de AND → Mayor será la velocidad de renaturalización.

 Fases de renaturalización:

 NUCLEACIÓN: Lenta. Secuencias cortas con bases complementarias se

aparean.

CIERRE DE CREMALLERA: Rápida. Secuencias vecinas se cierran → Se forma la doble hélice.

CURVA DE RENATURALIZACIÓN

Se representa la fracción de ADN renaturalizado (%) frente al logaritmo de Concentración

inicial (en tiempo 0).

Comportamiento
diferente

ADN eucariota ADN procariota

Renaturalización en procariotas

 CURVA SIGMOIDE

 C0t1/2: Valor donde la renaturalización es del 50%.

 A mayor complejidad, mayor C0t1/2.

 Velocidad de Renaturalización → Inversamente proporcional a complejidad de

molécula

Renaturalización en eucariotas

 Curva escalonada (varios puntos de inflexion).

 El genoma eucariótico tiene 3 tipos de secuencias:

 Secuencias altamente repetidas.

 Secuencias moderadamente repetidas.

 Secuencias únicas.

 3 FASES:

 Componente rápido: Secuencias altamente repetidas.

 Componente intermedio: Secuencias moderadamente repetidas.

 Componente lento: Secuencias únicas.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA HIBRIDACIÓN

Fuerza iónica de la solución

Presencia de agentes desnaturalizantes

Porcentaje de bases no complementarias

Fuerza iónica de la solución

 Los cationes monovalentes se usan para estabilizar la

doble hélice de los híbridos. Ya que la rodea y
neutralizan su carga negativa.

 A mayor concentración de cationes monovalentes →

Mayor aporte de energía para desnaturalizacion (Tm).

 La curva de fusión se desplaza hacia la derecha.

Agentes desnaturalizantes

 Agentes desnaturalizantes se utilizan para

desestabilizar / romper los puentes de hidrógeno
→ facilitando su rupture o desnaturalización.

 Mayor cantidad de agentes desnaturalizantes →

Menor energía para la desnaturalización (Tm).

 Curva se desplaza hacia la izquierda.

Porcentaje de bases no complementarias

 Puede ocurrir que la sonda, en lugar de unirse a la secuencia diana, se una a

secuencias parecidas →Híbridos imperfectos.

 En los híbridos imperfectos existen bases desapareadas → Hay un menor número de

puentes de hidrógeno establecidos.

 RELACIÓN INVERSA:

A mayor porcentaje de bases no complementarias → menor energía para desnaturalización

(Tm).

TEMA 4
TIPOS DE SONDAS, MARCAJE DE SONDAS Y FASES DE LA HIBRIDACIÓN

CARACTERÍSTICAS DE LAS SONDAS

 Pueden ser bicatenarias o monocatenarias.

 Tamaño variable.

 Hay diferentes tipos. ¿De qué depende elegir una u otra?

 Especificidad de la sonda.

 Sensibilidad de la sonda.

 Tipo de muestra.

 Técnica que se vaya a aplicar.

 Marcaje empleado.

 TIPOS DE SONDAS:

- Sondas ADN.

- Sondas ARN.

- Sondas químicas sintéticas de ácidos nucleicos.

Especificidad y sensibilidad

 ESPECIFICIDAD:

Capacidad que tiene una sonda para discriminar la secuencia diana con la que se tiene que
hibridar.

 Tamaño mínimo de una sonda: 16 bases. En caso contrario, hibridación

inespecífica.

 SENSIBILIDAD:

Probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda-diana. Es decir, que el

resultado sea positivo.

SONDAS DE ADN

 Las más utilizadas.

 Ventajas: Fáciles de obtener; Gran versatilidad.

 Según el método de obtención, pueden ser:

 De síntesis química.

 De ADN recombinante.

 De PCR.

Sondas de ADN: De síntesis química

 Características:

 Monocatenarias.

 Tamaño reducido (<200 nucleótidos).

 Se obtienen por condensación química secuencial de los desoxinucleótidos concretos

a incorporar. (Primer nucleótido anclado a fase sólido + adición del resto (uno a uno)).

 Ventajas:

 No requieren desnaturalización por calor durante el proceso de hibridación.

 Mejor penetración en el tejido debido a su reducido tamaño (hibridación in

situ).

 Inconvenientes:

 Baja sensibilidad.

 Hibridación inespecífica.
Sondas de ADN: De ADN recombinante

 Características:

 Ser bicatenarias.

 Gran tamaño (alta sensibilidad).

 Alta especificidad.

 Se obtienen por un proceso de clonación y amplificación por cultivo.

 Pasos:

 El fragmento de ADN a emplear como sonda se inserta en un vector (plásmido

bacteriano).

 El plásmido se introduce en una bacteria y se cultiva en un medio apropiado.

 Se extrae el plásmido amplificado y se emplea entero como sonda o

separarse el fragmento de interés con enzimas de restricción.

Sondas de ADN: De PCR

 Características:

 Ser bicatenarias.

 Tamaño intermedio.

 Consiste en amplificar el fragmento que nos interesa como sonda mediante la

reacción en cadena de la polimerasa.

SONDAS DE ARN

 Menos utilizadas.

 Siempre monocatenarias.

 Ventaja:

 Híbridos ADN/ARN más estables que los híbridos ADN/ADN.

 Desventaja:

 Sensibles a la contaminación por ARNasas.

 Según proceso de obtención, pueden ser:

 Síntesis química.

 Transcripción.
Sondas de ARN: De síntesis química y transcripción

 Síntesis química:

 Se obtienen por condensación química secuencial de los ribonucleótidos

concretos a incorporar.

 Posee las mismas ventajas y desventajas que las sondas de síntesis química de
ADN.

 Transcripción:

 Consiste en transcribir un vector que contiene el fragmento de interés o usar

un ADN complementario mediante una ARN polimerasa.

SONDAS QUÍMICAS SINTÉTICAS

Se producen haciendo modificaciones químicas sintéticas de los ácidos nucleicos.

TIPOS

Sondas de Sondas de
ácidos nucleicos ácidos nucleicos
peptídicos bloqueados

Sondas de ácidos nucleicos peptídicos

 Definición: Son oligómeros sintéticos en los que la estructura glúcido-fosfato es

sustituida por una estructura aminoetil-glicina unidas por enlaces amida.

 Se usan en técnicas de hibridación in situ.

 Características:

 No tienen carga eléctrica.

 No son degradadas por nucleasas ni por proteasas.

 Ventajas:

 Hibridan más rápido.

 Híbridos más estables.

 La fuerza iónica del medio influye muy poco.

 Alta especificidad.

Desventajas:
  Menor solubilidad.

 Corta longitud.

 Sólo se pueden obtener por síntesis química.

Sondas de ácidos nucleicos bloqueados

 Definición: Oligómeros sintéticos de ribonucleótidos en los que se modifican

químicamente algunas ribosas mediante la formación de un enlace (átomo O2) entre
el carbono 2’ y el carbono 4’.

 Presentan mayor sensibilidad y especificidad.

 Se obtienen por síntesis química.

 Pequeño tamaño.

 En hibridación in situ.

MARCAJE DE SONDAS

Es el procedimiento de marcar la sonda utilizada en las técnicas de hibridación con la finalidad

de poder visualizar los resultados.

TIPOS

Isótopos
Fluorocromos Haptenos
radiactivos

ISÓTOPOS RADIACTIVOS

 Elementos químicos con capacidad de emitir radiaciones. Los más usados son el
fósforo-32 y el tritio.

 ¿Cómo se marca? Se introducen nucleótidos radiactivos que contienen alguno de

estos isótopos.

 Ventaja: Alta sensibilidad

 Inconveniente: Instalaciones adecuadas y personal entrenado.

 En hibridación en filtro: Southern blot, Northern blot y dot blot.

 Detección: Autorradiografía.
FLUOROCROMOS

 Compuestos químicos que emiten luz al ser excitados por luz ultravioleta.

 Principalmente en FISH.

 Varias sondas marcadas con diferentes fluorocromos permite detectar varias

secuencias diana a la vez.

 Detección: Microscopio de fluorescencia.

HAPTENOS

• Moléculas de pequeño tamaño que se pueden acoplar a los nucleótidos y no alteran

la especificidad de las sondas.
• Detección: Métodos indirectos (se usan anticuerpos anti-haptenos).
• Los más usados: Digoxigenina y biotina.
• En todas las técnicas de hibridación.
• Sensibilidad baja.

MÉTODOS DE MARCAJE

TIPOS

Desplazamiento Cebado al azar o Marcaje de

Marcaje terminal Marcaje por PCR
de mella cebado aleatorio sondas de ARN

Desplazamiento de mella

 Se usa para marcar sondas de ADN bicatenario o genomas enteros.

 ¿Cómo?:

Incubación de sonda con mezcla de reacción:

 ADNasa I: Introduce mellas/cortes

 ADN polimerasa I: Rellena desde el corte con nucleótidos.

 Mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato: uno de ellos marcado.

Cebado al azar o cebado aleatorio

 Marcar ADN bicatenario grande o genomas completos

 ¿Cómo?: Incubación de sonda con:

 Mezcla de oligonucleótidos de 6 bases (hexámeros).

 Fragmento Klenow de la ADN polimerasa I.

 Mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato: uno de ellos marcado.

 ¿Cómo se produce el marcaje?

 Desnaturalización de la sonda.

 Unión de los hexámeros a la sonda al azar.

 La sonda sirve como molde para sintetizar un nuevo ADN con un nucleótido
marcado.

Marcaje terminal

 Marcar ADN bicatenario o monocatenario (pequeño y mediano tamaño)

 Se usa: Enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). No necesita cadena

molde e incorpora todo tipo de nucleótidos marcados.

 Mezcla: TdT y desoxinucleótido trifosfato marcado.

 Dos posibilidades de marcaje:

 Marcaje con UN ÚNICO NUCLEÓTIDO MARCADO en el extremo 3’ de la

sonda.

 Incorporación de una COLA DE NUCLEÓTIDOS MARCADOS en la sonda.

Marcaje por PCR

 Se realiza en el mismo proceso de obtención de las sondas

por PCR.

Marcaje de sondas de ARN

Se realiza en el mismo proceso de obtención de la sonda ARN.

PURIFICACIÓN DE LA SONDA MARCADA

Consiste en la eliminación de los nucleótidos libres marcados para “evitar ruido de fondo” en
los resultados.

Cromatografía de exclusión por tamaño:

Se usan geles en microcolumnas acoplado a tubo.

La mezcla de reacción se carga en la columna y se centrifuga.

Los nucleótidos libres quedan atrapados en el gel → Sonda purificada pasa al tubo.

Cromatografía de adsorción

Se usan matrices de lana de vidrio o sílice en microcolumnas acoplado a tubo.

FASES DE HIBRIDACIÓN

PRE-
HIBRIDACIÓN
HIBRIDACIÓN LAVADO DETECCIÓN

Preparación de
muestra y soporte Eliminar híbridos Varía en función
imperfectos del marcador

Formación del híbrido.

Importante rango de Tm
(-32ºC - -16ºC)