ESTABLECIMIENTO DE UN PROCESO TECNOLOGICO PARA LA SEPARACION

DE PECTINLIASA DE PECTINESTERASA Y POLIGALACTURONASA EN UN

PREPARADO COMERCIAL DE PECTINASAS MEDIANTE CROMATOGRAFIA
PSEUDOBIOESPECIFICA POR AFINIDAD

Presentado por
ALBERTO MAURICIO MARTINEZ LAFAURIE
242537

Presentado a
I.Q. MARIO VELÁSQUEZ

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA
Bogotá D.C. 31 de mayo de 2005
 INTRODUCCION

En la actualidad, la gran cantidad de compuestos tanto de origen químico como

bioquímico hacen necesaria la inclusión de diferentes y numerosas técnicas de
separación de los compuestos que se hallan, con el fin de obtener los beneficios que
estos ofrecen. Una de las técnicas más estudiadas durante el desarrollo del curso trata
de la cromatografía; la cual tiene como principio de separación la migración diferencial;
es decir un retardo selectivo de las moléculas de soluto durante su paso a través del
lecho de resina. El uso de la cromatografía está ampliamente extendido en el análisis
de alimentos, medicinas, sangre, productos petrolíferos y de fisión radiactiva.

Así pues, dentro del marco de estudio de cromatografía, existe una clasificación que
es de gran interés para la realización de este trabajo: Cromatografía de afinidad. La
cual utiliza un ligando en la superficie de la fase estacionaria con el fin de atrapar la
molécula del soluto que sea afín con el ligando, generando de esta forma un enlace
químico lo suficientemente fuerte para que el soluto evite ser arrastrado o eluido. Si
bien la cromatografía de afinidad es usada extensivamente en el laboratorio, su
aceptación se ha visto limitada en escalas mayores debido a los altos costos que
presentan los ligandos y debido a su inestabilidad biológica y química. Solo
recientemente el desarrollo de nuevos métodos para la selección y el diseño de
ligandos sintéticos estables, ha abierto la oportunidad de exploración de diversos
materiales a gran escala.

Un viejo axioma biotecnológico sostiene que nunca se debe purificar un compuesto

más de lo necesario, pues aumentaría el costo del producto final, con la consiguiente
desventaja en el mercado. Por ello, se requiere diseñar un procedimiento que asegure
una pureza de las enzimas adecuada para su uso. En general, las utilizadas en la
industria alimentaria no necesitan una purificación extrema, comparada, por ejemplo,
con la requerida por algunas de uso terapéutico.

Razón por la cual la cromatografía de afinidad es una de las técnicas mejor

recomendadas para el fraccionamiento de compuestos, independientemente del grado
de pureza que se necesite. Con lo que se concluye que el estudio de este proceso de
separación exige no solamente su realización a escala de laboratorio, sino que hay
que tener presente su posible aplicación a escala industrial, disminuyendo costos con
base en los ligandos utilizados y también el grado de pureza que se requiere.
 JUSTIFICACION

Jugos de fruta sin metanol

Los jugos de frutas prensadas son viscosos y turbios; para aclararlos y tornarlos
apetecibles se los trata con enzimas, proceso que libera alcohol metílico. Por ello,
quien los consume regularmente podría estar ingiriendo un producto tóxico durante
gran parte de su vida. En lo que sigue se considerará un conjunto de enzimas
empleadas en el procesamiento de alimentos vegetales, denominadas genéricamente
pectinasas, que digieren la pectina, sustancia presente en las paredes de las células
vegetales y en la lámina media (o estructura que une las células para formar tejidos).

Porque así lo prefiere el consumidor, algunos jugos de frutas, como los de manzana y
pera, deben tener aspecto cristalino, lo cual hace necesario aclararlos, ya que el
producto obtenido por prensado es viscoso debido a la pectina disuelta (y
persistentemente turbio) por los fragmentos de paredes celulares en suspensión.
Cuando se agregan pectinasas, la viscosidad disminuye y las partículas pueden
eliminarse fácilmente, dejándolas sedimentar, centrifugando el líquido o filtrándolo. Por
otra parte, el tratamiento aumenta el rendimiento en jugo de la fruta prensada, pues al
apretarla se forma una masa semigelificada que carece de microcanales por los que
pueda fluir el zumo. Las pectinasas destruyen el gel y dan lugar a que el líquido corra
libremente, mientras los sólidos remanentes, insolubles, forman una pulpa que es fácil
de prensar.

Los jugos de naranja o toronja, contrariamente a los anteriores, deben llegar turbios al
consumidor, por lo que se usan las mismas enzimas para causar un efecto contrario a
la aclaración. Con el tiempo, las pectinas de alto peso molecular tienden a precipitar, a
causa del calcio presente en el jugo; si se tratan de manera controlada con pectinasas,
se reduce su peso molecular, no precipitan y la turbidez del jugo se estabiliza. De esta
manera, se evita que en los estantes del supermercado aparezcan botellas llenas
hasta la mitad con sedimento y el resto con un líquido transparente.

En los extractos comerciales de pectinasas usados para la fabricación de jugos de

fruta coexisten tres enzimas: la pectinliasa, la poligalacturonasa y la pectinesterasa. La
pectina es un polisacárido constituido principalmente por la unión de muchas
moléculas de ácido galacturónico (derivado ácido de la galactosa) parcialmente
metoxilado (con los grupos H del ácido reemplazados por CH 3). La figura 1 muestra los
puntos de ataque (la unión química que se rompe) de las diversas pectinasas. La
pectinliasa actúa sobre la pectina; las pectinesterasas remueven los grupos CH 3, por lo
que se las denomina enzimas demetoxilantes, y la poligalacturonasa actúa solamente
si la pectina ha sido previamente desprovista de los metilos por acción de las
pectinesterasas.
 Fig 1. Acción de las pectinasas sobre la pectina. A) Efecto directo de la pectinliasa. B) efecto de la poligalacturonasa
sobre la pectinliasa. B) efecto de la poligalacturonasa sobre la pectina previamente demetoxilada por la pectinesterasa

Como se observa en esa figura, la demetoxilación de la pectina por la pectinesterasa

libera metanol, que queda en el jugo; se trata de un caso típico de generación de una
sustancia tóxica como parte del procesamiento de un alimento. Por lo general, los
jugos se concentran, por calentamiento o por ultrafiltración en el lugar de producción
para reducir el flete; luego se los diluye y envasa cerca de los sitios de venta. Aquellos
que fueron sometidos a este proceso de concentración y dilución suelen llevar un
rótulo que así lo indica y tienen la ventaja de haber perdido casi totalmente el metanol,
junto con algunos compuestos aromáticos, debido al concentrado. Pero también se
venden jugos que no siguieron los pasos anteriores, distribuidos directamente al
público luego de ser prensada la fruta y aclarado el zumo. Son los que conservan el
metanol y, por ende, expondrían a los grandes bebedores de zumo a riesgos de los
que aún se sabe poco.

Algunos estudios realizados en el laboratorio, encontraron dosificaciones de metano

de varios jugos de manzana que se distribuyen comercialmente. Encontraron hasta
100mg por litro en los que no fueron concentrados y, si bien no se trata de una
cantidad que pueda provocar intoxicación aguda, ni ocasionar problemas de toxicidad
subaguda, podría representar un peligro para quienes consumen mucho de esos
productos, ya que no se conoce gran cosa sobre la toxicidad subcrónica del metanol.
Aclaremos que el vino contiene cantidades superiores de metanol (hasta 300-
4OOmg/l), pero coexiste con concentraciones mucho, más altas de etanol, su antídoto
biológico.

Los investigadores japoneses S. Ishii y T. Yokotsuka demostraron que, utilizando

pectinliasa purificada (que no necesita de la acción previa de la pectinesterasa
responsable de la liberación de metanol, para degradar a la pectina), se puede aclarar
jugo de manzana sin producción simultánea de metanol. Pero el método requiere
varias etapas cromatográficas, lo que descarta su utilización práctica por razones
económicas. El desafío que se plantearon los científicos fue eliminar la pectinesterasa
de un preparado comercial de pectinasas por algún método de purificación que
pudiera ser adoptado por la industria, pues, a medida que las reglamentaciones
alimentarias se vayan haciendo más estrictas, las industrias deberán adoptar
procedimientos que les permitan elaborar productos más saludables.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD PSEUDOBIOESPECIFICA

Los métodos cromatográficos de purificación de proteínas se pueden clasificar según

cómo aprovechen alguna propiedad fisicoquímica de las moléculas en estudio. Así, la
cromatografía de exclusión molecular separa las moléculas por su tamaño; la de
intercambio iónico diferencia la carga eléctrica de ellas, en la de interacción hidrofóbica
quedan retenidas en la columna aquellas proteínas que, por las características de los
aminoácidos de su superficie, se unen a la matriz excluyendo el agua (son hidrófobas),
y la de afinidad se basa en interacciones específicas entre la molécula a purificar y la
matriz de la columna.

Debido a que el tamaño, la carga eléctrica y la hidrofobicidad de la pectinesterasa son

semejantes a los de otras pectinasas presentes en la mezcla, optamos por la
cromatografía de afinidad, técnica que, cuando se emplea para inmovilizar un
anticuerpo con el propósito de purificar un antígeno (o viceversa), es muy cara y, por lo
tanto, sólo aplicable a la purificación industrial de proteínas de gran valor comercial.
Pero hay una cromatografía de afinidad, llamada pseudobioespecífica, en la que, para
purificar proteínas, se inmovilizan en la matriz colorantes o iones, substancias que,
debido a su estructura, simulan algún compuesto natural al que la proteína se une,
pues tiene afinidad por él. Aunque se trata de un procedimiento de menor selectividad,
es también mucho más barato.

Selección del ligando

Uno de los criterios estudiados para la selección de los ligandos, consiste en la

estructura molecular de la proteína que va a ser atrapada. Para este caso existen dos
factores muy importantes para el diseño del ligando por estructura: primero la habilidad
de predecir correctamente la conformación del ligando diseñado, y segundo la
habilidad de predecir correctamente el enlace4 de afinidad en el diseño del ligando.
Sin embargo, esta técnica de selección no en muy apropiada, debido que se requiere
de un exhausto estudio de la estructura molecular de la proteína.

Ahora bien, existe otra técnica que puede ser utilizada en la selección del ligando más
apropiado; consiste en identificar los posibles grupos funcionales del soluto o proteína
en este caso, y así encontrar el ligando que se adecue a las condiciones del sistema
(en cuanto a soluto y fase estacionaria). Esta es la estrategia que ha sido utilizada
para la selección del nuestro ligando
Algunos estudios desarrollados, demostraron que se ha de trabajar con cromatografía
de iones metálicos inmovilizados (IMAC, Immobilized Metal ion Affinity
Chromatography), que cumple con dos requisitos fundamentales: costo relativamente
bajo y posibilidad de ejecutar el proceso en escala industrial. Se basa en la interacción
de un ligando, que para este caso es un metal con ciertos grupos funcionales de una
proteína, sobre todo el aminoácido histidina. Un metal de transición, se agrega a una
matriz de agarosa (un polisacárido insoluble), que contiene el grupo aminodiacético. El
grupo simplemente retiene el metal y forma un complejo estable.

Fig 2. Mecanismo de la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados.

La matriz se coloca en una columna cuyo material puede ser de vidrio o plástico y se
hace pasar a través de ella la solución de proteínas: sólo quedarán retenidas aquellas
que tengan histidina en la superficie, las que podrán interaccionar con el metal; el resto
pasa son eluidas sin interaccionar. Las proteínas unidas al metal se separan de este
por la simple disminución del pH. Al producirse tal disminución, las histidinas toman
una carga eléctrica positiva, es decir que se protonan, con lo que pierden su capacidad
de interacción con el metal inmovilizado en la matriz cromatográfica.

Ejecución de la cromatografía

Cuando pasaron una solución de un preparado comercial de pectinasas extraídas de

hongos por una columna de IMAC, obtuvieron dos fracciones (Fig. 3), una que, eluía
de la columna sin interaccionar (I) y otra, que sólo eluía al disminuir el pH al valor 3,0
(II). Después, mediante técnicas de revelado, determinaron que la pectinliasa estaba
en I, mientras que en II se encontraban la pectinesterasa y la poligalacturonasa. En
otras palabras, se había encontrado un método factible de ser utilizado en la industria
para fraccionar una mezcla de pectinasas de manera que quedara separada la
pectinliasa de un preparado comercial de las otras pectinasas.
 Fig 3 Cromatografía de una mezcla de pectinasas en una columna IMAC. Las proteínas se detectan por su
absorbancia en 280 NM. La flecha indica el cambio de un medio alcalino (pH 8,0) a un ácido (pH 3.0)

Cuando se procedió a clarificar jugo de manzana con cada una de las fracciones y se
hizo una dosificación de metanol en los zumos aclarados, se halló, como era
previsible, que el alcohol estaba ausente cuando se usaba la fracción I, que no
contenía pectinesterasa. En cambio, se había producido metanol, debido a la acción
conjunta de la pectinesterasa y la poligalacturonasa al utilizar la fracción II. Una
ventaja de esta forma de fraccionamiento es que la pectinesterasa, separada de la
mezcla y presente en la fracción II, no se desecha y puede ser utilizada para aclarar
jugos que serán concentrados o para otros fines, como la producción de pectina
demetoxilada (ácido péctico), que se usa como espesante en la industria de las
mermeladas.

Como segundo paso, se buscó el procedimiento óptimo de separación en cuanto al

solvente cromatográfico, el metal inmovilizado, el flujo cromatográfico, la concentración
de la muestra y la fuerza iónica necesaria para retener toda la pectinesterasa en la
columna. En la tabla 2 se muestran los resultados obtenidos con distintos metales
inmovilizados: cobre, níquel (Ni) y zinc (Zn). Sobre la base de consideraciones de
rendimiento y estabilidad del metal inmovilizado en la matriz cromatográfica, se
concluyó que el cobre permitía una mejor separación.

RENDIMIENTO (%)
META FRACCIO
L N PECTINESTERA PECTINLIAS
SA A
I 0 100
Cu2+
II 100 0
I 11 100
Ni2+
II 89 0
I 60 100
Zn2+
II 40 0
 Tabla 2. Fraccionamiento de pectinasas por IMAC. Influencia del metal unido a la
matriz cromatográfica.
Otro de los factores que presenta gran trascendencia en cuanto al desarrollo de la
cromatografía, consiste en la influencia de la fuerza iónica, producida por
concentración de sales por ejemplo, de cloruro de sodio (NaCl), y del tampón
cromatográfico, o líquido de elución, sobre el fraccionamiento por IMAC. Se halló que
la pectinliasa no interacciona con la matriz cromatográfica en ninguna condición de
fuerza iónica, tanto con tampón Tris (nombre común del Tris-hidroximetil-
aminometano) como con tampón fosfato. Por el contrario, la pectinesterasa es
adsorbida por la matriz cromatográfica, con mayor interacción al aumentar la fuerza
iónica del tampón. Aunque este resultado es cualitativamente similar para las dos
soluciones tampón ensayadas, se encontró que el uso de fosfato para la adsorción y
acetato para la elución mejora el fraccionamiento cromatográfico con respecto al
tampón Tris, ya que se requiere menor concentración de NaCl para obtener adsorción
total de la pectinesterasa, lo cual disminuye los costos del proceso. Además, el fosfato
es un compuesto fisiológico, más barato que el Tris.

Fig 4. Retención de la pectinesterasa en la columna de IMAC según la fuerza iónica, dada por la concentración salina,
del tampón utilizado.

Por último, se determinaron los parámetros relevantes para pasar, mediante

cromatografía frontal, de la escala de laboratorio a la industrial. La técnica consiste en
cargar la muestra continuamente en la columna, hasta el momento en que no sea
retenida por haberse saturado la capacidad de la matriz. Por supuesto, interesa que la
columna retenga la mayor cantidad posible de proteína y que su salida sea abrupta. La
figura 5 indica la cantidad de muestra que sale de la columna en función del tiempo:
los trazados se conocen como curvas de ruptura y la cromatografía será tanto más
eficiente cuanto mayor sea la pendiente de esa curva, ya que la carga de la columna
debe finalizar cuando comienza a salir la proteína que se quiere adsorber. Las curvas
de ruptura para distintas velocidades a las que la muestra atraviesa la columna. Es
preferible el flujo más rápido, que permita conseguir la mejor carga de muestra en la
columna, para que el proceso sea más económico: en este caso, una velocidad de
0,80 cm/min cumple con ambas condiciones.

La forma de la curva de ruptura depende de la matriz cromatográfica y de las

condiciones operativas (flujo, concentración de muestra, etc.).
 Fig 5. Influencia de la velocidad de carga de la muestra sobre la forma de las curvas de ruptura

La gráfica siguiente revela el mismo fenómeno con relación a la concentración de

muestra sembrada: se pudo obtener una buena curva de ruptura con la máxima
concentración utilizada de 100mg/ml (no es posible usar concentraciones mayores por
la solubilidad de la muestra).

Fig 6. Influencia de la concentración de la muestra sembrada en la columna cromatográfica sobre la forma de las
curvas de ruptura

PROCESO DE ESCALADO A NIVEL PILOTO O INDUSTRIAL

Una vez que se halla realizado todo el tratamiento experimental a escala de

laboratorio, el siguiente paso consiste en ajustar los parámetros y variables
identificadas en el laboratorio a la escala que ahora se desea trabajar. Sin embargo,
analizando el trabajo descrito anteriormente, encontramos que aun hacen falta ciertas
mediciones que exige el experimento para poder desarrollar la cromatografía de
afinidad a escala industrial.

Por consiguiente, en este acápite del trabajo, se va a describir la forma (o ruta a

seguir) como se debe abordar el escalado, dando a entender que existen mediciones
experimentales de las cuales no se tienen conocimiento, tales como los volúmenes de
elución de las enzimas que son removidas (poligalacturonasa y pectinesterasa), así
como las dimensiones de la columna en las que se realizaron los experimentos. Para
comenzar, se deben mencionar las variables y parámetros que van a estar presentes a
la hora de emplear el modelo matemático propuesto por Syu et. al.

 L : Longitud de la columna (cm).

 dc : Diámetro interno de la columna (cm).
 Vb : Volumen de la columna (cm3).
 Rp : Radio de la partícula (mm).
 tor :
 b : Fracción volumétrica de la parte hueca
 p : Porosidad.
 d : Diámetro de la partícula (Å).
 dp : Diámetro de poro (fijado aproximadamente en 300Å).
 Q : Flujo de alimentación (ml/min).
  : velocidad intersticial (cm/min).
 adim : Tiempo adimensional.
 Mi : Peso molecular del soluto.
 Co : Concentración del soluto en el alimento (mol/L).
 d : Diámetro de la molécula (Å).
  : Relación entre el diámetro molecular del soluto y el diámetro del poro.
 Dm : Difusividad molecular bajo intraparticulas (cm2/min).
 Dp : Difusividad efectiva (cm2/min).
 k : Coeficiente de película de transferencia de masa del soluto (cm/min).
 C∞ : Máxima concentración de saturación durante la adsorción
 Daa : Número de Damköhler para la adsorción.
 Dad : Número de Damköhler para la desorción.
 PeL : Número de Peclet
  : Grupo adimensional.
 Bi : Número de Biot de transferencia de masa.

El diagrama de flujo se dará de la siguiente manera:

Determinar los valores de L, dc,

L, dc
Veo, Ved, Rp, , mediante la
realización del experimento.

Calcular Vb con
Rp,  Veo, Ved Vb=0.25dc2

Vb
2

Calcular b y p con
b, p 1
Ved= Vb * b
Ved= Veo/(1+(1- b)( p /b))
Graficar experimentalmente
Cadim vs. adim.
Cadim= C()/Co
Cadim vs. adim
 = t / L

Encontrar el valor del

área adimensional A

Cambiar el valor de 1
la concentración Co A

Ci∞, b Calcular Ci∞ y b mediante

A=((1- b)(1- p)(( bCi∞)/(1 + b)) + (1- b)p + b) / b

Determinar el Calcular Dm
peso molecular M Dm=2.74*10-5 M-1/3

Calcular d Dm 3
d= 1.44 M1/3

dp
d

Calcular 
 = d / dp 

Calcular Dp
4 Dp Dp = Dm (1 – 2.104 + 2.093 – 0.955) / tor
 2 Calcular k
k = 0.6871/3(b Rp / Dm)-2/3
3

Dad Calcular Dad

Dad = Lk / 

Calcular Daa
Daa
Dad = Daa / bCo

Calcular PeL
PeL
PeL = 0.1L / Rpb

Calcular 
 = pDpL / Rp2 

Calcular Bi
Bi = kRp / pDp Bi

Lo anterior ha de ser un corto diagrama de flujo donde se indican los cálculos

necesarios para el desarrollo del escalado en la cromatografía de afinidad. Una vez
realizado lo anterior (incluyendo su desarrollo experimental, claro está) se procede a
trabajar en el campo piloto o industrial. Para ello, Syu et. al. consideran y suponen que
los parámetros anteriormente calculados deben presentar una variación mínima, tanto
que se puede despreciar, luego a partir de los mismos, se pueden determinar las
variables de diseño para el proceso, tales como las dimensiones de la columna,
volúmenes de trabajo (de la fase móvil, de elución), caudal de entrada del alimento, y
demás. Sin embargo es de vital importancia la excelente ejecución de la parte
experimental o de laboratorio, con el fin que no se presenten graves problemas al
momento de la puesta en marcha del equipo.
 BIBLIOGRAFIA

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