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Vol. 272, No. 45, Edición del 7 de noviembre, pp. 28455-28460, 1997
Impreso en EE.UU.
LA REVISTA DE QUÍMICA B IOLOC,1c L
O 1997 por The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

Estructura del nitrito unido a la nitrito reductasa que contiene cobre

de Hlcaligenes faecalis
IMPLICACIONES MECÁNICAS

(Recibido para su publicación el 22 de julio de 1996 y revisado el 21 de agosto de

1997) Michael E. P. Murphy:I, Stewart Turley y Elinor T. Adrnan§

Del Departamento de Estructura B i o l ó g i c a , Facultad de Medicina, Universidad de Washington,
Seattle, Washington 98195-7420.

pago de los gastos de página. Por lo tanto, este artículo debe llevar la
mención "publicidad", de conformidad con el artículo 1734 del Código
Se han determinado las estructuras de la nitrito de los Estados Unidos, únicamente para indicar este hecho.
reductasa oxidada, reducida, oxidada embebida en nitrito Dirección actual: Department of Biochemistry and Molecular Biol-
y reducida embebida en nitrito de Alcaligeneo /aecaiis a ogy, University of British Columbia, 2146 Health Sciences Mall, Van-
1,8-. couver, V6T 1Z3 British Columbia, Canada.
2,0 A utilizando datos recogidos a - 160 °C. El § A quién debe dirigirse la correspondencia: Department of Bio-
sitio activo a temperatura criogénica, al igual que a logical Structure, Box 357420, School of Medicine, University of Wash-
ington, Seattle, WA 98195-7420. Tel.: 206-543-6589; Fax: 206-543-1524;
temperatura ambiente, contiene un sitio de cobre Correo electrónico: admantâ'u.washington.edu.
tetraédrico de tipo II liado por tres histidinas y una La abreviatura utilizada es: NIR, nitrito reductasa.
molécula de agua. El sitio solvente está vacío cuando los
cristales se reducen con ascorbato. Un nitrito con
coordenadas de oxígeno totalmente ocupado ocupa el
sitio del disolvente en cristales embebidos en nitrito. Los
cristales reducidos con ascorbato embebidos en una
solución de glicerol-meta- nol y nitrito a -40 °C
permanecen incoloros a
-60'C pero se vuelven de color ámbar-marrón
al ser amontonados, lo que sugiere que se libera
NO. El nitrito se encuentra a media ocupación. Cinco
nuevos sitios disolventes en la forma oxidada unida al
nitrito muestran ocupaciones definidas pero diferentes en
las otras tres formas. Estos resultados apoyan un
mecanismo propuesto anteriormente por el cual el nitrito
está unido principalmente por un único átomo de oxígeno
que es protonable, y después de la reducción y escisión de
ese enlace N, el NO se libera dejando el átomo de
oxígeno unido al sitio de Cu como hidróxido o agua.

Las proteínas que contienen cobre son importantes

mediadores de la desnitrificación, la reducción de nitrato y
nitrito a óxido nítrico gaseoso, óxido nitroso y dinitrógeno. La
desnitrificación desempeña un papel importante en la
determinación de la cantidad de nitrógeno biológicamente
disponible en el suelo y en los sistemas acuosos. Algunos de
los productos gaseosos (NO y ONG) son gases de efecto
invernadero o reaccionan con el ozono. La nitrito reductasa
(IEC 1.7.99.3) es la enzima de desnitrificación de cobre mejor
estudiada. La nitrito reductasa que contiene cobre se ha
aislado de la cepa S-6 de Alcaligenes [aecalis (1) y se ha
descubierto que recibe electrones de la pseudoazurina, una
cupredoxina (2). La estructura de la enzima relacionada de
Achromobacter cyclo- clastes (3) reveló que NIR' es un
trímero de subunidades de 37 kDa. El trímero tiene cuatro
sitios azules de cobre de tipo I (ligandos Cys, His, His y Met),
uno enterrado dentro de cada subunidad, y tres sitios
mononucleares de cobre de tipo II (tres ligandos His) que se
encuentran en el

* Este trabajo ha sido financiado por National Institutes of Health

Grant GM31770 (a E. T. A.) y por Medical Research Council Post-
doctoral Fellowship y NSERC research grant (a M. E. P. M.). Los
costes de publicación de este artículo se sufragaron en parte mediante el

subunidad. La investigación de NIRs de cobre de varias
especies ha revelado que el cobre tipo I es el sitio de
transferencia de electrones con pseudoazurina y el cobre tipo II
es el sitio de reducción de nitrito f4 -6). Los estudios de
radiólisis de pulso en NIR de A. cyclo- clastes han demostrado
una constante de velocidad de primer orden para la transferencia
interna de electrones entre el cobre tipo I y tipo II de 1,4 N 103
s°1 (7). El producto primario de la NIR es el óxido nítrico (NO);
sin embargo, la enzima puede producir óxido nitroso (N O) si se
permite la acumulación de óxido nítrico f8).
Muchos organismos utilizan una hemo cd nitrito reductasa en
lugar de la proteína de cobre (9). La estructura de esta NIR de
Thiosphera pantotropha revela una estructura de dos dominios,
con el hemo c unido en un dominio similar al citocromo c, y el
hemo d, unido en un dominio Q-propeller, ligado por una
tirosina del otro dominio (10). En el mecanismo de producción
de NO se propone un intermediario nitrosilo de hierro hemo
(Fe"- NO+I. (11). Se ha propuesto un mecanismo similar para el
NIR de cobre por el que el nitrito se coordina N a un cobre
reducido seguido de proto- nación, deshidratación y producción
de un intermediario nitrosilo de cobre (Cu"- NO*) (8). Se han
caracterizado compuestos modelo de NIR con nitrito tanto N-
coordinado unido a Cu(I) como O-coordinado (12-14) unido a
Cu(I) y Cu(II). La protonación del aducto nitrito del compuesto
CutII unido al N en solución no acuosa da lugar a la producción
de NO (12).
Faltan pruebas directas de los intermediarios del
mecanismo propuesto. Utilizando nitrito marcado
Este documento está disponible en línea en 28455
http://www.jbc.org
Este es un artículo de acceso abierto bajo licencia CC BY.
isotópicamente se puede demostrar que el NIR puede catalizar
la nitrosilación de azida, hidroxilamina y nitrito para producir
óxido nitroso (8, 15). Se demostró que la azida inhibía la
producción de NO y que producía cada vez menos '5 N'5 NO y
pequeñas cantidades de '4 N "NO. Por otro lado, la
hidroxilamina no inhibía la producción de NO y estimulaba la
producción de '4 N "NO, lo que sugiere que era más eficaz
para atrapar una especie de NO ligada. En ambos casos, se
planteó la hipótesis de una especie Cu"-NO*, pero no se
detectó directamente. Cuando el nitrito se une al cobre
oxidado de tipo II en el NIR relacionado de A. xylosoxidans,
la espectroscopia de doble resonancia nuclear de electrones
sugiere que el nitrito desplaza el ligando de agua (16). No se
observa ningún cambio en el espectro de doble resonancia
nuclear de electrones cuando se utiliza '5 N nitrito, por lo que
resulta tentador interpretar la unión al Cu como unida al O,
aunque Howes et al. (16) señalan que un acoplamiento débil
podría impedir esta interpretación (16a. En el sistema del
citocromo cd, el agua marcada conl 'O- puede incorporarse al
nitrito 117); esta observación se interpreta como la
rehidratación de una especie Fe2"-NO". Como señala Averill
(llJ, no se ha observado tal intercambiol 'O en las nitrito
reductasas de cobre, y los experimentos de atrapamiento con
"N'5 N se hicieron con extractos libres de células, donde la NO
reductasa podría haber confundido la interpretación. Al
introducir nitrito en cristales de A. cycloclastes oxidados, NIR
da como resultado un nitrito parcialmente ocupado unido
asimétricamente a través de los átomos de oxígeno 118a. Por
último, la absorción ampliada de rayos X finos
28456 Nitrite Binding fo A. faecalis NIR que contiene cobre
TvsI
Estadísticas de recogida de datos
Cristal Oxidado Reducido Oxidado empapado en Nitrito reducido
nitrito
Dimensiones de la célula o = 61.86, o = 61.79, o - 61.65, o - 62.1,
(À)
b- 102.8, ò = 102.4, b- 102.4, ò = 102.8,
c = 146.3 c - 146.2 c = 146.1 c - 146.3
Resolución (A) 2.0 (2.25-2.0)° 2.0 (2.25-2.0) 1.8 (2.0-1.8) 1.85 (2.0-1.85)
R -merge 0.082 (0.136) 0.068 (0.165) 0.054 (0.108) 0.049 (0.262)
{I)/(o-(I))' 9.0 (3.4) 9.4 (3.1) 13.6 (3.9) 9.9 (2.6)
Integridad 0.74 (0.45) 0.82 (0.59) 0.81 (0.44) 0.83 (0.70)
Reflexiones únicas 46591 (8200) 51866 (10841) 70076 (10128) 67706 (7173)
Redundancia 2.0 (1.2) 3.4 (2.0) 2.9 (1.5) 2.3 (1.7)
° Los valores entre paréntesis corresponden a la carcasa de mayor resolución.
Cuando se escalaron conjuntamente, la concordancia entre los conjuntos de datos oxidados y reducidos fue de 0,14; entre oxidados y oxidados con
nitrito, de 0,17; entre oxidados y reducidos más nitrito, de 0,17; y entre oxidados más nitrito y reducidos más nitrito, de 0,19.
' I)/(n(I)) es la intensidad media dividida por el error medio estimado en la intensidad.

R-fusionar -

TnBrE II
Re[ineinent estadísticas
Parámetro Oxidado Reducido Nitrito empapado Nitrito embebido
oxidado reducido
Rango de resolución (A) 10-2.0 10-2.0 10-1.8 10-1.85
Factor R 0.191 0.188 0.181 0.194
Desviaciones cuadráticas medias:
Longitud de enlace (A) 0.011 0.006 0.010 0.010
Ángulos de enlace (°) 1.7 1.5 1.7 1.8
Factor B (mc, se)° (A') 16.1, 17.4 19.0, 20.8 17.1, 19.1 176, 19.2
Factor B medio del disolvente (A') 21.8 31.4 27.6 28.6
Cobre tipo 1 Factor B (A") 16.4 21.2 18.3 18.8
Cobre de tipo 2 Factor B (À') 15.2 18.7 16.4 15.T
Nº de reflejos 45995 51276 69446 67171
Nº de átomos de disolvente 498 667 794 723
Código de entrada del Banco de Datos 1AS7 1AQ8 1AS6 1AS8
de Proteínas
° mc, sc son promedios sobre los átomos de la cadena principal y de la cadena lateral, respectivamente.

depósito recién preparada más 10 mM de ascorbato. Antes de la congelación

Los experimentos de estructura en A. xylosoxidans NIR
muestran nitrito unido a O 119).
Para comprender el modo productivo de ligación del nitrito al
cobre del sitio activo, presentamos aquí estructuras de alta
resolución de la RIN de A. [aecalis tanto en estado reducido
como oxidado, en presencia y ausencia de nitrito, para
determinar cómo influye la estructura de la proteína en el modo
de ligación del nitrito.
criogénica, cada solución de remojo se llevó por etapas a 309c de glicerol
durante 30 minutos.
Los cristales reducidos a temperatura ambiente hasta incoloros se
trans-
ferido en solución de reserva más 30'fo de glicerol, 309c de metanol, 10 mv
de ascorbato y 50 mM de nitrito enfriada a -40 °C utilizando un baño de
hielo seco de metanol. Esta solución permanece líquida a -40 °C y actúa
como protector criogénico para la congelación. Los cristales se dejaron en
remojo durante 30-45

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Preparación de cristales y recogida de datos-Recombinante A. [aeca-
/is NIR se expresó en Escherichia coli y se purificó como se describe en
otro lugar (20). Los cristales verdes se obtuvieron utilizando el método de
la gota colgante con una solución reservorio que contenía 10'fo de
polietilenglicol 4000 y 0,1 u de acetato sódico, pH 4,0 -4,8 (21). Todos los
cristales utilizados en este estudio están en el grupo espacial P2,2,2, y son
isomorfos. Los datos se recogieron a 160 °C utilizando cristales de cuatro
condiciones diferentes: oxidados al aire, reducidos en ascorbato,
embebidos en nitrito, y reducidos en ascorbato y luego embebidos en
nitrito a baja temperatura.
Los cristales oxidados se sumergieron en una solución de reserva
recién preparada. Los cristales reducidos se prepararon sumergiéndolos en
una solución de reserva recién preparada más 10 mM de ascorbato. Los
cristales pasaron de verdes a incoloros en 1 h. De forma similar, los
cristales oxidados empapados en nitrito se obtuvieron empapándolos en
una solución de depósito recién preparada más 1 mv de nitrito durante 1 h.
Los cristales empapados durante periodos de tiempo más largos se
volvieron ocasionalmente de color ámbar-marrón, presumiblemente por la
lenta descomposición del ni- trito en NO y otros óxidos de nitrógeno que
pueden interactuar con el cromóforo de tipo I. Antes de la congelación
criogénica, los cristales reducidos se empaparon en una solución de
min y permanecieron incoloros. Estos Nitrite Binding
cristales fo A. faecalis
se transfirieron NIR que contiene cobre 28457
rápidamente al extremo de una corriente de aire a -40 °C para permitir
el transporte del cristal desde el baño de aguanieve a una corriente
criogénica a - 160 °C N. Una vez congelados, los cristales eran de color
ámbar tenue. Una vez congelados, los cristales eran de un tenue color
ámbar. No fue posible llevar a cabo la reacción inversa (es decir, reducir
los cristales empapados en nitrito con ascorbato a
-40 °C) ni fue posible reducir los cristales en absoluto a -40 °C.
Se utilizó un sistema de placa de imagen Rigaku R-AXIS He para
recoger datos de difracción de rayos X de cada uno de los cuatro cristales
crio-refrigerados. La radiación de cobre K se produjo a partir de un
generador de ánodo giratorio operado a 50 kV y 100 mA y se enfocó con
espejos. Los datos de los cristales embebidos en nitrito reducido se
procesaron con el programa DENZO (22). Todos los demás conjuntos de
datos se procesaron con el software proporcionado por el fabricante
(23). Los detalles de cada recogida de datos se resumen en la Tabla I.
Solución de la estructura y fie/inemerit-Cada uno de los cristales de
los cuatro conjuntos de datos es isomorfo con los cristales de la
estructura refinada original de 2,0 A de resolución (24) y contiene el
trímero NIR en la unidad asimétrica. Esta estructura se utilizó como
punto de partida para el refinamiento de los datos empapados de nitrito
oxidado de mayor resolución (1,8 A). Una porción seleccionada al azar
(89o) de los datos se reservó para el cálculo del factor R libre (25). El
refinamiento se llevó a cabo con el programa X- PLOR (26) utilizando
el conjunto de parámetros parhcsdx.pro (27). En las etapas finales, se
incluyeron todos los datos en el refinamiento. La geometría del cobre,
incluida la posición relativa de las moléculas de nitrito, no se refinó.
Los factores B se refinaron utilizando datos desde 5 A hasta el límite de
resolución (Tabla II) para 25-40 pasos por ciclo de refinamiento. El
ajuste manual y el modelado se realizaron con el programa O (28). Los
disolventes adicionales se identificaron buscando picos en los mapas F,-
F, utilizando el conjunto de programas CCP4 (29).
El modelo refinado de los cristales impregnados de nitrito (a partir de
los datos con la resolución más alta) se utilizó como punto de partida
para los otros tres conjuntos de datos: oxidados, reducidos y reducidos
impregnados de nitrito. Se aplicaron los mismos métodos de
refinamiento a cada uno de ellos. En la Tabla II se presentan las
estadísticas finales de refinamiento para las cuatro estructuras.
28458 Nitrite Binding fo A. faecalis NIR que contiene cobre

A C

NO2-

Fle. 1. Sitios activos de NIR oxidado

(A), reducido (Zi), empapado de
nitrito (C) y reducido empapado de
nitrito (D). Los tres ligandos de cobre
histidina tipo II y los residuos activos
Asp-98, His-255 y He- 257 están
dibujados como bolas y palos. El agua
del sitio activo, el átomo de cobre y la
molécula de agua que une Asp-98 e His-
255 están representados por esferas B D
grandes. El agua del sitio activo o los
mapas de diferencia de omisión de nitrito
(F,-F,) están contorneados a 4 o. La figura se
creó utilizando Molscript (31) y Min- image
(32).

TnecE III
RESULTA Geometría del ligando
DOS metálico
La estructura del NIR oxidado a temperatura criogénica es La longitud y los ángulos de enlace son la media de tres
valores.
oxidado reducido
similar a la estructura de mayor resolución a temperatura Parámetro Nitrito empapadoNitrito
empapado oxidado
ambiente de la que se informó anteriormente (24). Los cristales reducido
empapados en nitrito y reducidos de NIR difractaron con una Sitio de cobre de tipo I
resolución superior a 2,0 A, y la calidad general de cada (CuA) Longitud de
enlace del ligando (A)
estructura es similar o mejor que la de la estructura a 2.06 (3) 2.07 (2) 2.09 (2) 2.10 (6)
95N"
temperatura ambiente (24). Para cada estructura 1365* 2.08 (4) 2.19 (5) 2.14 (2) 2.15 (9)
notificados, el factor R convencional es de 199c o superior (Tabla 145N" 1.98 (7) 2.08 (4) 2.00 (8) 2.03 (4)
II).
Másundel
de 909c de los
diagrama de residuos se encuentran
Ramachandran dentro
definido de los límites
por PROCHECK 1505' de enlace del
Ángulos 2.64(5) 2.58 (1) 2.61(6) 2.59 (6)
más favorables. ligando (°)
(30) y muestran una estereoquímica razonable (Tabla II). 95N"-Cu-136S* 133(2) 126(4) 131(1) 127(2)
Aunque las dimensiones de la celda del cristal original son 95N"-Cu-145N" 102(1) 102(4) 106(2) 99(4)
mayores que las de los datos de baja temperatura (63,0 X 103,6 X 1365*-Cu-145N'1 108(3) 104(2) 106(2) 111(1)
136S*-Cu-150S' 101(3) 104(3) 103(1) 106(2)
146,9 A), la compresión de las moléculas en la celda más pequeña
1505'-Cu-145N" 130(6) 132(4) 133(4) 128(2)
da como resultado un desplazamiento de 0,8 A en general, 150S'-Cu-95N" 85(3) 91(1) 86(1) 86(2)
principalmente en la dirección de la mayor diferencia de Yacimiento de cobre de tipo
dimensión de celda. Hay un tramo corto II (CuB)
Longitud de enlace del
ligando (A)

empaquetamiento. Curiosamente, este bucle se empaqueta
contra los residuos 228-232 de la cadena A de una molécula
relacionada con la simetría y contra los residuos 51-55 de esa
molécula. Sin embargo, la conformación de este bucle en las
cadenas A y B sigue siendo la misma que en la estructura a
temperatura ambiente. Los valores B de la estructura a
temperatura ambiente (entrada 2afn del PDB) son, por término
medio, los siguientes
edad 6 A2 superior para los átomos de la cadena principal, 7 A2
superior para la cadena lateral
y 6-8 A2 para los átomos de cobre. Los valores del disolvente B son
casi l5 A2 superiores.
Nnt oxidado y reducido-El sitio activo de NIR está situado en
la interfaz entre dos dominios. El cobre de tipo II en el sitio
activo de la NIR oxidada tiene una geometría tetraédrica casi
perfecta (Fig. 1 A, Tabla III). Tres residuos de histidina
proporcionan tres ligandos a través de los átomos N' de los
anillos de imidazol. El cuarto
de los residuos 228-232 de la cadena C que, mediante pequeños 100N'° 1.91(7) 1.94(4) 1.91(5) 1.92(8)
ajustes-
mentos en los ángulos conformacionales y mayores rotaciones de 135N°" 2.07 (11) 2.01 (8) 2.02 (5) 2.01 (13)
las cadenas laterales,
se desplaza
5030(O2)unos 3 A. Este bucle corto Nitrite Binding
comprende unafo A. faecalis
pequeña NIR306N'°
que contiene cobre2.09 (3) 2.06 (2) 2.15 (3) 28459
2.11(1)
Ángulos de enlace del ligando (°) 503O(O1) 2.00 (23) 2.3 (1) 2.4 (2)
protuberancia helicoidal y simplemente se enrolla hacia un lado para 2.2 (1) 2.3 (2)
100N'"-Cu-135N'"
acomodar el más apretado 99 (3) 108 (1) 99 (3) 106 (1)
100N'°-Cu-306N' °99 (2) 106 (4) 104 (2) 105 (3)
135N°°-Cu-306N*°111 (2) 125 (3) 125 (3)
122 (3)
100N'"-Cu-5030 (01,02) 148 (11) 15, 893 (1) 15, 490 (6)
135N'°-Cu-5030 (O1,O2) 97 (8) 90, 127 (3) 87, 123 (4)
306N'"-Cu-5030 (01,02) 99 (8) 87, 102 (3) 85, 105 (6)

ligando es un oxígeno procedente del agua o de un ion hidroxilo.

Dos de estas histidinas (His-100 e His-135a son del dominio 1, e
His-306 es del dominio 2 de otro monómero del trímero. Las tres
histidinas están situadas en residuos de la lámina JS que forman
parte integral del pliegue conservado Q-barrel de cada dominio
(33). Los grupos imidazol forman enlaces de hidrógeno con el
resto de
28460 Nitrite Binding fo A. faecalis NIR que contiene cobre

OC nc

B A157 M3O6
H3Oti H I3 5
Ol .

HI00 H10O ..@ ' Ll06

L106 H2S5

B D
M150
JH 5

H I3 5 5137
H306

D98
' Ll06
e
Flu. 2. Localización de los sitios solventes en la forma oxidada (oc) (A), reducida (re) (ft), empapada en nitrito (ric) (C) y reducida empapada en
nitrito (D) NIR (nrc). A, B, C, D y E son cinco sitios que se encuentran en la forma oxidada impregnada de nitrito. C es común a los cuatro, y A y
E son exclusivos de la forma oxidada embebida en nitrito, mientras que sólo los sitios B y C están en la forma oxidada, y sólo C y D están en las
formas reducida y reducida embebida en nitrito. La figura se creó utilizando Molscript (31) y Raster3D (35).

ajustarse a la densidad de electrones sustituyendo el ligando

la estructura de la proteína a través de los átomos N'. His-135 e
disolvente del sitio activo de forma que el cobre permanezca
His-306 están unidos por hidrógeno a los carbonilos de la cadena
coordinado con el oxígeno. El nitrito nitro-
principal de Cys-136 e His-306, respectivamente. His-100 forma
un puente salino con el carboxilato de cadena lateral de Glu-279.
El ligando de cobre disolvente está unido por hidrógeno a la
cadena lateral de Asp-98, que a su vez forma un enlace de
hidrógeno con puente de agua con la cadena lateral His-255. El
acceso al sitio de cobre en la posición del ligando disolvente está
limitado estéricamente por He-257, que se encuentra a 3,3 A del
ligando de oxígeno.
Los cristales de NIR reducidos con ascorbato son incoloros, lo
que indica que el sitio de cobre de tipo I está reducido a CutI). La
inspección de la estructura de rayos X de estos cristales
reducidos revela que el ligando solvente de cobre del sitio activo
ya no está presente (Fig. 1B, y Tabla III). La conformación de
otros ligandos no cambia respecto a la estructura oxidada,
resultando un sitio de cobre tetraédrico tricoordinado. La
conformación de los residuos Asp-98 e His-255 no se ve
perturbada por la ausencia del ligando disolvente. En dos de las
tres subunidades C'l de He-257 puede estar menos ordenada,
adoptando una conformación en la que se acerca más al cobre.
Aunque los mapas de diferencias entre los datos oxidados y
reducidos mostraron desplazamientos en las posiciones de los
átomos en el sitio de tipo I, en consonancia con las diferencias
observadas entre las formas oxidadas y reducidas de la
pseudoazurina (34), los desplazamientos son bastante
pequeños (Tabla III). Las diferencias en los valores B y la
menor resolución impiden un análisis detallado de los
desplazamientos.
Nitrito empapado Nnt oxidado y reducido-El entorno alrededor
del cobre del sitio activo de los cristales empapados de nitrito se
representa en las Figs. 1C y 2C. Una molécula de nitrito puede
 Nitrite Binding
gen se encuentra en un ángulo aproximado fo A. al
de 45° respecto faecalis NIR que contiene cobre 28461
plano definido por los oxígenos de cobre y nitrito y está
estrechamente empaquetado contra la cadena lateral de 11e-
257. Los intentos de ajustar el nitrito en un modo de
coordenada N fracasaron debido a un mal ajuste a la densidad
y a un choque estérico con 11e-257. El nitrito 02 forma un
enlace de hidrógeno con Asp-98 O" (3,0 A), que se aproxima
al oxígeno desde el lado opuesto del plano Cu-O al nitrito N.
El otro oxígeno del nitrito, 01, está unido por enlace de
hidrógeno a dos moléculas de agua. El factor B cristalográfico
medio de la cadena lateral de Asp-98 es de 15 A" en los
cristales impregnados de nitrito, comparado con 20 A" para los
cristales reducidos y oxidados, lo que indica que este residuo
está más ordenado en presencia de nitrito. Las conformaciones
de His-255 y He- 257 no cambian en presencia de nitrito.
La diferencia más notable, además del nitrito, es la presencia
de cinco moléculas de disolvente en las proximidades del
nitrito, el cobre y Asp-98 (Fig. 2). Sólo dos de ellas están
presentes en la estructura oxidada, y un par diferente está
presente en la estructura reducida. La presencia de estas
moléculas de disolvente también es coherente con un Asp-98
más ordenado.
Los cristales reducidos embebidos en 10 mM de nitrito
permanecieron incoloros a menos que se dejaran calentar a
temperatura ambiente, tras lo cual los cristales se volvieron de
color marrón ámbar. Los datos se obtuvieron de un cristal
ligeramente coloreado a - 160 °C. La densidad diferencial
muestra el nitrito unido en una orientación similar a la
encontrada en la estructura empapada de nitrito oxidado. La
densidad de diferencia no es tan fuerte como en la estructura
oxidada, lo que sugiere que el sitio de unión del nitrito no está
totalmente ocupado en estos cristales (Fig. lD). De nuevo hay
menos disolvente ordenado cerca de Asp-98, y el valor medio
de B para Asp-98 es de 17 A", intermedio entre las formas
oxidada y embebida en nitrito.
28462 Nitrite Binding fo A. faecalis NIR que contiene cobre
DEBATE 0
C Asp98
Evidencia de la unión de la coordenada O del nitrito al tipo
oxidado 0
II de la nitrito reductasa se ha observado crísta1lo- gráficamente
para A. cycloclastes (18) y por doble resonancia nuclear de
electrones y espectroscopia de estructura fina de absorción de
2+
rayos X extendida para A. xylosoxidans (16, 19). El presente Cu
trabajo difiere de la estructura NIR d e A . cycloclastes, en que el
nitrito está doblado de tal manera que el nitrógeno apunta lejos
de Asp-98 en lugar de hacia Asp-98. Esta diferencia se debe N0 0
probablemente a la estructura parcial de la estructura NIR de A. 0
C AS D 9 0
C Asp98
cycloclastes. Esta diferencia se debe probablemente a la
ocupación parcial del nitrito en la estructura NIR de A. 0
cycloclastes, que limita la precisión de la orientación del nitrito.
La densidad de electrones para el nitrito unido al NIR reducido es
también más débil que la estructura oxidada. Las distancias Cu-O
encontradas en este estudio (Tabla
III) son intermedias entre las encontradas en un complejo modelo dinitrito- N
O-O' FIO-
q*, O O
0- NO;
donde las distancias axiales Cu-O son 2,5 A y
las distancias Cu-O basales son de 2,0 A (37), y las encontradas en a |"
complejo mono-nitrito, donde las distancias Cu-O son 2,2 y 2,0 CU Cu
A (14). Las otras dimensiones de los sitios de cobre ITabla III) son
en razonable concordancia con los hallados en nuestros estudios anteriores
H+
y los de la estructura fina de absorción de rayos X extendida en el
A. xylosoxidans NIR (19). c Asp98 " C Como p 98

Un intento de modelar un nitrito de coordenada N en el mismo lugar

que el nitrito de coordenada O fracasó. No sólo hay p.
choques estéricos con la cadena lateral 11e-257, pero los mapas */ -
de diferencias calculados después de refinar el nitrito de 0 0 0 0
coordenadas N muestran resultados negativos.
densidad en las posiciones de oxígeno y densidad positiva donde Cu "* Cu
deberían estar situados los oxígenos. La restricción de espacio y Fle. 3. Un mecanismo propuesto para el nitrito que contiene cobre
el enlace de hidrógeno estabi- lizante con el carboxilato de Asp- reductasa. La enzima nativa (centro izquierda) se representa con un
98 probablemente limitan la densidad de los oxígenos.
nitrito al modo O-coordinado. Restringir elvol- ionsitio activo cobre y Asp-98 se protonan.del ligando unido al sitio
activo puede ser ventajoso. El nitrito desplaza al hidroxilo (arriba a la derecha), seguido de la
reducción del ligando.
al limitar el acceso a los no sustratos más grandes, como el cobre (bottorri derecha). El nitrito se descompone tras la reducción y
protona-
nitrato. tión para dar un intermediario con hidroxilo y NO unido transitoriamente
Apoyo a la propuesta Dec/ianismo-El modo vinculante de ' al cobre. La enzima nativa se restablece cuando sale el NO. El NO puede
trito al sitio cúprico de A. cycloclastes NIR sugirió un pos-reenlace al cobre, desplazando al hidroxilo (arriba a la izquierda) como posible
primer paso en
sible para la reducción y deshidratación del nitrito (18). Como la producción
de N,O. se muestra en la Fig. 3, hipotetizamos (a) que el nitrito desplaza un
agua (o hidroxilo) unido al cobre y enlaces de hidrógeno a El nitrito unido al cobre reducido probablemente representa un
Asp-98; (b) que el protón en este enlace de hidrógeno promedio de intermedios no unidos, unidos a nitrito o quizás
permanece con Asp-98 hasta que el nitrito se reduce a través unidos a otros metales en la ruta de reacción. No obstante, la
del cobre; (c) que el enlace N-O en ese oxígeno se rompe; y densidad de electrones observada y la posición de 11e-257
id) que el NO se libera, restaurando el sitio activo. En este excluyen la posibilidad de que el nitrito con coordenadas N esté
esquema propuesto, el nitrito oxidado unido predominantemente al cobre reducido.
enzima se encuentra en un estado de protonación intermedio, en el que la enzima. Los datos estructurales combinados apoyan un
mecanismo
protón puede residir formalmente en el agua (18) o Asp-98 donde el nitrito se une a un sitio oxidado de tipo II que es entonces (Fig.
3), dependiendo de cómo el sitio de cobre de tipo II modula la reducida por transferencia de electrones desde el sitio de tipo I. Tal
modelo
pl, de los ligandos ligados. A un pH más bajo, es posible que tanto el puede explicar la necesidad de dos sitios de cobre enlazados en
NIR a cobre hidroxilo y Asp-98 se protonan. A un pH más alto, lograr una reacción de un solo electrón.
tanto el disolvente (o nitrito) como Asp-98 podrían estar desprotonados y Vol sent Structure at the Active Sife-There are five solvent
negatively charged. Estos estados de protonación alternativos (etiquetados como A, B, C, D y E en la Fig. 2, arriba a la derecha1 )
pueden explicar la curva de dependencia del pH en forma de campana observada para NIR en los cristales empapados de nitrito
oxidado (Fig. 2, nc) además de
(1). el sitio unido al cobre en la enzima nativa oxidada. El sitio C se
encuentra en las cuatro estructuras; A y E son exclusivos de la enzima nativa oxidada y sugieren características adicionales. El
sitio C se encuentra en las cuatro estructuras; A y E son exclusivos del mecanismo esbozado oxidado y sugieren características
adicionales. La forma ni- D está ocupado sólo en las formas oxidadas unidas a nitrito o
empapadas de nitrito, y B está ocupado sólo en las formas oxidadas asimétricas a nitrito. formas reducidas; y B está
 Nitrite Binding fo A. faecalis NIR que contiene cobre 28463A
ocupada sólo en las formas oxidadas.
métricamente O se coordinan con el cobre formando un enlace de hidrógeno se muestra un patrón de enlace de hidrógeno plausible para
estos sitios.
a la cadena lateral de Asp-98. El nitrito se dobla lejos de Asp-98, lo que puede facilitar la transferencia de protones
desde este residuo. mecanismo. En la enzima oxidada (Fig. 2, oc), el sitio activo
al nitrito oxígeno (O2J ligado al cobre. El otro El otro disolvente se muestra protonado y unido por
hidrógeno al Asp-98. El oxígeno nitrito (01) está interactuando de forma laxa con el cobre y el O2J. Los sitios
A y E, que se unen directamente al nitrito mediante enlaces de hidrógeno, pueden permitir que el producto de óxido nítrico
abandone fácilmente el met£tl. facilitar la reacción de dos maneras: ambos sitios pueden sitio
de hidrógeno. En la estructura oxidada, el nitrito parece estar preparado para un En la estructura oxidada, el nitrito
parece estar preparado para un enlace de hidrógeno con el nitrito O1, manteniendo su orientación, y E puede llevar a cabo una
reacción concertada de transferencia de electrones y protonación. En el caso del cobre reducido, el nitrito parece unirse en el
sitio del nitrito. el nitrito. El sitio D, a su vez, ayuda a posicionar el sitio E. Todo
esto el mismo sitio, pero más débilmente flor ocupación) y con menos puede ayudar a dirigir el producto a una región
hidrofóbica por encima de disolvente ordenado cerca de Asp-98 que se encuentra en la forma oxidada. His-255
que está desprovista de disolvente y a modificar la reducción La pérdida del átomo de disolvente en el ascorbato reducido NIR
del nitrito para facilitar la transferencia de electrones. El papel
de la estructura sugiere que el cobre reducido tiene una menor afinidad His-255 y el disolvente entre éste y Asp-98 es
asegurar que para los ligandos exógenos, incluido el nitrito. La débil densidad para Asp-98 permanece bien
orientada y disponible para el ligando temporal.
28464 Nitrite Binding fo A. faecalis NIR que contiene cobre
comunes. Muchas de las enzimas de zinc, como la anhidrasa
de un protón. En general, la red de sitios de disolvente con carbónica, catalizan la hidratación o deshidratación de sustratos, al
enlaces de hidrógeno que rodea al nitrito proporciona una fuente igual que la NIR elimina el oxígeno del nitrito en forma de agua.
de protones para la reacción. Debe tenerse en cuenta que los Tanto en la anhidrasa carbónica como en la NIR el
cinco sitios de disolvente representados en la Fig. 2 están
estrechamente limitados por los residuos circundantes. Los sitios
B y C están cerca de Ala-137, parte del bucle más grande (en
relación con la pseudoazurina y otras cupredoxinas) que liga el
cobre de tipo I. La mutación de A1a-137 a un A1a-137
proporciona una fuente de protones para la reacción. Mutar A1a-
137 a un residuo más grande tendría un impacto significativo en
la función, si nuestro esquema es correcto.
Producción de óxido nitroso-La cantidad de óxido nitroso
producida por NIR a partir de nitrito aumenta sustancialmente
cuando los niveles de óxido nítrico son altos y no es detectable si
se elimina el óxido nítrico (15). Los resultados de la incubación
del NIR de cobre con '5 NOJ y "NO, y que produce un isótopo
mixto Nz y se han interpretado como la formación de un nitrosilo
de cobre (Cu"-NO") que luego reacciona con un segundo nitrito
(8). Suponiendo que estos estudios isotópicos en extractos
celulares reflejen realmente la actividad NIR (11) y no la
actividad NO reductasa endógena, pueden reinterpretarse a la luz
de nuestros resultados actuales. Nuestro esquema propuesto para
la producción de NO no incluye un intermediario nitrosilo de
cobre N-coordinado. Sin embargo, puede formarse un nitrosilo de
cobre por un mecanismo de rebote (8) de manera que el óxido
nítrico liberado desplace al ligando disolvente (Fig. 2), o puede
ser que el NO permanezca cerca del sitio activo de manera que
cuando se reduzca otro nitrito, esa especie reaccione con él para
producir la ONG observada sin tener que invocar una especie N-
coordinada.
Estructuras relacionadas-Se han sintetizado y caracterizado
modelos biomiméticos de NO y nitrito unidos al cobre. Se ha
preparado un modelo de Cu(II) coordinado con nitrito con tres
ligandos t-butilpirazol en una disposición trigonal bipiramidal
distorsionada. En este complejo, el nitrito tiene una coordinación
asimétrica 0- (Cu-O = 1,975 y 2,169 A) pero no se ha demostrado
que produzca NO (14). Un complejo Cu(I) similar con ligandos I-
butilpirazo1 y NO es N-coordinado con una distancia Cu-N de
1,759 A y un ángulo Cu-N-O de 163° (36). Más recientemente, se
ha caracterizado un complejo de nitrito CutII que utiliza tri-
isopropiltriazaciclonano para proporcionar ligandos N li- en el
que el nitrito está N-coordinado al cobre (Cu-N = 1,903 A) y que
cede cuantitativamente NO tras la adición de ácidos próticos
(12a. Estos modelos biomiméticos proporcionan precedencia sólo
para la unión productiva de nitrito de coordenada N al cobre
reducido pero no excluyen un posible mecanismo de coordenada
O en NIR. Además, aunque no hay precedentes de la unión de
NO al cobre con coordenadas O, el mecanismo propuesto no
requiere que el NO sea un ligando estable del cobre.
Como se ha señalado anteriormente (19), las características
estructurales del sitio de tipo II de la NIR son paralelas a las de la
enzima de zinc anhidrasa carbónica, aunque en general el sitio
activo de la NIR está mucho menos abierto al disolvente. Un zinc
coordinado por un átomo de disolvente cerca de un grupo de
abstracción de protones, ya sea un carboxilato o un grupo
hidroxilo (38), es típico de muchas enzimas de zinc. La
lateralidad de este sitio definido por el grupo de abstracción de
protones y el sitio de unión del sustrato también se conserva.
Todas estas características estructurales se observan en NIR, con
Asp-98 como abstractor de protones. En la astacina, un miembro
de la familia de las proteinasas de metzincina que presenta estas
características estructurales, el zinc puede sustituirse por cobre,
conservando la actividad 37'fo utilizando un sustrato sintético
139).
Las sorprendentes características estructurales comunes de las
enzimas de zinc con la NIR y la capacidad del cobre para
sustituir al zinc en la astacina sugieren que los mecanismos de
estas metaloenzimas también pueden compartir características
 Nitrite Binding fo A. faecalis NIR que contiene cobre
distancia y unido por hidrógeno al abstractor de protones, y el
otro con una distancia mayor. A continuación, el sustrato se
descompone, dejando un ion hidroxilo unido al metal unido por
hidrógeno al grupo abstractor de protones.
El modo de unión del nitrito en la estructura de 2,8 A a
temperatura ambiente del nitrito unido a la nitrito reductasa de
A. xylosoxidans
(40) es consistente con nuestros resultados, aunque ellos
informan de una distancia nitrito Ol-Cu más corta y también
proponen un intermediario unido a N con el que no estamos
de acuerdo.
Agradecimientos: Mutsuko Kukimoto y Makoto Nishiyama, del
Departamento de Biotecnología de la Universidad de Tokio (Japón),
fueron muy amables al proporcionarnos el NIR recombinante de A.
faecalis.
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