UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA “LA MOLINA”

FACULTAD DE CIENCIAS

INFORME N° 2 DE LABORATORIO DE GENÉTICA  

INTEGRANTES :
● Norma Barbaggelata Chalco 20141011
● Jordan Riofano Chamorro 20141029
● Jorge Zavala 20150147
● José Cordero Flores 20141017
● Susana Castro Villareal 20141015

PROFESOR :

Roberto Mansilla Samaniego

Ciclo 2020 II
1.- Un fago de ADN de cadena sencilla tiene unas relaciones de bases:
A/T=0.33 (1) , G/C=2 (2) , (A+T)/(G+C)=1.33 (3)

a. ¿Cuál es la relación (A+G)/(T+C) en esta molécula?

a.​ ¿​ Cuál es la relación (A+G)/(T+C) en esta molécula?

b. Si se pudiese sintetizar la cadena complementaria. ¿Cuáles serían estas

​

relaciones en la cadena complementaria?

c.​ ¿Cuáles son estas relaciones si se consideran las cadenas juntas?

​
Por la Regla de Chargaff se tiene las siguientes relaciones:

La última relación se obtiene reemplazando las relaciones entre la cadena original y la

complementaria:

2.- Se desea expresar la proteína eucariota Shv en E. coli. Se indica la secuencia del
cDNA del shv. El codón de iniciación corresponde al primer ATG. El cDNA presenta
dos dianas EcoRI (GAATTC) en los extremos (subrayados).

GAATTC​AAGCCAAGCTAACTTACACATGCAC (428 codones) TGATAGTA​GAATTC

Disponemos de tres plásmidos pOR F1, pORF2 y pORF3, idénticos exceptos en el
número de pares de bases que presentan entre el codón de iniciación (ATG) y la
diana EcoRI. A continuación se indican las secuencias desde antes del sitio de unión
al ribosoma hasta la secuencia stop.

RBS fMet Stop

----------------------------- -----
pORF1: ATCCTAGGAGTCACGCGATGGC​GAATTC​GGGGTAG
pORF2: ATCCTAGGAGTCACGCGATGGGC​GAATTC​GGGTAG
pORF3: ATCCTAGGAGTCACGCGATGGGGC​GAATTC​GGTAG
¿En que plásmido deberíamos clonar el cDNA para que se produzca la expresión de
Shv? ¿Cómo se podría clonar en fase en ORF3?

Para que se produzca la expresión del plásmido Shv, primero debemos reconocer el codón
de inicio de la cadena:

GAATTC​AAGCCAAGCTAACTTACAC​ATG​CAC (428 codones) TGATAGTA​GAATTC

La enzima de restricción EcoR1 reconoce y corta en (G↓AATTC) quedando en la cadena 8

tripletes antes del codón de inicio, por lo tanto el plásmido en donde deberiamos clonar el
cDNA para que se produzca la expresión de Shv deberá tener luego del codón de inicio
hasta donde se produzca el corte un n{úmero bases nitrogenadas múltiplos de 3, para que
la cadena Shv pueda expresarse sin ninguna alteración.

La única cadena que cumple con esta condición es la pORF 1:

pORF1: ATCCTAGGAGTCACGCG-ATG-GC​G↓AATTC​GGGGTAG

¿Cómo se podría clonar en fase pORF3?

Se podría clonar en esta fase si la cadena Shv contara con una base nitrogenada extra
antes del codón de inicio ATG, solo asi no se alteraría la expresión del plásmido.

3.- Dibuje el mapa de restricción del plásmido al que corresponden los siguientes
datos:

Enzima(s) utilizada(s) Fragmentos obtenidos(en pares de bases)

HindIII 400, 1125

EcoRI 325, 1200

BamHI 1525

HindIII​ + ​EcoRI 250, 325,400, 550

HindIII​ + ​BamHI 400, 500,625

BamHI​ + ​EcoRI 50, ​325,1150

4.- Un fragmento de DNA se secuenció por el método de los dideoxi, parte del
gel de secuenciación se muestra en la figura. Deducir la secuencia del DNA de
esta región poniendo las dos bandas con su polaridad correspondiente.
¿Cuántas fases de lectura abierta hay en esa región? (UAA, UAG y UGA son
codones de terminación).
Del gráfico se determinó:

ADN
3’ 5’ (1)
AGATTTGAAGGTCCCTAGTGGTTAGCTT
5’ 3’ (2)
TCTAAACTTCCAGGGATCACCAATCGAA
ARN
(1)
3’ 5’
AGAUUUGAAGGUCCCUAGUGGUUAGCUU
(2)
5’ 3’
UCUAAACUUCCAGGGAUCACCAAUCGAA

Existen por lo menos dos fases de lecturas en cada hebra de ARN formada a partir de la
cadena de ADN. En la (1), existen la terminación UGA y UAG, y en la (2) la terminación
UAA y UAG, cada uno leídos de 3’ a 5’.
El método de los dideoxi se basa en el empleo de nucleótidos dideoxi, denominados así
debido a que en su azúcar desoxirribosa ha habido un intercambio del grupo oxidrilo del
carbono 3' por un hidrógeno. Dicho hidrógeno no puede ser utilizado por la enzima ADN
polimerasa para ligar el siguiente nucleótido ​y, ​consecuentemente, el fragmento generado
en su último nucleótido al dideoxi.

El experimento se lleva a cabo en 4 tubos de reacción que contiene todos los reactivos
necesarios para la síntesis de ADN, con excepción de que un tipo de nucleótido normal
determinado es reemplazado por su nucleótido dideoxi.

Al final de la operación se obtendrá en cada tubo múltiples fragmentos de distintos

tamaños, los cuales tendrán como común denominador el último nucleótido adicionado
inicialmente al medio.

Finalmente se obtendrá en cada tubo múltiples fragmentos de distintos tamaños, los cuales
tendrán como común denominador el último nucleótido adicionado inicialmente al medio.

Los fragmentos originados en cada tubo son separados por electroforesis en un gel de
poliacrilamida, el cual está señalado en el problema. Leyendo la electroforesis de arriba
hacia abajo, la secuencia obtenida es:

3'AGATTTGAAGGTCCCTAGTGGTTAGCTT 5'

La dirección está dada a partir del principio de que la polimerasa sintetiza en dirección de
5'→3' y los fragmenta recorren una distancia en el gel con una relación inversa a su peso
molecular. Por lo tanto, los fragmentos conteniendo al cebador y al primer nucleótido 5' se
encontrarán en la parte inferior del gel.

Las fases de lectura se definen como aquellas secuencias que poseen un codón de inicio y
uno de final, ambos en fase, Como los codones están dados en la dirección 5'→3' Se
deberá de leer la secuencia de derecha a izquierda y tratar de ubicar codones de inicio y
final que se encuentren en fase.

Los codones pintados representan los codones finales que se pueden localizar en el
fragmento de ADN. Sin embargo, no se puede identificar al codón de iniciación ATG, por lo
que se concluye que el fragmento no posee fases de lectura.

5.- Se ha realizado un ensayo de helicasa con los sustratos indicados en las

figuras, en los que el fragmento corto de DNA está marcado con 32P. La figura
de la derecha muestra el mismo sustrato linearizado. Como control las
muestras se hirvieron (boiled). En las autorradiografías de los geles de
agarosa se analizan los productos de las reacciones indicadas. Interpreta los
resultados. ¿Qué conclusiones se pueden sacar?
La helicasa es una enzima muy importante para las células , se encarga de desnaturalizar el
ADN por medio de la ruptura de sus puentes de hidrógeno convirtiéndolo en simples hebras,
lo cual es importante en las células para que puedan actuar otras enzimas para la síntesis
de ADN. E hacer hervir (boiled) cumple la función de desnaturalización de la molécula de
ADN El fragmento corto de 200 pb está marcado radiactivamente y este hibridiza al DNA
circular de cadena simple en una determinada región, luego de ser sometidos a diferentes
factores estas cadenas hibridadas, dependiendo de los factores a los cuales se han
sometido, tienden a permanecer de doble hélice o cambiar a ser de simple hélice.
Observando el gel de electroforesis y considerando (+) cuando el respectivo factor fue
utilizado y (-) cuando no lo fue, podemos ver:

❏ En el primer carril de la izquierda al no aplicar ningún factor la sonda marcada ha

permanecido unida al ADN de simple hebra.

❏ En el segundo carril podemos ver que solamente se ha aplicado ADN helicasa, la

cual no ha podido realizar su actividad catalítica de romper los puentes de hidrógeno
y se muestra el fragmento de forma similar que en el primer carril.

❏ En el tercer carril, podemos ver que se ha aplicado solamente ATP, el cual solo
tampoco ha podido separar las hebras de ADN.
❏ En el cuarto carril se han aplicado Helicasa y ATP, los cuales sí consiguieron
separar las hebras de ADN, observándose únicamente la hebra simple marcada
radioactivamente.
 ❏ En el quinto carril la muestra solamente fue hervida, como consecuencia se han roto
los puentes de hidrógeno y en el gel se muestra el pequeño fragmento marcado
radioactivamente.

En consecuencia de este experimento podemos deducir que la actividad enzimática de la

Helicasa se pierde cuando hay ausencia de ATP. En el segundo gel de electroforesis se han
colocado muestras también del ADN circular de simple hebra, hibridado con el fragmento
marcado radiactivamente y cortados por una enzima de restricción en la zona donde
complementan ambas hebras. Como consecuencia se tiene una molécula de ADN de
simple hebra lineal a la que se le híbrida con dos pequeños fragmentos en sus extremos 5´
y 3´. En dicho gel fueron evaluados los resultado de la aplicación de los mismos tres
factores utilizados en el experimento previo

6.- Las polimerasas eucarióticas pol X, pol Y y pol Z se ensayaron en

cantidades equimoleculares en un sistema ​in vitro con DNA molde con
iniciador y deoxinucleotidos marcados. Los productos de reacción se
analizaron por electroforesis desnaturalizante y se midió la radiactividad
incorporada.
a) Qué se puede concluir acerca de la procesividad y velocidad de
polimerización de las tres polimerasas?
b) Cuando pol Z se une a una proteína, el DNA sintetizado migra menos en la
electroforesis ¿Cuál es esta proteína?

La velocidad con que adicionan nucleótidos, o procesividad, se mide como el número de

nucleótidos incorporados en la unidad de tiempo y es una característica propia de cada
polimerasa.
Cuando una enzima se une y realiza muchas adiciones antes de disociarse el mecanismo
se denomina proceso (Devlin, 2004). Una elevada procesividad hace referencia a la longitud
del polinucleótido sintetizado antes de que la polimerasa termine de actuar por causas
naturales (Brown, 2008). Una enzima con actividad elevada, tal como la polimerasa III, sólo
puede alcanzar una velocidad catalítica óptima si además presenta una elevada
procesividad (Devlin, 2004)

a) En base a los resultados presentados acerca de la actividad de las 3 polimerasas se

puede concluir que el orden de procesividad es, de menor a mayor, Poly , PolZ y PolX. Esto
por el peso molecular de los fragmentos: A de menor peso, y por lo tanto una mayor
migración, una menor procesividad. Con respecto a la velocidad de polimerización
(asumiendo que los 3 ensayos se llevaron a cabo en lapsos de tiempo iguales), el orden
sería de menor a mayor PolX, PolZ y PolY

b) Para que los fragmentos sintetizados por PolZ migren menos éste debe de incrementar
su procesividad (sintetizar fragmentos más largos). Con el objeto de aumentar la
procesividad, los ADN polimerasas replicativas se asocian a proteínas accesorias
denominadas abrazaderas deslizantes, que las mantienen en contacto con la cadena de
ADN en contacto.

7. Se extrae el ADN de todos los miembros de una familia en la que algunos

individuos están afectados por una enfermedad rara autosómica dominante.
Se corta el ADN de todos ellos con una endonucleasa de restricción, se
separan los fragmentos por tamaños, se transfieren a una membrana y se
hibrida con una sonda radiactiva de VNTR. Los resultados obtenidos aparecen
en el siguiente esquema:
¿Cuál de los loci estará ligado a la enfermedad?
En el loci 12 se dará la enfermedad.
Para ello se realizó colocando letras para indicar de quién provenía los genes,a los padres
se le asignó de la siguiente manera: madre A para la corrida superior y a para la corrida
inferior análogamente para el padre de colocó B para la corrida superior y b para la corrida
inferior resultado de ello se obtuvo: aB=3, Ab=3,ab=3 y AB=2 se descarta ab ya que son
recesivos, nos quedarían 3 opciones de los cuáles lo contrataremos con la lectura inferior
del recuadro para lo que se designó nuevamente letras diferentes a la anterior poniendo a la
madre C para la corrida superior y c para la corrida inferior análogamente para el padre se
le puso D para la corrida superior y d para la corrida inferior el resultado fue el siguiente:
cd =5,CD =3,Cd =2 y DC =1 se descarta cd por ser recesivo ahora comparando ambos
resultados con la posición en la cual se repiten el patrón que coincidió en ambos casos fue
AB posicionado en el loci 12.

BIBLIOGRAFÍA

❖ J​ .F. Griffiths et al, Genética , 5ta Edición, España 1995 pág 211
❖ K
​ rebs & Goldstein & Kilpratrick, 2011. Genes - Fundamentos, 2da Edición México

Pág 772, 781

❖ Devlin, Tomas M. 2004. Bioquímica (libro de texto con aplicaciones) Cuarta edición
University Philadelphia, Pennsylvania
❖ Brown, T. 2008. Genomas. 3​ra Edición. Editorial Médica Panamericana. Madrid -
España