CROMATOGRAFA DE AMINOCIDOS

MANCILLA, C. G. E.; CASTREJN, C. R. ROSAS, T. M; BLANCO, E. Z.; y PREZ, S. L. J.;

Q.F.B.; V Semestre: Universidad del Valle de Mxico, Campus Chapultepec
(Av. Constituyentes No. 151 Col. San Miguel Chapultepec. C.P. 11850 Mxico, DF.)

Resumen...1 Introduccin..2 I.- Separacin de molculas por cromatografa.......2 II.-C cromatografa de reparto..3 III. Cromatografa en capa fina..3 IV. Cromatografa de adsorcin.....4 V. Cromatografa de intercambio inico..4 VI. Cromatografa de exclusin molecular8 VII. Reacciones coloreadas de aminocido4 Objetivo......6 Hiptesis....6 Material......6 Procedimiento....6 Resultados7 Discusin de Resultados. ..8 Conclusiones..9 Referencias......9

RESUMEN: En esta prctica se realiz una de las tcnicas ms sencillas para identificacin de aminocidos que fue la combinacin de la cromatografa en capa fina con la reaccin de la ninhidrina con la cual se peden identificar los aminocidos por la tincin color morado o magenta que se presenta en ellos, excepto con la prolina la cual, da un tono amarillo al reaccionar con la ninhidrina debido a que no produce amonio al reaccionar con ella, lo que indica que los dems aminocidos que si presentaron esta reaccin. Se investigaron tericamente algunos mtodos de identificacin de los aminocidos, pero principalmente por medio de cromatografas, a que esta es la tcnica principal que se empleo para la tcnica, as como algunas de las reacciones coloreadas principales para los aminocidos. Los objetivos principales de esta prctica fueron llevar a cabo la separacin de aminocidos por medio de las cromatoplacas utilizadas siendo as la fase mvil el eluyente que fue una mezcla de solventes y la fase mvil, el aminocido utilizado en cada placa. Se utilizaron para esto 11 aminocidos y una protena que fue la casena para compararlos con ella sin embargo no se observ un factor de rendimiento igual al de la casena, no por que no tuviera esta ninguno de los aminocidos que se utilizaron sino que para que se pudieran comparar sus aminocidos e hubiera tenido que hidrolizar primero esta protena para comparar sus residuos con los aminocidos utilizados. Se logro concluir que el factor de retencin obtenido se deba dependiendo de las caractersticas de cada aminocido ya que dependiendo de si estos eran o no polares o incluso neutros iban a tener mayor o menor factor de retencin, esto debido a que un factor de retencin alto indica una gran afinidad del compuesto por el disolvente y si el eluyente es polar va a jalar consigo a los compuestos polares por el contrario si no es polar, entonces jalara a los compuestos no polares.

INTRODUCCIN A menudo se tienen mezclas de aminocidos que se desean analizar. Antes de poder cuantificar estas mezclas es necesario separarlas. Tres mtodos de separacin han sido frecuentemente empleados en los laboratorios:
Cromatografa de capa fina. Este mtodo se basa en

fosfomolbdico para permitir su identificacin. Los sistemas en los que las placas se desarrollan en ambas direcciones (en este caso se aplica slo una muestra por placa) se conocen como TLC bidimensional.
Cromatografa lquida en columnas de intercambio

la separacin de las molculas adsorbidas a una capa muy delgada de gel de slice, mediante el flujo de una columna de solvente que se deja ascender mediante capilaridad. La separacin se realiza en base a la polaridad de las molculas y la mezcla de solventes ms empleada ha sido butanol: agua: ac. actico (4:1:1). La fase estacionaria es la celulosa del papel y la mvil una mezcla de disolventes orgnicos y agua. La celulosa retiene una cierta cantidad de agua entrelazada entre sus fibras y puede dar lugar a un mecanismo de reparto de los componentes de una muestra aplicados sobre ella cuando se hace fluir un disolvente de polaridad distinta de la del agua. Segn la solubilidad que tengan los componentes de la muestra respecto de las dos fases as ser su movilidad.[1, 2] Las mezclas de aminocidos pueden separarse en placas de capa fina de gel de slica, empleando como fase mvil butanol:agua:cido actico (4:1:1). Las manchas de los aminocidos pueden detectarse sobre la placa desarrollada, si despus de secarla se asperja con una solucin de ninhidrina. Los aminocidos aparecen como manchas prpura sobre un fondo ligeramente amarillento. Sin embargo, la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) genera una mancha de color amarillo oscuro. Este mtodo, aunque no es muy sensible, se emple con frecuencia en los primeros estudios de la composicin de las protenas. En la actualidad ha sido desplazado por la cromatografa lquida de alta resolucin, ya que esta ltima es ms confiable para la cuantificacin y tiene mayor sensibilidad si los aminocidos se detectan por fluorescencia. Sin embargo, la cromatografa de capa fina se sigue empleando para determinar fosfoaminocidos, ya que de esta manera es posible identificar si una determinada fosfoprotena, se encuentra fosforilada en serina, treonina o tirosina. Para ello, la protena debe degradarse hasta liberar los aminocidos que la componen y luego esto se separan en una placa de gel de slica. La placa se gira 90 o y se desarrolla con un segundo sistema de solventes. Los fosfoaminocidos pueden revelarse con un reactivo de cido

aninico. En este caso, los aminocidos se hacen pasar por una columna de resina con un grupo catinico. Los aminocidos, segn su carga se van a unir a la columna y luego, mediante un cambio gradual en el pH del solvente que se aplica a la columna, se va eluyendo cada aminocido a un pH distinto (segn su punto isoelctrico). Como algunos aminocidos son ms dificiles de separar que otros, a menudo es necesario emplear una columna corta para separar un grupo de aminocidos y una columna larga para separar los aminocidos restantes.
Cromatografa lquida de alta resolucin en

columnas de fase reversa. Este mtodo consiste en aplicar los aminocidos disueltos en una fase acuosa acidificada a una columna de slice unida a una cadena hidrocarbonada. Los aminocidos, segn su polaridad se van a unir a la columna y entonces el eluyente se mezcla gradualmente con cantidades cada vez mayores de un solvente menos polar que el agua. Los aminocidos van siendo lavados de la columna conforme la polaridad del solvente baja lo suficiente. [1] La cromatografa se engloba dentro de las llamadas tcnicas de separacin y permite el anlisis de mezclas complejas de compuestos muy estrechamente relacionados qumicamente. Son varias las modalidades usadas y se clasifican segn la fase mvil (de gases, lquida) y por el tipo de soporte (columna, capa fina, papel) usados. La separacin se lleva a cabo segn la distinta interaccin que presenta cada uno de los componentes de una muestra respecto a dos fases: una estacionaria y otra mvil que fluye sobre ella. Esta interaccin puede ser de varios tipos que a su vez dan lugar a distintas subclases de cromatografa: de absorcin, de reparto, de cambio inico, de afinidad, etc. [2] Separacin de molculas por cromatografa El estudio y caracterizacin de las distintas biomolculas (azcares, lpidos, protenas, cidos nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su aislamiento y purificacin a partir de mezclas complejas como son los preparados de cualquier material biolgico. Una de las tcnicas bioqumicas

ms clsicas y utilizadas para dicho fin es la cromatografa. La cromatografa incluye una amplia gama de tcnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento fsico-qumico en el que se basa la separacin (cromatografa de adsorcin, de reparto, de cambio inico, de filtracin molecular, hidrofbica y de afinidad), o al material sobre el que se lleva a cabo (cromatografa en papel, capa fina, en columna y de gases).[3] Cromatografa de reparto En la presente prctica llevaremos a cabo una cromatografa de reparto, en capa fina, para la separacin de aminocidos. En la cromatografa de reparto los componentes de una mezcla se separan en base a una distribucin diferente entre la fase mvil y la fase estacionaria. El movimiento relativo de las molculas a lo largo del sistema cromatogrfico es el resultado de un equilibrio entre las fuerzas de transmisin o arrastre ejercido por la fase mvil en su desplazamiento sobre la fase estacionaria y las fuerzas que tienden a frenar dicho desplazamiento. Las fuerzas de frenado pueden ser tanto de reparto (basado en criterios de solubilidad) como de adsorcin. [4] La teora de la cromatografa de reparto se basa en que, en general, si dos fases inmiscibles se encuentran en contacto una con otra y si una de las dos fases contiene un soluto, ste se distribuir entre ambas de acuerdo con sus solubilidades relativas. Dicho fenmeno se denomina reparto y viene determinado por el coeficiente de reparto, que es la relacin entre las concentraciones del soluto, en el equilibrio, en las dos fases. En la cromatografa de reparto tenemos un soporte inerte al que est unida la fase estacionaria lquida. La mezcla a separar junto con la fase mvil se hace avanzar a lo largo de la fase estacionaria por capilaridad. En dicho avance, la fase mvil arrastrar consigo un porcentaje de molculas de cada componente a separar de acuerdo con los respectivos coeficientes de reparto. La distancia recorrida por cada uno de los componentes de la muestra depender de la cantidad de solvente o eluyente que se haga pasar y de los coeficientes de reparto, de manera que si stos son diferentes aqulla tambin lo ser, siendo posible la separacin si se utiliza el volumen de eluyente apropiado. En su desplazamiento, las molculas de soluto se distribuirn no puntualmente, sino formando un rea debido a que son parcialmente solubles en las dos fases y a otros fenmenos tales como la difusin. [5] En la cromatografa de reparto se suelen utilizar diversos materiales como soportes: almidn, celulosa,

gel de slice, xido de aluminio, etc. Aunque en teora se consideran inertes, pueden generar diferentes procesos de adsorcin, por lo que la separacin ocurrir tambin, en parte, debido a la interaccin entre las molculas a separar con dicho soporte, la cual actuara como fuerza de frenado. La fase estacionaria se forma suspendiendo o embebiendo el soporte con el solvente adecuado; ste recubre las partculas del soporte y es retenido por adsorcin y/o capilaridad. El espacio entre las partculas del soporte ser utilizado por la fase mvil para su desplazamiento.[6] Debemos de tener en cuenta que como fase mvil se suelen utilizar solventes hidrfobos cuando haya que separar compuestos no polares y solventes acuosos cuando haya que separar sustancias polares. Por su parte, la fase estacionaria, que debe ser al menos parcialmente inmiscible con la mvil, suele ser por lo general hidroflica, aunque tambin pueden utilizarse compuestos hidrfobos.[7] Cromatografa en capa fina En la cromatografa en capa fina, CCF o TLC ("thinlayer chromatography, en la terminologa inglesa) se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en partculas finas y distribuirse uniformemente en forma de lminas. Esto incluye sustancias inorgnicas (gel de slice, xido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y orgnicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). La utilizacin de soportes hidrfobos facilita la separacin de compuestos no polares (lpidos, por ejemplo). En la CCF, la fase estacionaria es una lmina de 0,25-0,50 mm de espesor, extendida de forma uniforme sobre la superficie de una placa de vidrio o plstico. Aunque muchas casas comerciales suministran placas ya preparadas, stas pueden hacerse en el laboratorio con aparatos especiales que permiten extender sobre la placa de vidrio o plstico la papilla formada por la suspensin del material en un disolvente adecuado (generalmente agua). La placa ha de dejarse secar antes de su utilizacin. [8] Para el desarrollo de la cromatografa, las muestras, en un disolvente adecuado, se aplican puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un extremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar es crtico, ya que va a afectar a la resolucin (separacin de los componentes de una mezcla compleja), y depende de la concentracin del compuesto o compuestos de inters en la muestra. Para soluciones concentradas bastar una cantidad muy pequea (rango de l) para aplicar suficiente cantidad de los solutos a separar sin llegar a saturar la capacidad de resolucin

de la placa cromatogrfica. Para soluciones muy diluidas, deber aplicarse un volumen suficiente (de hasta varios ml) para asegurar una cantidad detectable de soluto o solutos de inters. En este caso conviene hacer la aplicacin en pequeos volmenes fraccionarios, no procedindose a una nueva adicin hasta haberse secado totalmente la precedente (de lo contrario la superficie de aplicacin se hara muy grande, distando mucho de la situacin ideal de concentracin de la muestra en un solo punto de aplicacin). Una vez aplicada y seca la muestra, la placa se introduce en un recipiente cerrado (tanque cromatogrfico) y uno de los extremos (el ms prximo a la lnea de aplicacin) se sumerge en un disolvente apropiado (fase mvil), cuyo nivel en el fondo del tanque debe quedar por debajo de la lnea de aplicacin. El solvente se desplaza a travs del soporte por capilaridad provocando un reparto de los solutos entre l y la fase estacionaria de acuerdo con sus solubilidades relativas (coeficientes de reparto). Una vez que el solvente haya alcanzado un punto prximo al otro extremo de la placa, sta se saca del tanque y se seca. [9] Las manchas correspondientes a cada compuesto, si no son visibles, se pueden revelar mediante tcnicas analticas concretas. Se determina la posicin de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente, calculndose el correspondiente valor de Rf. La deteccin de los compuestos una vez realizada la cromatografa se puede llevar a cabo en base a sus propiedades espectroscpicas, fluorimtricas, hacindolos reaccionar con reactivos especficos, radioisotpicamente, etc. La identificacin de tales compuestos se suele realizar comparando sus Rf con los de compuestos de referencia (patrones) de naturaleza qumica conocida. Alternativamente, los diferentes compuestos, una vez localizada su posicin por un mtodo no destructivo, pueden eluirse de la placa raspando las zonas correspondientes y extrayendo el polvo obtenido con un solvente adecuado. [10] Uno de los factores ms crticos en este tipo de cromatografas es la eleccin de la fase mvil, que, bsicamente, suele estar formada por una mezcla de un solvente orgnico con agua y algunas sustancias adicionales tales cmo cidos, bases, agentes acomplejantes, etc., cuya finalidad es aumentar o disminuir la solubilidad de algunos compuestos. Adems de en una sola direccin, la CCF puede tambin realizarse bidimensionalmente. En este caso slo se aplica una nica muestra, que se dispone en uno de los vrtices de la placa y se eluye dos veces,

normalmente con solventes diferentes, y en direcciones perpendiculares.[11] La CCF presenta una serie de ventajas respecto a cromatografas alternativas, como es la de papel, tales como las siguientes: i) Una mayor resolucin, obtenindose por lo general manchas ms pequeas. ii) Una mayor velocidad de separacin. iii) Pueden utilizarse un gran nmero de materiales como soportes y disolventes. iv) Los compuestos pueden ser detectados con facilidad y su recuperacin es muy simple. La mayor resolucin obtenida por CCF se debe a que pueden formarse partculas muy finas del soporte, por lo que la relacin superficie/volumen es muy elevada, proporcionando una gran rea superficial por unidad de longitud. Esto se traduce en que la cantidad de muestra que se puede aplicar es mayor y la difusin es mucho menor. La ventaja respecto a la cromatografa en papel es que ste tiene una estructura fibrosa y la capilaridad asociada a las fibras tiende a aumentar la difusin de las molculas.[12] Cromatografa de Adsorcin: Est basada en la diferente adsorcin y posterior desorcin de sustancias contenidas en un disolvente mvil (lquido o gas) sobre un slido estacionario. No se debe confundir la adsorcin que es un fenmeno de superficie que se manifiesta por el aumento de concentracin de la interfase que rodea al medio estacionario, con la absorcin que consiste en la penetracin de una sustancia en el seno de otra. Ejemplos de cromatografa de adsorcin son la cromatografa en columna de almina y de carbn activado, la placa de slica gel.[13] Cromatografa de Intercambio Inico: La fase estacionaria es una matriz polimrica porosa que posee grupos inicos unidos covalentemente y contraiones mviles que pueden ser intercambiados por iones arrastrados por la fase mvil (lquido).[14] Cromatografa de Exclusin Molecular: Las molculas pueden ser separadas tambin sobre la base de sus diferentes tamaos al pasar a travs de una columna que contiene partculas hidratadas de geles porosos. Se encuentra en el mercado un buen nmero de materiales para estos fines, cuya composicin y porosidad son controladas cuidadosamente, de modo

que molculas de tamao relativamente parecido puedan ser separadas mediante la adecuada seleccin del tamao del poro gel (tabla 1). El Sephadex consta de partculas pequeas de dextrano formadas por una red tridimensional de cadenas de polisacridos ramificados. Es altamente polar debido a su alto contenido de grupos hidroxilos, por ello se hincha considerablemente cuando se coloca en agua. La mezcla de molculas grandes y pequeas se coloca sobre la superficie libre superior del gel. A medida que la muestra desciende por la columna, las molculas pequeas difunden dentro del gel teniendo que recorrer un camino ms largo, mientras que las molculas grandes pueden ser completamente excluidas de los poros del gel. Eventualmente se obtiene una separacin completa en la que las molculas grandes salen primero de la columna y por ltimo las ms pequeas. El resultado de la columna cromatogrfica se expresa en la forma de un diagrama de elucin que muestra la variacin de la concentracin del soluto en el eluyente versus el volumen del eluyente que ha pasado por la columna. De este diagrama se obtiene el volumen de elucin. El volumen de elucin (Ve) no es un criterio para definir el comportamiento de un compuesto, ya que vara con el volumen total de la columna ( Vt) y la forma como la columna ha sido empaquetada. Para ello se utiliza la constante Kav

presente. Para cada prueba se utilizar un control negativo, tambin denominado blanco de la reaccin, en el que el reactivo se aadir a agua destilada (o solvente adecuado). Aunque en la presente prctica se llevar a cabo la determinacin cualitativa de aminocidos (ausencia o presencia de dichos compuestos), las reacciones coloreadas pueden tambin ser utilizadas para la determinacin cuantitativa de dichas biomolculas. Hay una amplia gama de mtodos colorimtricos que permiten la determinacin cuali- y cuantitativa de aminocidos. Aunque son mtodos muy generales, algunos de ellos permiten discriminar entre diferentes tipos de estos compuestos. As, hay mtodos de determinacin de aminocidos con el grupo amino libre (mtodo de la ninhidrina), de aminocidos con ncleos aromticos (reaccin xantoproteica), de los que poseen un grupo indlico (triptofano; reaccin con el cido glioxlico), un anillo fenlico (tirosina; reaccin de Millon), de aminocidos azufrados (cistena; reaccin con nitroprusiato sdico). En todos los mtodos, el aminocido reacciona con otro compuesto formando derivados coloreados que se pueden determinar cuantitativamente por espectroscopia visible. De todos los mtodos reseados, el ms general y utilizado es el de la reaccin con la ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminocidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formacin de amoniaco y anhdrido carbnico, con reduccin del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molcula de ninhidrina para dar un compuesto de adicin doble que presenta una coloracin azulprpura, con la excepcin de la prolina que da una coloracin amarillenta (recordar que en la prolina el grupo amino est sustituido). El derivado coloreado presenta mximo de absorcin en torno a 570 nm. La reaccin se lleva a cabo en caliente y a valores de pH comprendidos entre 4 y 8. Las aminas primarias (R-CH2 NH2) dan tambin positiva la prueba de la ninhidrina, aunque en este caso no se libera CO2 La tcnica es muy sensible, por lo que es ideal para detectar concentraciones bajas de aminocidos, utilizndose para revelar su presencia en cromatogramas y fracciones procedentes de otras tcnicas de separacin. La presencia de aldehdos resultantes de la degradacin de la ninhidrina por reaccin con los aminocidos modifica, bajo ciertas condiciones, el color formado, lo que sirve para identificar el tipo de aminocido.[17]

K av =

v v v v
e t

0 0

En cromatografa de exclusin el volumen de la fase mvil se llama volumen intersticial ( V0). El valor de V0 se determina haciendo pasar por la columna una molcula grande e inerte de peso molecular superior al lmite de exclusin del gel. El azul de dextrano 2000, un colorante con peso molecular de 2*10 6, se utiliza generalmente con este propsito. Cuando no se dispone de la informacin adecuada para este clculo, el Vo se puede estimar como el 35% del volumen total de la columna (Vt). El volumen total de la columna se calcula a partir de las dimensiones de la columna (V t = r2 h ).[15] Reacciones coloreadas de aminocidos Los mtodos colorimtricos de determinacin de aminocidos se basan en la reaccin especfica de stos con determinados compuestos, dando derivados coloreados. La formacin de color se toma como resultado positivo e indica su presencia, mientras que el no desarrollo de color es indicativo de que no est

Reaccin de aminocidos con la ninhidrina.[6]

valina fenilalanina isoleucina casena leucina triptofano Agua destilada Ninhidrina N-butanol cido actico Acetona

OBJETIVOS

EQUIPO

Se llevar a cabo la separacin de mezclas de Balanza analtica aminocidos mediante cromatografa en papel. Se estufa revelar la presencia de los mismos en el papel mediante reaccin con ninhidrina y se identificarn PROCEDIMIENTO en el cromatograma por comparacin con la posicin de los correspondientes patrones preparados al 1.- Preparar: efecto. 25ml de lisina al 0.4% 25ml de arginina 0.4% HIPTESIS 25ml de acido asprtico al 0.4% 25ml de glicina al 0.4% Si se preparan soluciones de aminocidos a las cules 25ml de prolina al 0.4% se les separa por medio de cromatografa de capa fina, 25ml de valina al 0.4% se podrn estudiar estas de acuerdo al rendimiento que 25ml de fenilalanina al 0.4% nos proporcionen adems de aprender una tcnica de 25ml de isoleucina al 0.4% cromatografa con ninhidrina, la cual les da una 25ml de leucina al 0.4% coloracin para revelarlas. 25ml de histidina al 0.4% 25ml de triptofano al 0.4% MATERIAL 2.- Tomar 5ml de cada aminocido por equipo 3.- Poner en una cromatoplaca una muestra de cada aa. Gradillas con tubos de ensayo. y una muestra de casena al 0.1% Juego de pipetas (0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 ml). Nota: las cromatoplacas miden 3x5 cm. Probetas (100 y 250 ml). 4.- utilizar como eluyente una muestra de n-butanol, Vasos de precipitado (100 y 150 ml). acido actico y agua en relacin (4:1:5) Piseta 5.- Cuando se eluyan las muestras dejar secar las Papel de filtro. cromatoplacas y rociarlas con nihidrina al 0.5% en Capilares para aplicar muestras. acetona. Papel de parafilm. Preparar para todo el grupo 100ml de solucin de Rotulador de vidrio. nihidrina al 0.5% en acetona y ponerla en un frasco Pipetas Pasteur atomizador Cromatoplacas Vidrio de reloj SUSTANCIAS lisina arginina acido asprtico glicina prolina

[18]

Cuidado la acetona disuelve el frasco atomizador, as que hay que ponerla en un frasco con tapn esmerilado, mientras se espera para utilizarla! Precaucin utilizar guantes de ltex para prepararla y para aplicarla, pues mancha la piel, ya que se une a las protenas de la piel! 6.- revelar las cromatoplacas por calentamiento en una estufa a 90C por 10 minutos. Colocar las placas en un vidrio de reloj

Elucin de las cromatoplacas 7.- Marcar con un lpiz el frente de disolvente y las manchas 8.- calcular el Rf de cada a.a e identificarlos a.a de la casena.

[19]

RESULTADOS:

Revelado de las cromatoplacas

12. - Histidina 0.5 Rf = = 0.1471 3.4 DISCUSIN DE RESULTADOS Se utiliz la tcnica de cromatografa en capa fina, la cual se basa en la separacin de las molculas absorbidas a la capa de gel de slice de la cromatoplaca mediante el flujo de la columna de la mezcla de solventes de agua, butanol y cido actico. La fase estacionaria es la celulosa y la mvil los disolventes. Segn la solubilidad que tienen los aminocidos de la muestra respecto de las dos fases as fue su movilidad Las manchas de los aminocidos se observaron sobre la placa desarrollada, por la una solucin de ninhidrina rociada y al despus ponerla en la estufa. Los aminocidos aparecieron como manchas prpura sobre un fondo ligeramente amarillento. Sin embargo, la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) genera una mancha de color amarillo oscuro. Se utiliz la ninhidrina debido a que sirve para la determinacin de aminocidos con el grupo amino libre .La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminocidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formacin de amoniaco y anhdrido carbnico, con reduccin del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molcula de ninhidrina para dar un compuesto de adicin doble que presenta una coloracin azulprpura. La ninhidrina reacciona con los aminocidos formando aductos coloreados segn la reaccin:

Clculo del factor de retencin 1.- Prolina:

Rf =

1.7 = 0.5213 3.2

2.- Glicina 1 .1 Rf = = 0.2895 3 .8 3.- Isoleucina 1 .1 Rf = = 0.3548 3 .1 4.- Casena 0.6 Rf = = 0.1935 3.1 5. - Lisina 0. 7 Rf = = 0.2188 3. 2 6. - Arginina 0.5 Rf = = 0.1613 3.1 7.-cido Asprtico 0.9 Rf = = 0.2647 3.4 8. - Valina 0.9 Rf = = 0.25 3.6 9. - Leucina 1. 2 Rf = = 0.3529 3. 4 10. - Fenilalanina 1.8 Rf = = 0.5 3.6 11. - Triptofano 1.9 Rf = = 0.5588 3.4

El reparto de los aminocidos en el papel se debe a su naturaleza qumica. Las frmulas de los compuestos usados como patrn son:

manera se nos facilitaran saber las caractersticas del aminocido que se este utilizando. REFERENCIAS [1]http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/EPa mm2.html [2] Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003) Estructura y funcin de las protenas. En: Bioqumica, 5 ed. Editorial Revert (Barcelona, Espaa), pp. 41-76. [3] Luisot P (1982). Bioqumica Estructural, 2 Ed. Editorial AC. [4] Smith I, Feinberg JG (1965) Paper & Thin Layer Chromatography and Electrophoresis. Shandon Scientific Company Ltd. Desarrollo histrico de la tcnica y aplicaciones. [5] Bermdez A, Bernal J, Espinosa E, Cornejo W, Briceo I, Prieto JC, Arrieta L [6]http://med.javeriana.edu.co/publi/vniversitas/serial/v 44n3/0023%20propuesta.pdf [7] Lehninger, A.L., Nelson, D.L. y Cox, M.M (1995) Principios de Bioqumica. 2 Ed. Ediciones Omega. [8] Mathews, C.K. y van Holde, K.E. (1998) BIOQUMICA. Editorial Mc-Graw Hill. Interamericana. [9] Voet, D. y Voet, J.G. (1992) BIOQUMICA. Ediciones Omega. [10] Iborra, J.L., Lozano, P., Manjn, A., Monserrat, F., Cnovas, M, Obn, J.M. y Castellar, M.R. (1997) Gua de Bioqumica y Biologa Molecular para estudiantes de Ciencias e Ingeniera. Editorial DM. [11] Azcon-Bieto, J. y Taln M. (1993) Fisiologa y Bioqumica Vegetal. Ed. Interamericana-McGraw Hill. [12] Rawn, J.D. (1989) Bioqumica. Vols. I y II. Ed. Interamericana-McGraw Hill. [13] Stryer, L. (1995) Bioqumica. Vols. I y II. Ed. Revert. [14]http://www.cursos.ucv.cl/qui34302/XLaboratorios/Laboratorio2REVGuia03.doc [15] Robert Bohinski, 1991. Bioqumica, 5 Edicin, Addison-Wesley, Iberoamericana. [16] Donald Voet and Judith G. Voet, 1998. Biochemistry. John Wiley & Sons. [17] A.L. Lehninger, D.L. Nelson and M.M. Cox, 1993. Principles of Biochemistry (Second Edn.) Worth Publishers. [18] http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimi ca-biol[19]mol/pdfs/11%20CROMATOGRAF%C3%8DA %20DE%20CAPA%20FINA%20DE%20AAs.pdf

El reparto que se obtiene es el siguiente: los aminocidos apolares son los que mejor interaccionan con el solvente y son arrastrados por l; la lisina presenta la menor movilidad debido a que al pH del solvente, este aminocido presenta sus dos grupos amino cargados positivamente por lo que interacciona mal con el solvente, mayoritariamente apolar (n-butanol). Los dems aminocidos se separan entre los aminocidos apolares y el bsico. Al determinar los factores de retencin se puede observar que el triptofano es el que mayor factor de retencin obtuvo, esto debido a que es el que tiene mayor afinidad por el disolvente y el de menor factor de retencin fue la histidina, es decir, tuvo menor afinidad por el disolvente. CONCLUSIONES Esta tcnica de separacin cromatogrfica es de las ms simples, adems de que nos permiti estudiar esta tcnica y cualitativamente observar la reaccin producida por medio de la ninhidrina que permite identificar aminocidos ya que la reaccin de los aminocidos con ninhidrina se debe a la presencia del grupo NH2 en los mismos observndose as una coloracin morada o magenta. La prolina no tiene dicho grupo libre, sino NH- ya que forma parte del anillo de pirrolidina, y al reaccionar con ninhidrina se forma un color amarillo. El factor de retencin depende de la afinidad de los aminocidos con el disolvente o eluyente utilizado y esto mismo depende del tipo de aminocido que se utilice, es decir si son polares, apolares, neutros, etc., por lo cual es importante esta tcnica ya que de esta

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