LISTERIA

Según la normatividad Listeria específicamente Listeria monocytogenes se debe determinar en los

ensayos, por lo tanto, no es un ensayo de recuento sino de Presencia/ausencia

en Listeria si debo hacer la diferenciación entre Listeria monocytogenes, Listeria innocua,

Listeria ivanovii y Listeria grayi, si es que la hay; entonces realmente debo decir si hay
Listeria monocytogenes como tal, que es la que nos interesa a nivel alimentario.

 Es un bacilo Gram positivo

 Listeria monocytogenes, esta especie como tal tiene una característica y una
motilidad especial en una temperatura de 22 - 28°C

 son anaerobios facultativos

 pueden crecer perfectamente entre 3°C hasta 42°C, por eso es importante sobre
todo en proceso de refrigeración y en proceso de altas temperaturas también es
importante, menores de 42 grados centígrados, porque esto ayuda a la
supervivencia de este tipo de bacteria o este tipo de bacteria puede sobrevivir a esa
temperatura; nosotros hacíamos un ensayo llevando la caja de Petri a refrigeración
y ustedes veían que al hacer el gram ella crecía inhibidamente, o sea crecía como
un sarpullido pero de todas formas había crecimiento

 crecen muy bien en cultivos entre 18 a 24 horas, en cultivos enriquecidos

 es un microorganismo que tiene la enzima catalasa (catalasa positivo)

 las colonias se presentan en agar sangre, son puntiformes a pequeñas

 Es una colonia beta hemolítica y una beta hemólisis qué es característica por qué
es una beta hemólisis estrecha

 Una de las características metabólicas es que hidroliza la esculina, la esculina

recordemos que la hidroliza a glucosa y esculetina, y la esculetina es la misma 6,7-
dihidroxicumarina que se une a otro tipo de compuestos formando... ahora miramos
el fundamento de esos medios

 Crecen a pH bajos y son halófilos, crecen a altas concentraciones de sal; por eso
es que es importante en alimentos por qué resiste todas estas barreras que
podemos añadir al alimento

Aquí la vemos en coloración de Gram.

  ellos son súper ordenados, inclusive, se pueden llegar a confundir con Corine pero
recuerden que el Corine es mucho más alargado es mucho más grande; en la
Listeria es casi la mitad del tamaño del Corynebacterium y recuerden que el
Corynebacterium se presenta también en letra china, este es un poquito más
ordenado

Medios que se utilizan para determinación de Listeria:

Uno de los primeros pasos es el enriquecimiento primario en medios líquidos

selectivos con concentración reducida de agentes selectivos.

 Caldo Fraser de media concentración

 Caldo LEB-1
 Caldo Palcam

CALDO FRASER DE MEDIA CONCENTRACIÓN

El caldo Fraser de media concentración tiene: (ver la tabla de arriba que tiene como título
BASE)

 Fosfato diácido, que es lo que le da el balance osmótico

 La esculina, Componente diferencial ya que todas las Listerias hidrolizan la
esculina en glucosa y esculetina y la esculetina, es el 6,7 dihidroxicumarina
 Cuando la esculina es hidrolizada por lo MO a glucosa y esculetina se une a este
compuesto, qué es el citrato amonio de hierro III, es decir, la 6,7-dihidroxicumarina
se une al citrato amonio de hierro III y forma un compuesto color negro, entonces es

dónde se ve ennegrecido el medio completamente

Caldo Fraser sin inocular: Amarillo

Caldo Fraser positivo para Listeria: color negro por la hidrolisis de la esculina.

Y obviamente el crecimiento se da porque hay inhibidores que lo que hacen es

disminuir completamente la biota comensal acompañada. Y no inhibe la Listeria

CALDO LEB-1

es otro de los cultivos primarios, se llama LEB por que es Listeria Enrichment Broth.

También tiene una base que es la (lee la tabla amarilla de la izq)

 Mire que tiene altas concentraciones de cloruro de sodio que son 20gr
 Acido nalidixico que es el inhibidor de biota comensal
 Aparte del ácido nalidíxico, se llama LEB-1 porque contiene 0,025 ml de solución
acuosa 1% acriflavina
En este porcentaje de acriflavina es que se diferencia.
- Acá no hay crecimiento negro.

Caldo PALCAM

 Peptona
 Extracto de levadura
 Cloruro de litio: gran inhibidor de biota comensal
 Esculina: compuesto diferencial que se une (si hay hidrólisis) al citrato amonio de
hierro para formar el compuesto color rojo
  Manitol: carbohidrato fermentable, aunque la Listeria monocytogenes no
fermenta manitol
 Rojo fenol
 Lecitina de soja
 Tween 80
 Agua

Y tiene unos complementos que son:

 Polimixina
 Ceftazidime
 Acriflavina

Entonces tiene diferentes tipos de inhibidores como la polimixina, ceftazidime

Estos difieren mucho en los tipos de inhibidores de biota comensal que tienen, este caldo
PALCAM ya no tiene ácido nalidíxico sino que tiene otros inhibidores.

Enriquecimiento selectivo secundario

Listeria monocytogenes es muy importante en industrias de carne, embutidos, helados,

pescado, también es importante hacer su determinación como tal.

 Caldo Fraser
 Caldo LEB -2

Caldo Fraser

El caldo fraser ya no va a tener las tres soluciones que contenía arriba sino que contendrá
solo:
 El caldo base que tiene:
 Peptona de carne
 Digerido de triptona
 Extracto de carne
 Extracto de levadura
 Cloruro sódico
 Fosfato monoácido de sodio dihidrato
 Fosfato diácido de potasio
 Esculina
 Agua

 También va a tener la solución de acriflavina 0,1 mL

 Y la solución de citrato amónico de hierro lll 0.1 mL
Estos dos se le adicionan a un tubo de 10 mL de caldo base

Caldo LEB-2

Es el mismo Listeria Enrichment broth pero es el 2 que es el enriquecimiento secundario

donde tenemos la misma base:
  Proteasa peptona
 Triptona
 Extracto de carne purificada
 Extracto de levadura
 Cloruro de sodio
 Fosfato de potasio
 Fosfato disódico
 Ácido nalidíxico al 2% en NaOH 0,1N
 Agua

Y adicionalmente 0,1 mL de solución acuosa a menos concentración, a 0,2% de acriflavina,

es lo único que cambia porque ya hay un enriquecimiento selectivo anterior y lo que
queremos es potencializar el crecimiento de Listeria monocytogenes.

Medios de aislamiento selectivo (agares)

 Agar Oxford
 Agar PALCAM
 Agar TSYE: agar triptona soja extracto de levadura

Ya por medio de estos agares, si aislamos colonias presuntivas podemos hacer pruebas
diferenciales.
También existen agares cromogénicos como tal específicos para Listeria.

Agar Oxford
Está compuesto por un agar base columbia que está compuesto por:
 Proteasa peptona
 Almidón
 Cloruro de sodio
 Agar

También tiene:
 Esculina, entonces se va a observar la hidrólisis de la esculina.
 Citrato de hierro y amonio, entonces la esculetina se va a unir a él.
 Cloruro de litio: inhibidor
 Suplemento OXford, que son otro tipo de inhibidores que son:
 Cicloheximida
 Colistina
 Clorhidrato de acriflavina
 Ceftazidime que es una cefalosporina
 Fosfomicina
 Etanol, este disminuye mucho la concentración de Proteus
 Agua
Entonces de esta forma vamos a observar las colonias de Listeria monocytogenes.

Precipitado negro alrededor de las colonias. No es que las colonias se vean negras. Es un
precipitado alrededor. Las colonias negras se ven es en Baird Parker y eso es otra cosa.
Acá se ve es el medio negro por el precipitado

Agar PALCAM
Entonces tiene una base compuesta por:
 Peptonas
 Almidón
 Cloruro de sodio
 Extracto de Levadura
 Agar
 D- Glucosa, junto con el manitol son los carbohidratos fermentables. Todas las
especies de Listeria fermentan la glucosa y algunas el manitol como la Listeria grayi
 D- Mannitol
 Esculina, todas las especies hidrolizan la esculina

 Citrato amónico de hierro lll

 Rojo de fenol, indicador
 Cloruro de litio, inhibidor de la base
 Agua

Se le adiciona:
  Sulfato de polimixina
 Clorhidrato de acriflavina
 Ceftazidima sódica

Entonces el agar es parecido al agar sangre, se observa el precipitado por la hidrólisis de

la esculina alrededor de las colonias.

Recuerden que no solamente la Listeria hidroliza la esculina, hay otros microorganismos

que también pueden verse así, o sea a pesar que yo tengo inhibidores yo tengo que
confirmar que es Listeria.

Hay otros MO que tambien pueden hidrolizar la esculina, que pueden llegar a tener este
tipo de colonias, pero se supone que con todos esos inhibidores se espera que sea un agar
bastante selectivo.

AGAR TSYEA (TRIPTONA SOJA-EXTRACTO DE LEVADURA)

Este es un agar muy parecido al nutritivo, por como se ven las colonias.
 Digerido enzimatico de caseina
 Agar bacteriologico
 Cloruro sodico
 Hidrogenofosfato dipotasico
 Glucosa
 Digerido papainico de soja
 Extracto de levadura

AGAR CROMOGENICO PARA LISTERIA

Hay unos agares específicos cromogénicos que ya saben que dependen de la casa
comercial y el compuesto cromogénico que se esté usando.
Por ejemplo en este caso trajimos aquí un agar específico cromogénico para listeria donde

- Detecta la BD glucosidasa que está en todas las especies de Listeria y aparte me

- detecta la Lipasa C que es una enzima específica y se observa como un halo color
blanco alrededor de las colonias

Entonces cómo voy a ver la listeria aquí:

 L. monocytogenes Colonias azuladas por la BD glucosidasa, y un halo blanco
alrededor de las colonias por lipasa C.
 L inocua presencia de BD glucosidasa por lo que vere colonias azuladas, pero no
vere un halo blanco por ausencia de lipasa C
 Los otros tipos de bacterias se verán inhibidas por Cicloheximida, Ceftazidine, acido
nalidixico y la polimixina B

Si hay aisladas colonias presuntivas de listeria y creo que es una listeria monocytogenes lo
que hago es hacer las pruebas complementarias y confirmatorias:

 Lo primero que yo hago es el Gram, debo ver bacilos Gram +, puedo verlos en
empalizadas, depende del montaje como tal, pero debo verlos
 Catalasa = debe ser positivo
 Al realizar una motilidad de 22 a 26°C debo ver una motilidad característica en
sombrilla que puedo ver al 5 día de incubación
A 37° me crece, pero se demora muchisimo en crecer u crece inhibida, la T° optima
para que haga esta motilidad en sombrilla caracteristica de L monocytogenes es 22
a 26°C
 La hemolisis que ella hace es una B-hemolisis estrecha
 Carbohidratos, me ayudan a la diferenciacion de especies
 La prueba de CAMP me ayuda tambien a diferenciar especies.
 Pruebas serologicas que son opcionales, dependiendo del presupuesto de cada
laboratorio de alimentos
  Aqui observamos la B-hemolisis estrecha en agar sangre, con colonias pequeñas

puntiformes.
 Vemos también la motilidad en sombrilla, como el caparazoncito y el inóculo que se
ve como una línea.
 Y vimos la prueba de CAMP, ¿cómo la hacíamos? Era con un S. aureus productor
de B-lisina. Y nosotros sin sin que tocara la estria poniamos las cepas, un control
positivo y negativo, y poniamos la cepa que creiamos que era una L monocytogenes,
esto potencializa la hemolisis y se observa en una flecha invertida

¿Qué pasa en alimentos? Nosotros hacemos una diferenciación. En la linea que está
vertical a la derecha marcada con un borde intermitente tenemos S aureus, la linea que
esta al frente es Rhodococcus X, ¿cómo observo yo la diferenciación?

 La banda estrecha horizontal

que es la primera, con una
potencialización hacia S aureus,
es una L monocytogenes.
 No hay prueba de CAMP
positiva y hay ausencia de
hemólisis en L inocua que es la
segunda raya que vemos.
 La tercera es Listeria ivanovii
que tiene una hemólisis ancha y
se me potencializa a
Rhodococcus X

En ese caso debo tener dos cepas de Rhodococcus X que es un cocobacilo Gram
positivo y Staphylococcus aureus productor de betalisina si no es productor de betalisina
no sirve.
Acá vemos algunos reacciones para la identificación de listeria, donde vemos la hemólisis,
la producción de ácido estos ácidos se hacían en caldos sin campana de durham
(Rhamnosa, xilosa, manitol), ahora hay sistemas automatizados que nos pueden ayudar a
la utilización de este tipo de carbohidratos .

- L. monocytogenes utiliza la Rhamnosa con producción de ácido,

- la prueba de CAM es positiva con el S. aureus y negativa con el Rhodococcus equi, - - -
- diferente a la L. ivanovii que es positiva con el Rhodococcus equi,
- L. seeligeri es positiva débil para S. aureus, pero se diferencia con la L.
monocytogenes porque es xilosa negativo y manitol positivo.

Las manitol positivo son las Listerias grayi , las que tenemos en algunos medio
diferenciales

La prueba de CAM en alimentos se hace con Rhodococcus equis para diferenciar L.

ivanovii y L. monocytogenes.

¿Cuál es la función de la triflabina? Es un inhibidor bacteriano y de hongos tambien, actúa

como un antibiótico igual que el ácido nalidíxico, igual que la polimixina, para disminuir la
biota comensal acompañante, pero no inhibe la listeria como tal.

¿porque el Cam es necesario hacerlo con el otro microorganismo Rhodococcus equis ?

En este caso es para diferenciar de las demás especies , es una prueba que nos ayuda a
diferencias de las demás especies, no es obligatoria como tal, pero es mas completa hacer
la con el Rhodococcus equis, si usted hace carbohidratos, prueba de motilidad de 22 a
26ºC, con eso se ayuda mucho para decir que es una Listeria monocytogenes.
Recordar el fundamento de los caldos y de los demás medios.

Busca una NCT y baja al flujograma de procesos.

Recuerden que cuando nosotros estamos hablando de Listeria y salmonella los vamos a
asociar principalmente a los alimentos derivados de animales sin embargo no quiero decir
que salmonella no la pueda encontrar en una ensalada y ocasione un ETA al igual que en
un sándwich porque aquí no solo tenemos en cuenta la matriz alimentaria sino el agua con
la que se higieniza el alimento además del manipulador porque recuerden que las
condiciones de salud y sus prácticas higiénicas tienen un gran impacto en el producto igual
que las instalaciones donde se manufactura.

Cuando hablamos de salmonella y listeria es que ellos pueden venir en menor cantidad que
otros microorganismos es por esto es que es necesario hacer unas fases de pre
enriquecimiento porque ambas pueden venir injuriadas o estresadas porque recuerden que
al haber un porcentaje grande de bacterias acompañadas a ellas les va a quedar menos
nutrientes por lo que tendrán que competir por ellos.

Iniciamos con 25 grs sea helado , carne sea lo que sea lo llevamos al medio de
enriquecimiento primario donde completamos la dilución madre , usamos caldo
Fraser,palcam o Leb, inicio con fraser , palcam incubo porque estos medios son para
desestresar a la listeria y van a diferenciarse con respecto al enriquecimiento secundario
en que tienen unas concentraciones reducidas de agentes selectivos

 Incubamos a 30°C por 24Hrs, con un rango de 2°C por encima o por debajo.
Luego de eso evaluamos los caldos, si tenemos la oportunidad antes de tomar el mL lo
ideal es que si se pueda mezclar ese tubo, aunque, mi experiencia me dice que la mayoría
de laboratorios, maneja es esta primera fase de enriquecimiento selectivo, o la dilución
madre en bolsa más que en tubo. Nosotros en el lab no tenemos bolsas, no las hemos
estandarizado, entonces vamos a iniciar con el erlenmeyer, entonces vamos a iniciar a
tratar de mezclar, dejamos reposar o sedimentar, las partículas de alimentos que pueden
venir allí.
 Y vamos a tomar 0,1 mL del cultivo de enriquecimiento primario y lo vamos
adicionar en 10 mL de enriquecimiento secundario, Fraser, Palcam o LEB, lo
que si se recomienda es que si tomo Fraser para el primero, tome Fraser para el
segundo.
 Y vamos a llevar otras 24 hrs a 30°C con un rango de 2°C por encima o por
debajo, ¿y por qué aquí nos ponen 48? Pues esto va depender del manejo que
tengamos en ese alimento, si es un alimento altamente procesado, o no, si yo sé
que la línea de producción es una línea bastante estricta, que maneja muy bien sus
desinfectantes, que tenga un buen control de superficies, operarios y equipos,
entonces yo puedo extender un poquito más ese tiempo, pero lo mínimo que
debemos dejarlo son 24 hrs.
Aquí lo que influye es con qué tanta premura yo necesito esos resultados.
Fíjense que aquí ya llevo 48 hrs.

: ¿El tipo de caldo de enriquecimiento primario depende del tipo de muestra

que vayamos a analizar?
R/ no tanto, depende más bien de los protocolos que tenga el Lab, de cuáles hayan
sido los que hayan determinado para utilizar, con los que hayan estandarizado su
protocolo interno.

Entonces, una vez tenemos ese enriquecimiento primario vamos a hacer el enriquecimiento
secundario, allí extendemos un poco más el tiempo y conservamos la temperatura, y una
vez pasadas esas 24 hrs puedo darle unas hrs más, ¿qué es importante en esta fase? Que,
si las 24 hrs se me cumplen a las 3 am, pues no va a ser tanto impacto que yo llegue a las
7 am a realizar el proceso, entonces fijense que esto es importante inclusive, cuando yo
voy a hacer el montaje de las muestras, también importante cuando estamos hablando

También importante cuando estamos hablando por ejemplo, de fines de semana, entonces
uno en el laboratorio más o menos cuadra, si llega la muestra muy temprano y digamos se
me van a cumplir las 24 horas o las 18 horas que necesito, a medianoche, pues entonces
yo las dejo en refrigeración y la monto sobre las 5:00 de la tarde, para ocupar el tiempo a
la noche.

Una vez tenga yo el cultivo secundario, el enriquecimiento secundario, voy a plaquear las
muestras en Oxford y Palcam, aquí la metodología de la NTC nos pide que utilice estos
dos.

Hacemos siembra por agotamiento, importante que yo tenga una técnica bastante pulida,
para poder sacar un inóculo apropiado, aquí también es importante, sea en Erlenmeyer o
sea en bolsa, mezclar, dejar sedimentar y luego sí tomar la alícuota y plaquear.
Voy a llevar estos medios 24 horas, aquí le subo un poco más la temperatura, a 35°C con
un rango de 2 °C, y vamos a detectar las colonias pequeñas, convexas con bordes
definidos, etc.
Si a las 24 horas no vio nada, déjelas hasta las 48 horas, si ya en esas 48 horas no ve
nada, listo, descartada, pero a las de 24 horas todavía no se pueden descartar.

Una vez usted tenga colonias que considera como sugestivas, que son sospechosas, que
cumplen con los criterios morfológicos y bioquímicos de la Listeria sobre Oxford y
Palcam, usted va a hacer unas pruebas confirmatorias.

Para hacer esas pruebas de confirmación, no se van a hacer sobre Oxford o Palcam, sino
que va usar un Agar intermedio que es TSYE A, este es un agar que simula las funciones
de un agar nutritivo y que tiene por objetivo obtener un cultivo axénico, o purificar digamos
esa cepa, se va dejar de 18 a 24 horas.

Si usted ve que al haber pasado a Oxford y Palcam a TSYE A todavía tiene colonias
mezcladas, pues vuelva hacer un pase TSYE A para que pueda obtener un cultivo axénico.

Las pruebas de confirmación de Listeria, según la metodología inicia con Catalasa, pero
sabemos que todo lo que requiere confirmación de morfología al microscopio pues van a
iniciar con la prueba de tinción de Gram. E

ntonces, hago mi prueba de Gram, si veo esos bacilos que son Gram positivos, que son
bacilos cortos, entonces, procedo a hacer prueba catalasa y hacer prueba de motilidad.
Lo que nos dice la experiencia y la NTC es que usted debe procesar por lo menos 5 colonias
sospechosas, si usted tiene menos de 5 en el Agar pues entonces procese todas. Una vez
usted obtenga resultados positivos o confirmatorios para estas pruebas confirmatorias de
catalasa, Gram y prueba utilidad en sombrilla, usted puede determinar o confirmar el género
Listeria y especie monocytogenes.
Si usted ve que en la prueba de Gram no son los microorganismos que está buscando pues
no vaya a hacer catalasa, ni motilidad.

Si usted ve que en Gram hay bacilos cortos, Gram positivos, de los que usted sospecha
pues le hace la catalasa y le hace la motilidad, si son negativas pues no continúa los otros
pasos.

Una vez usted ha confirmado mediante estas pruebas la especies monocytogenes, el

protocolo le da la opción de seguir para ya hacer unas pruebas confirmatorias
adicionales, el ensayo de hemólisis, utilización de carbohidratos, y la prueba de
CAMP. En algunos laboratorios, si ven que catalasa es positiva, y Gram es sugestiva, de
una vez montan estas pruebas adicionales junto con la prueba de motilidad.