Fundamento de los medios de cultivo utilizados

Primero se sacó un inoculo de muestra problema y se pasaron a los tubos de

ensayo con caldo LST
o Caldo LST (Lauril Sulfato Triptosa) (Estos tenían el inoculo inicial de 10, 1 y
0,1 ml)
 Medio rico en nutrientes que permite un rápido desarrollo de los
microorganismos fermentadores de la lactosa. La triptosa es la
fuente de nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos, la lactosa
es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un
sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
Es un medio selectivo ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el
desarrollo de la flora acompañante. Por la fermentación de la lactosa
se produce acido y gas, este ultimo se puede ver en las campanas
de Durham.
 Contiene lo siguiente:
 Triptosa (20 gramos/litro)
 Lactosa (5,0 gramos/litro)
 Cloruro de sodio (5,0 gramos/litro)
 Lauril Sulfato de sodio (0,1 gramos/litro)
 Fosfato dipotásico (2,75 gramos/litro)
 Fosfato monopotasico (2,75 gramos/litro)
De la misma muestra se filtró a través de membrana para cultivar en medios M-
Endo y M-FC
o Filtración por membrana medio de cultivo M-Endo (rojo)
 Es un medio de cultivo diferencial y ligeramente selectivo utilizado
para la detección de coliformes y otros microorganismos entéricos.
Su selectividad se debe a la combinación de sulfito de sodio y
fucsina básica que inhibe ligeramente el crecimiento de los
microorganismos gran positivos.
 Contiene lo siguiente:
 Fosfato Dipotásico (3,5 gramos/litro)
 Digerido péptico de tejido animal (10 gramos/litro)
 Agar (15 gramos/litro)
 Lactosa (10 gramos/litro)
 Sulfito de sodio (2,5 gramos/litro)
 Fucsina básica (0,5 gramos/litro)
 Filtración por membrana medio de cultivo M-FC (azul)
 Es un medio selectivo y diferencial para la enumeración de
coliformes fecales en agua contaminada. Este medio tiene
concentración de sales biliares, por lo que lo hace selectivo para
Enterobacterias teniendo en cuenta una temperatura de incubación a
44,5 ± 0,5°C.
o Tambien se uso el Sistema Quarty-Tray/2000 que es el modelo de Numero
Mas Probable de la técnica de los tubos múltiples, una versión mas corta de
la tecnica
o Del caldo LST se sacaron las muestras respectivas para pasarlos a otros
tubos de ensayo con verde brillante y EC
Caldo verde brillante (Turbidez y Gas positivo)
 En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios
para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante
son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias
Gram positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la
lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del
grupo coliforme, la fermentación de la lactosa con producción de
ácido y gas.
 Contiene lo siguiente:
 Bilis de Buey deshidratada (20 gramos/litro)
 Lactosa (10 gramos/litro)
 Peptona (10 gramos/litro)
 Verde Brillante (0,0133 gramos/litro)
Caldo con EC (Turbidez y Gas positivo)
 En el medio de cultivo la tripteina es la fuente de péptidos,
aminoácidos y nitrógeno. La lactosa es el hidrato de carbono
fermentable y favorece el desarrollo de bacterias coliformes, las
sales biliares inhiben el crecimiento de la flora acompañante Gram
positiva, las sales fosfato constituyen un sistema buffer que impide
que los productos ácidos originados por la fermentación de lactosa
afecten el crecimiento microbiano y el cloruro de sodio mantiene el
balance osmótico.
 Contiene lo siguiente:
 Tripteina (20 gramos/litro)
 Lactosa (5,0 gramos/litro)
 Sales Biliares N°3 (1,5 gramos/litro)
 Fosfato Dipotásico (4,0 gramos/litro)
  Fosfato Monopotasico (1,5 gramos/litro)
 Cloruro de Sodio (5,0 gramos/litro)
Se selecciona un tubo de EC y se saca inoculo para pasarlos a medio MacConkey
Agar MacConkey (colonias de color rojizo)
 En el medio de cultivo, las peptonas aportan los nutrientes
necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de
carbono fermentable, y la mezcla de las sales biliares y el cristal
violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo e gran
parte de la flora Gram positiva. El agar es el agente solidificante. Por
fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia.
Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la
absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los
microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias
incoloras.
 Contiene lo siguiente:
o Peptona de carne (1,5 gramos/litro)
o Peptona de gelatina (17 gramos/litro)
o Tripteina (1,5 gramos/litro)
o Lactosa (10 gramos/litro)
o Mezcla de sales biliares N°3 (1,5 gramos/litro)
o Cloruro de sodio (5,0 gramos/litro)
o Rojo neutro (0,03 gramos/litro)
o Cristal Violeta (0,001 gramos/litro)
o Agar (13,5 gramos/litro)

Por ultimo se saca un inoculo de las colonias del medio MacConkey y se traspasa
a cada uno de los medios para las pruebas bioquímicas, Indol, RM-VP y Citrato.
o Indol (positivo con anillo rojo)
 La prueba indol es un ensayo cualitativo utilizado para diferenciar
microorganismos en base a la capacidad para separar indol a partir
de L-triptófano. Es necesario el crecimiento previo del
microorganismo en estudio en medios de cultivo con alto contenido
de L-triptófano. Al agregar el reactivo de Ehrlich al medio de cultivo,
el indol generado se combina con el grupo aldehído del p-
dimetilamino benzaldehído del reactivo incorporado y se forma un
complejo de color rojo
 Contiene lo siguiente:
o Solución alcohólica de p-dimetilamino benzaldehído.
o RM-VP (positivo de color rojo)
 En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes
necesarios para el desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de
carbono fermentable. La glucosa puede ser metabolizada por
microorganismos a través de distintas vías metabólicas. Según la via
utilizada, se originarán productos finales ácidos o productos finales
neutros. Esta diferencia en el metabolismo bacteriano podría ser
reconocida por la adición de un indicador como el rojo de metilo, para
revelar la presencia de productos ácidos, y por la adición de alfa
naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la presencia de
productos finales neutros.
 Contiene lo siguiente:
o Pluripeptona (7,0 gramos/litro)
o Glucosa (5,0 gramos/litro)
o Fosfato dipotásico (5,0 gramos/litro)

Citrato (negativo de color azul)

 En el medio, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno
y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos
componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales
de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor
enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, el azul
de bromotimol es el indicador de pH, que vira a color azul en medio
alcalino y el agar es el agente solidificante. El medio de cultivo es
diferencial en base a que microorganismos capaces de utilizar el
citrato como única fuente de carbono usan sales de amonio como
única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de
alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas
bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo
tricarboxilico. El desdoblamiento del citrato genera progresivamente,
oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio
alcalino, da origen a ácidos orgánicos que al ser utilizados como
fuente de carbono producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El
medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de
citrato permeasa.
 Contiene lo siguiente:
o Citrato de sodio (2,0 gramos/litro)
o Cloruro de sodio (5,0 gramos/litro)
o Fosfato dipotásico (1,0 gramos/litro)
 o Fosfato monoamónico (1,0 gramos/litro)
o Sulfato de magnesio (0,2 gramos/litro)
o Azul de bromatimol (0,08 gramos/litro)
o Agar (15,0 gramos/litro)

Protocolos de técnicas utilizadas en el análisis

Técnica de los tubos múltiples
Etapa Presuntiva
1. Primero se preparan 3 series de 5 tubos de ensayo con LST.
2. Luego se flamea la botella y se pipetean 10 mL de muestra a la primera
serie de tubos de ensayo.
3. Se pipetea 1 mL de muestra a la segunda serie de tubos de ensayo.
4. Se pipetea 0,1 mL de muestra a la tercera serie de tubos de ensayo.
5. Se incuban todos los tubos por 48 horas a 37°C.
6. Se verifican los resultados para identificar tubos positivos que estén turbios
y tengan presencia de gas en la campana de durham para pasar al análisis
del Test Confirmativo.
Etapa Confirmativa
7. De cada tubo positivo del test presuntivo se debe sembrar con asa loop en
tubos de ensayo con medio caldo brillante y medio caldo EC, todos estos
tubos deben llevar la campana de durham.
8. Se siembran 3 series en el medio caldo brillante en la misma proporción
que en los tubos de ensayo iniciales, es decir, en 10, 1 y 0,1 mL según
corresponda y se incuba a 35-37 °C. Este medio detecta coliformes totales.
9. Se repite el mismo proceso anterior con los tubos de ensayo con el medio
EC y se incuba a 44.5 °C. Este medio detecta coliformes fecales.
10. Se verifican los resultados para identificar tubos positivos que estén turbios
y tengan presencia de gas en la campana de durham, tanto para los tubos
con verde brillante, como el caldo EC.
11. Se anota el NMP tanto para el caso de coliformes fecales, tubos caldo EC y
el NMP para coliformes totales, utilizando la tabla con los valores
correspondientes.
Etapa Completa
12. Se selecciona un tubo de ensayo con medio EC positivo.
 13. Se toma un inoculo con asa loop para sembrar en medio de cultivo
MacConkey con la técnica de agotamiento por estrías.
14. Se inocula el medio entre 18-48 horas a 33-37 °C.
15. Se verifica la presencia de colonias fermentadoras de lactosa, pudiéndose
observar colonias de color rosadas-rojizas en caso de ser positiva.

Técnica Pruebas bioquímicas

1. A partir de las colonias fermentadoras de lactosa en el medio de cultivo
MacConkey, se toma un inoculo para traspasarlo a un medio Indol, Citrato y
RM-VP.
2. Incubar muestras durante 18-24 horas a 37°C.
3. Verificar resultados de pruebas bioquímicas para identificar genero del
microorganismo coliforme en la muestra inicial.