PROTEÍNAS: EXTRACCIÓN, CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE LAS PROTEÍNAS

DE LA LECHE
Conde Bustos, Daniela1; Rodríguez Rodríguez, Ana Gabriela2
Abstract
In the present laboratory the objectives are to experimentally determine the electrical point of a
protein found in milk, to calculate the protein concentration in a test sample using
spectrophotometry and to know the principles of electrophoresis and how it relates to the
identification of proteins. To meet all these objectives, first the protein to be analyzed was
isolated from the test sample (milk) and with the help of acetic acid, which was casein, to
determine its isoelectric point, a graph of pH vs Absorbance was made and the pI was
determined as the point of highest absorbance in the graph, the result obtained was 4,57. To
quantify the proteins, present in the milk sample, an electrophoresis process was carried out and
the results were analyzed.

Introducción
La leche es el fluido biológico que segregan las hembras de los mamíferos y cuyo papel es
aportar los nutrientes y la energía necesarios para el crecimiento y el desarrollo de las crías
durante los primeros meses de vida. un alimento básico en nuestro día a día, aporta gran cantidad
de vitaminas, entre ellas la tiamina, riboflavina, ácido pantoténico y vitaminas A, D y K,
proteínas como Caseína, Beta-lactoglobulina, Alfa-lactoalbúmina, Lactoferrina, Lactoperoxidasa,
Inmunoglobulinas, Lisozima y minerales como el calcio, potasio, sodio, fósforo y metales en
pequeñas cantidades. Una porción de 200 mL de leche de vaca puede aportar específicamente
entre 110 y 130Kcal, 6,2 g de proteínas y 7,6 g de grasas, aproximadamente el 80% de su
contenido es agua. A pesar de poseer gran contenido nutricional la leche carece de hierro y
vitamina C.

1
Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería, Universidad de la Sabana, Chía, Colombia. Correo electrónico:
danielacobu@unisabana.edu.co

2
Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería, Universidad de la Sabana, Chía, Colombia. Correo electrónico:
anarodrrod@unisabana.edu.co
 Tabla 1. Información nutricional de una porción de leche entera. (Alpina, 2020)

En su consumo, para poder aprovechar y usar todos sus nutrientes se deben dar una serie de
pasos, una vez la leche ha sido consumida nuestro organismo se encarga de romper este alimento
en nutrientes y estos viajan a través del torrente sanguíneo para convertirse en combustible.

Imagen 1. Composición de la leche (Sceni, Capello, Igartúa, 2017)

Dentro de las numerosas proteínas que contiene la leche se encuentra la caseína, constituye el
80% del total de proteínas encontradas en la leche, se encuentra en forma de complejo soluble de
calcio y fosforo y está conformada por varios tipos de moléculas, la alfa-caseína, la beta-caseína,
la kappa-caseína y la gamma-caseína.
La alfa-caseína se divide en alpha(α1). “La caseína αs1 es la mayoritaria en la leche de vaca. La
variante más común tiene 199 aminoácidos en su secuencia, con 8 ó 9 grupos fosfato. Desde el
punto de vista estructural, está formada por tres regiones hidrofóbicas, con dos de ellas situadas
en los extremos (aminoácidos 1-41, 90-113 y 132-199), y una zona muy polar (entre los
aminoácidos 42 y 80), en la que se encuentran todos los grupos fosfato menos uno, lo que le da
una carga neta negativa muy importante al pH de la leche (alrededor de 6,6). La caseína αs1 de
vaca contiene 17 restos de prolina, distribuidos a lo largo de toda la cadena, lo que hace que tenga
muy pocas zonas con estructura secundaria organizada. La asociación con otras moléculas de
caseína se produce a través de interacciones hidrofóbicas en las que está implicada
fundamentalmente la zona situada entre los aminoácidos 136 y 196” (Calvo, 2016), y la alpha(α2)
formada por 207 aminoácidos siendo más hidrofílica que la α1 –, La alfa caseína no es soluble en
la leche al igual que la beta- caseína que es la más hidrofóbica y ambas son fosfoproteínas que se
pueden precipitar con ayuda de iones de calcio. La kappa-caseína es la que permite que la alfa y
la beta caseína sean solubles al ser mezcladas. A diferencia de las dos primeras la kappa-caseína
tiene un bajo contenido de fosfatos y un alto contenido de carbohidratos. “La caseína κ tiene una
estructura claramente distinta de la de las otras caseínas. En primer lugar, es algo más pequeña,
estando formada, en la vaca, por 169 aminoácidos. Además, está muy poco fosforilada, teniendo
solamente un grupo de fosfato. Esto hace que interaccione con el ión calcio mucho menos que las
otras caseínas. Sin embargo, comparte con la caseína β la propiedad de tener zonas
predominantemente hidrofílicas e hidrofóbicas bien marcadas y separadas.” (Calvo, 2016)
Al mezclar estas tres moléculas se forma un compuesto en forma de micela, de tamaños entre los
50 y 500 nanómetros. Se cree que su estructura esta formada por submicelas unidas entre si a
través de puentes fosfato. Lo que permite que se vuelva soluble es la acomodación exterior de los
carbohidratos en la kappa-caseína, la otra parte de su superficie se da para la unión de esta con la
alfa y beta caseína.

Metodología
Para la extracción de la caseína se calentó en un vaso de precipitado de 50 a 100 mL de agua
destilada a 38°C, se añadieron 50mL de leche y a esta mezcla se agregó gota a gota con bureta y
con agitación ácido acético 1N, hasta que se observó un precipitado (leche cortada). Esta mezcla
se centrifugó (2 min a 5000rpm) y se guardó el sobrenadante para utilizar en el procedimiento de
electroforesis (solución A). El precipitado fue lavado con 20mL de Etanol.
Se centrifugó nuevamente (2 min a 5000rpm) y se guardó el sobrenadante para procedimiento de
electroforesis (solución B). A continuación, se adicionaron 10mL de éter etílico, y se centrifugó
(2 min a 5000rpm). El sobrenadante fue desechado.
El precipitado obtenido, el cual correspondía a la caseína se secó, se pesó y se calculó el
rendimiento de su extracción.
Una vez realizada la extracción se mezclaron 241,8 mg de caseína en un vaso de precipitado de
50mL con 20mL de agua destilada y 5mL de NaOH 1N, se agitó hasta completar la disolución
total de la caseína. Una vez disuelta la caseína se vertió a un matraz aforado de 50mL, se
adicionaron 5mL de ácido acético 1N y se diluyó con agua destilada hasta 50mL. La solución que
se obtuvo era clara y limpia y se guardó como solución C.
Para determinar el punto isoeléctrico se colocaron diferentes reactivos en 10 tubos de ensayo
Tubo Acetato Ácido Ácido pH
sódico acético acético resultante
 0,1N 0,01N aproximado
0,1N (ml)
(ml) (ml)
1 0,5 9,5 - 3,2
2 1,0 9,0 - 3,6
3 1,5 8,5 - 3,8
4 2,0 8,0 - 4,0
5 3,0 7,0 - 4,2
6 4,0 6,0 - 4,5
7 6,0 4,0 - 4,7
8 8,0 2,0 - 5,1
9 6,0 - 4,0 5,5
10 8,0 - 2,0 6,1
Tabla 2. Volúmenes a utilizar de cada uno de los reactivos para determinación del pI.

Se midieron los pH de los vasos, los cuales debían cubrir un rango aproximado entre 3,0 y 6,5. Y
se anotaron los valores, posterior a esto se añadió 1mL de la solución de caseína a cada vaso. Se
agitó suavemente y se esperó por aproximadamente 3 minutos, pasados los 3 minutos se midió la
absorbancia de cada muestra a 640 nm con cubetas de colorimetría de 1cm de paso óptico. Se
anotaron los resultados pH vs A y se determinó el valor del punto isoeléctrico.
Una vez se halló el pI de la caseína se procedió con la cuantificación de las proteínas presentes en
la leche para esto se prepararon 10 tubos con los siguientes reactivos
(ml)Albumina

Extracto (ml)

Biuret (ml)
Leche (ml)
Agua (ml)
Tubo

B 1,8 - - - 1,2
1 1,6 0,2 - - 1,2
2 1,4 0,4 - - 1,2
3 1,2 0,6 - - 1,2
4 1,0 0,8 - - 1,2
5 0,8 1,0 - - 1,2
Leche 1,79 - 0,01 - 1,2
Sln A - - - 1,8 1,2
Sln B - - - 1,8 1,2
Sln C - - - 1,8 1,2
Tabla 3. Volúmenes a utilizar de cada una de las soluciones en la cuantificación de proteínas.
Los tubos se agitaron suavemente y se esperó 15min a que se desarrollara el color en la oscuridad
y medir la absorbancia de cada tubo a 595nm.
Para el proceso de electroforesis se preparó los geles de apilamiento y corrida.
Para la preparación del gel de corrida se usaron los siguientes reactivos y sustancias
Solución Volumen
 Agua destilada 3,4mL
Acrilamida-bisacrilamida 30% 3.4mL
Tris/HCl 1.5 M pH 8.8 2.5mL
SDS 10% 100µL
Persulfato de amonio 10% 150µL
TEMED 10µL
Tabla 4. Volúmenes a utilizar de los reactivos para la preparación del gel de corrida.

Para su ensamble se vertió cuidadosamente la solución de acrilamida con una pipeta Pasteur en el
contenedor representado por 2 vidrios sujetos al cassette y distanciados por unos separadores. Se
dejó aproximadamente 1,5cm de distancia entre la solución de acrilamida y el vidrio frontal.
Luego de añadido el gel de corrida y previo a la polimerización, se añadió suavemente agua
destilada para evitar que el borde del gel se polimerizara de manera irregular.
Después de la preparación del gel de corrida de procedió con la preparación del gel de
apilamiento, para esto se usaron los siguientes reactivos y sustancias
Solución Volumen
Agua destilada 6,1 mL
Acrilamida-bisacrilamida 30% 1,3mL
Tris/HCl 1M pH 6.8 2,5 mL
SDS 10% 100µL
Persulfato de amonio 10% 50µL
TEMED 10µL
Tabla 5. Volúmenes a utilizar de los reactivos para la preparación del gel de apilamiento.

Una vez se obtuvo el gel se vertió suavemente el contenido sobre el gel de corrida polimerizado y
se colocó el peine cuidadosamente para que no se formaran burbujas. Se espero
aproximadamente 10 minutos hasta la polimerización de la acrilamida.
Cuando el gel de apilamiento polimerizó, se colocó el cassette en el tanque de electroforesis con
aproximadamente 500mL del tapón de corrida en el cual se encontraban los electrodos
sumergidos. Se quitó cuidadosamente el peine para que quedaran libres los pocillos del gel. Se
colocaron cuidadosamente las muestras con una micropipeta. Las muestras fueron sometidas a
calentamiento a 100°C por 5 minutos e inmediatamente se sacaron a hielo, luego se sembraron
20µL de las muestras en los pocillos de los geles de la electroforesis.
Las muestras fueron sometidas a electroforesis aplicando una corriente de 30mA y se observó la
corrida por 40 minutos.
Finalizada la corrida se extrajeron los vidrios del cassette cuidadosamente y se separaron de
manera tal que el gel quedó posado sobre uno de los vidrios. Se sumergió el gel en una solución
colorante (1g de azul de Coomassie, 459ml de metanol, 450ml de agua destilada y 100ml de
ácido acético glacial) por 3 horas. Transcurrido el tiempo, se sumergió el gel en una solución
decolorante (100ml metanol, 100ml de ácido acético glacial, 800ml de agua destilada).
Por último, se observaron las bandas proteicas y se medió la distancia recorrida por cada banda
para así determinar su PM y se definió que posible banda corresponde a que posible proteína.

Resultados
Después de realizar la práctica de laboratorio se obtuvieron los siguientes resultados y con ellos,
se realizaron las curvas de calibración para las muestras dadas.
Absorbancia Concentración
0,108 0,3333
0,156 0,6666
0,192 1
0,261 1,3333
0,305 1,6666
Tabla 6. Resultados Absorbancia leche entera.

Concentracion molar vs absorbancia

0.35

0.3
f(x) = 0.15 x + 0.05
Absorbancia

0.25 R² = 0.99

0.2

0.15

0.1
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
Concentracion

Figura 1. Curva de calibración leche entera.

Luego de realizar las respectivas curvas de calibración para leche entera, se registraron los datos
de absorbancia de las distintas muestras (Leche entera, Sln A, Sln B y Sln C) y de las muestras de
caseína, donde se obtuvo lo siguiente:

Solución pH Absorbancia
1 3,79 0,504
2 4,12 0,527
3 4,21 0,542
4 4,27 0,553
5 4,67 0,536
6 4,85 0,534
7 5,03 0,386
 8 5,22 0,346
9 5,49 0,353
10 5,37 0,344
Tabla 7. Resultados Absorbancia muestras de caseína Leche Entera.

pH vs Absorbancia caseina
0.6
0.55
Absorbancia

0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6
pH

Figura 2. Gráfica pH vs Absorbancia caseína Leche Entera.

Como último procedimiento se realizó la electroforesis y se obtuvo la siguiente figura.

Figura 3. Imagen gel de la electroforesis.

Discusión de resultados
En primer lugar, para la curva de calibración realizada con la leche entera se pudo obtener la
ecuación de la recta, la cual es; y = 0,1497x + 0,0547. En donde la pendiente corresponde al
coeficiente de absortividad molar de la albumina utilizada en el laboratorio que fue de 0,1497.
Como se observa en la figura 1. no se realizaron correcciones en la curva de calibración ya que
esta quedo adecuadamente y se demostró utilizando el R2 el cual tuvo un valor de 0,9915 lo cual
es muy cercano a 1. Por otro lado, respecto a la absorbancia de la muestra de leche entera, se
pudo observar en la tabla 7 que el pH fue aumentando conforme aumenta la absorbancia, es
decir, tienen un comportamiento directamente proporcional, esto se evidenció en cada solución al
igual que la absorbancia en la leche entera.
Para determinar el punto isoeléctrico de la caseína se verificó el comportamiento de la proteína a
distintos valores de pH, para esto se utilizaron las gráficas de pH vs Absorbancia (Figura 2),
identificando así el pH de mayor actividad, con esto se puede definir el punto isoeléctrico como
el valor en el que se presenta un mayor nivel de absorbancia dando así un punto isoeléctrico de
4,27 en la leche entera.
Finalmente, el resultado del gel de la electroforesis figura 3 no se pudo estudiar con el programa
dado para realizar el análisis, sin embargo, se realizó un análisis visual para la distancia recorrida,
y se pudo concluir que la concentración de la muestra A que fue la que no corrió, posiblemente
cuenta con errores experimentales al momento de preparar la muestra o de agregar el reactivo de
tinción, mientras que las muestras B y C pesan los mismo, la muestra L es la de mayor peso
molecular ya que su banda es la más baja. Según un video visto las proteínas siguientes
corresponden al valor de Kda (2-01-2019).
Proteína kDa
Albumina 85
β-globulinas 35
β-lactoglobulinas 18,4
Kappa Caseína 19
as1 Caseína 23
as2 Caseína 25
b-Caseína 24
Tabla 8. Proteína correspondiente al valor de Kda.
Recomendaciones
- Al momento de preparar las muestras tener mucho cuidado y poner las tinciones.
- Las soluciones proteicas deben ser preparadas poco tiempo antes del experimento para
evitar una posible modificación o degradación de las proteínas.
- Filtrar adecuadamente las muestras ya que podrán encontrarse interferencias con otros
componentes como la grasa de la leche.
- Dejar reposar la caseína el tiempo necesario para que sedimenten los componentes que no
son de interés.
Conclusiones
- En conclusión, las proteínas son macromoléculas fundamentales para los seres vivos,
como se ha mencionado anteriormente, por esta razón es importante tener métodos
seguros para la cuantificación y caracterización de estas.
 - Se logró determinar la presencia de distintos tipos de caseínas (gama globulinas y beta 1-2
globulinas) en la muestra de leche trabajada y así mismo se logró identificar el punto
isoeléctrico el cual fue de 4,27 de la misma como soporte de la práctica y el análisis
realizado a lo largo del documento.
- Al realizar la curva de calibración no se tuvo que corregir o descartar ningún dato, debido
a que el R2 tuvo un valor muy cercano a 1 el cual fue de 0,9915.
- Las proteínas como la caseína son susceptibles a sufrir cambios en su estructura por
factores como el cambio vigoroso de pH, altas temperaturas y fuerzas de centrifugación
fuertes.

Bibliografía
Agudelo Gómez, D. A., & Bedoya Mejía, O. (2005). Composición nutricional de la leche de
ganado vacuno. Revista Lasallista de investigación, 2(1).
Alpina. (2020). Leche Entera Alpina | Productos Lácteos | Alpina Colombia. Alpina.
https://www.alpina.com/productos/lacteos/leche-entera-alpina
Calvo, M. (2016). CASEINAS. Bioquímica de los alimentos.
http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/proteins/caseina.html
Cano, H., Cruz, J., & Mendez, S. (2013). Fraccionamiento de las proteínas de la leche por pI y
precipitación salina. Manual prácticas de laboratorio de bioquímica. (1), 42-43.
D.M. (2020, 6 agosto). Leche. CuidatePlus.
https://cuidateplus.marca.com/alimentacion/diccionario/leche.html
Farrell HM, Jiménez-Flores R, Bleck GT, Brown EM, Butler JE, Creamer LK, Hicks CL, Hollar
CM, Ng-Kwai-Hang KF y Swaisgood HE. 2004. Nomenclature of the Proteins of Cows’ Milk—
Sixth Revision. Recuperado Septiembre 02, 2020.
Laboratorio Genética animal Mascolab. (2-01-2019). Vídeo informativo — Electroforesis de
proteínas. MP4. Recuperado septiembre 01 de: https://www.youtube.com/watch?
v=Y7KwmBAISUI.
Roca, A. M. (2017). CASEINAS. Puleva.
http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/proteins/caseina.html
Swaisgoo HE. 1993. Review and update of casein chemistry. Recuperado Septiembre 02, 2020.
Universidad de Valencia. (2016). Espectroscopia. Recuperado el 13/03/2018 de
https://www.uv.es/qflab/2016_17/descargas/cuad ernillos/qf1/castellano/Teoria/Absorbancia.pdf
Zimmermann, K., & Espinoza, H., (2010). Estructura y funcionalidad de proteínas lácteas: Efecto
de modificaciones inducidas por medios físicos, químicos y enzimáticos. Departamento de
Ingeniería Química, Alimentos y Ambiental, Universidad de las Américas Puebla Sta. Catarina
Martir, Choula, Puebla. C.P. 72820.