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Materiales
Muestra de arroz
Bolsas para Stomacher
Agua peptona
Frascos tapa azul
Tubos de ensayo
Agar oxitetraciclina glucosa extracto
de levadura (OGY)
Cajas de Petri estériles
Pipetas de 1 ml
Pipetas de 10 ml
Pipeteadores
Fig 1. Procedimiento para el recuento de mesófilos
aerobios en muestras de alimentos Fuente: Castillo Gradilla
Valencia SY. Manual de procedimientos de análisis
de alimentos. Equipos
Balanza
Recuento de mohos y levaduras Stomacher
Autoclave
Los hongos y las levaduras se encuentran Incubadora a 35 +/- 2°C
ampliamente distribuidos en el ambiente,
pueden encontrarse como flora normal de un Procedimiento (Fig 2)
alimento, o como contaminantes en equipos 1. Se midieron 11 g de la muestra (arroz).
mal sanitizados. Ciertas especies de hongos 2. Se agregaron a una bolsa para
y levaduras son útiles en la elaboración de Stomacher junto con 90 ml de agua
algunos alimentos, sin embargo también peptona.
pueden ser causantes de la descomposición 3. Se homogenizó en Stomacher por 40 s.
de otros alimentos. Debido a su crecimiento 4. El homogenizado obtenido
lento y a su baja competitividad, los hongos -1
correspondió a la dilución 10 .
y levaduras se manifiestan en los alimentos 5. En 1 tubo de ensayo con 9 ml de agua
donde el crecimiento bacteriano es menos peptona estéril se agregó 1 ml de la
favorable. Por lo tanto pueden ser un dilución 10-1 (homogenizado anterior),
problema potencial en alimentos lácteos preparando así la dilución 10-2.
fermentados, frutas, bebidas de frutas, 6. A partir del tubo de ensayo con la
especias, oleaginosas, granos, cereales y sus dilución 10-2, se tomó 1 ml y se agregó
a otro tubo de ensayo con 9 ml de agua 11. Con los datos del recuento se aplicó la
peptona estéril, correspondiendo a la siguiente fórmula que dio como
dilución 10-3 y así sucesivamente se resultado la cantidad de UFC de
fue tomando 1 ml de cada dilución mohos y levaduras / g de arroz.
realizada y agregándolo al siguiente ∑C
tubo hasta llegar al número de N=
V ( n 1+0.1 ( n 2 ) ) d
diluciones deseadas según lo requiera
Donde
la muestra y según el análisis que se
∑ C = Sumatoria de las colonias contables
realiza; en este caso se realizaron 3
de cada caja
diluciones (10-1, 10-2 y 10-3).
V = volumen de la muestra inoculada en
7. Una vez listas las diluciones se tomó 1
cada caja
ml de las dos últimas (en este caso 10-2
n1 = número de cajas retenidas de la primera
y 10-3) y se agregó a una caja de Petri
dilución
estéril, sirviendo a su vez el medio de
n2 = número de cajas retenidas de la
cultivo (OGY); esto se realizó por
segunda dilución
duplicado para cada dilución utilizada.
d = factor de dilución de la primera dilución
8. Para mezclar el inóculo con el medio
de cultivo y lograr una adecuada
siembra en profundidad, se realizaron
los siguientes movimientos:
a. Mover la caja de arriba hacia
abajo 5 veces
b. Rotar la caja cinco veces en el
sentido de las agujas del reloj
c. Mover la caja 5 veces haciendo
ángulo recto sobre el movimiento
d. Rotar la caja cinco veces en el
sentido contrario de las agujas del
reloj
9. Una vez solidificó el medio se incubó
a temperatura ambiente (22°C +/- 2°C)
durante 5 a 7 días.
10. Al pasar una semana se sacaron los
medios de la incubadora y se Fig 2. Procedimiento para el recuento de mesófilos
colocaron sobre él cuenta colonias aerobios en muestras de alimentos Fuente: Castillo
para realizar el recuento de las Valencia SY. Manual de procedimientos de análisis
de alimentos.
colonias de microorganismos Coliformes totales y termotolerantes
mesófilos (únicamente se tuvieron en
cuenta las placas que poseían entre 30 Las coliformes son una familia de
y 300 colonias). bacterias que se encuentran comúnmente en
las plantas, el suelo y los animales, Autoclave
incluyendo los humanos. La denominación Incubadora a 35 +/- 2°C
de Coliformes se le otorga a todo aquel
grupo de bacterias que tienen ciertas Procedimiento (Fig 3)
características bioquímicas en común y son
de mucha importancia como indicadores de 1. Se midieron 11 g de la muestra (arroz).
contaminación del agua y de los alimentos. 2. Se agregaron a una bolsa para
El empleo de estos como microorganismos Stomacher junto con 90 ml de agua
indicadores se basa en que son destruidas peptona.
por los tratamientos de pasteurización, 3. Se homogenizó en Stomacher durante
térmicos o clorados de las aguas con gran 40 s.
facilidad. Por esto, la presencia de altos 4. El homogenizado obtenido
-1
valores de enterobacterias, en especial correspondió a la dilución 10 .
coliformes en los alimentos, es síntoma de 5. En 1 tubo de ensayo con 9 ml de agua
fallos en el proceso de elaboración o de peptona estéril se agregó 1 ml de la
conservación que pueden acarrear riesgos dilución 10-1 (homogenizado anterior),
para el consumidor. preparando así la dilución 10-2.
6. A partir del tubo de ensayo con la
dilución 10-2, se tomó 1 ml y se agregó
Materiales a otro tubo de ensayo con 9 ml de agua
peptona estéril, correspondiendo a la
Muestra de queso
dilución 10-3. Para esta prueba se
Bolsas para Stomacher
realizaron solo 3 diluciones que es lo
Agua peptona
recomendado.
Frascos tapa azul
7. Ya con las 3 diluciones preparadas se
Tubos de ensayo procedió a realizar las pruebas
Cajas de Petri estériles presuntivas, para lo cual se tomó 1 ml
Pipetas de 10 ml de cada una de las diluciones (10-1, 10-
Pipeteadores 2
y 10-3) y se agregó a un tubo con
Asa de redondela caldo lactosado bilis verde brillante al
Gradilla 2% y campana de Durham en su
Campanas de Durham interior; utilizando en total 3 tubos
Caldo lactosado bilis verde brillante al para cada dilución.
2% 8. Los 9 tubos se agitaron suavemente y
Agar Eosin Methylene Blue (E.M.B) se incubaron a 35ºC +/-2ºC durante
Caldo Triptófano 24-48 horas.
Reactivo de Kovac`s 9. Una vez transcurridas las 48 horas, se
Equipos anotaron los tubos que mostraron
producción de gas y turbidez y se
Balanza
procedió con la prueba confirmatoria.
Stomacher
10. La prueba confirmativa se realizó para 17. Por último, para el cálculo del NMP de
confirmar que los tubos anteriores con organismos coliformes por gramo de
producción de gas fueran realmente arroz se utilizó la siguiente fórmula:
positivos a organismos del grupo
coliforme, para lo cual se sembraron NMP de la tabla X factor de dilución intermedio
=NMP/ g de
por estría una asada de cada uno de los 100
tubos positivos de caldo brilla en la Fig 4. Tabla NMP
superficie de una placa con agar EMB.
11. Las placas inoculadas se incubaron de
forma invertida a 35ºC +/-2ºC durante
24 horas.
12. Pasadas las 24 horas se realizó lectura
de las colonias típicas de coliformes y
se consideraron como positivas para
coliformes fecales aquellas que
presentaron colonias verdosas con
brillo metálico y centro negro azulado.
13. Simultáneamente, de los tubos con
producción de gas se inoculó 1 ml en
caldo triptófano y se incubó a 35ºC +/-
2ºC durante 24horas.
14. Transcurrido este tiempo se le agregó
a cada tubo 4 gotas del reactivo de
Kovac’s y se consideró positivo
cuando ocurrió la formación del anillo
indol.
15. Al realizar estas dos pruebas
confirmativas, se anotó el número de
tubos confirmados como positivos
para organismos coliformes en cada
dilución.
16. Para obtener el NMP, se observó en
cada una de las tres diluciones (10-1,
10-2 y 10-3) el número de tubos en los
que se confirmó la presencia de
coliformes; se buscó en la tabla del
NMP (Fig 4) y se anotó el resultado
correspondiente al número de tubos
positivos de cada dilución.
Bolsas para Stomacher
Agua peptona
Frascos tapa azul
Tubos de ensayo
Agar sulfito polimixina sulfadiazina
(SPS)
Pipetas de 1 ml
Pipetas de 10 ml
Pipeteadores
Gradilla
Fig 3. Procedimiento para el recuento de mesófilos
aerobios en muestras de alimentos Fuente: Castillo
Valencia SY. Manual de procedimientos de análisis Equipos
de alimentos. Balanza
Stomacher
Autoclave
Esporas de Clostridium sulfito reductor
Incubadora a 35ºC +/-2ºC
Los Clostridium son un género de
bacterias que se caracterizan por producir Procedimiento (Fig 5)
esporas terminales, tienen forma de bacilos. 1. Se midieron 11 g de la muestra (arroz).
Son anaerobias y Gram positivos. Los 2. Se agregaron a una bolsa para
Clostridium sulfitos reductores están Stomacher junto con 90 ml de agua
constituidos por un grupo de bacilos peptona.
esporulados pertenecientes al género 3. Se homogenizó en Stomacher durante
Clostridium que se caracterizan por reducir 40 s.
el sulfito y por ser colonizadores habituales 4. El homogenizado obtenido
-1
del intestino humano y de algunos animales. correspondió a la dilución 10 .
Esta calidad unida a la alta resistencias de 5. En 1 tubo de ensayo con 9 ml de agua
sus esporas le da gran valor como peptona estéril se agregó 1 ml de la
indicadores de contaminación fecal de dilución 10-1 (homogenizado anterior),
carácter no reciente tanto en agua como en preparando así la dilución 10-2.
alimentos. En su mayoría son saprofitos, 6. A partir del tubo de ensayo con la
pero, los patógenos pueden causar graves dilución 10-2, se tomó 1 ml y se agregó
enfermedades como gangrena gaseosa, a otro tubo de ensayo con 9 ml de agua
botulismo, tétanos, infecciones de la piel y peptona estéril, correspondiendo a la
partes blandas entre otras relacionadas con dilución 10-3 y así sucesivamente se
las intoxicaciones alimentarias. fue tomando 1 ml de cada dilución
realizada y agregándolo al siguiente
Materiales tubo hasta llegar al número de
Muestra de queso diluciones deseadas según lo requiera
la muestra y según el análisis que se
realiza; en este caso se realizaron 6 RESULTADOS Y COMPARACIÓN
(10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 y 10-6). CON LA NORMA
7. Se tomó 1 ml de la última dilución y
Mesófilos
se agregó en un tubo de ensayo
totalmente estéril.
8. El tubo con el inóculo se calentó a
80°C durante 10 min y luego se dejó
enfriar rápidamente en agua del grifo.
9. Se adicionaron 10 ml de agar SPS y se
dejó solidificar.
10. Una vez sólido, se adicionó una
segunda capa del medio SPS y se dejó
solidificar nuevamente.
11. El tubo se incubó a 35ºC +/- 2ºC por Fig 6. Placas de agar PCA, dilución 10-2 de una
72 horas. muestra de arroz. Fuente propia.
12. Diariamente se observó el tubo debido
a la producción de color negro por la
formación de H2S que podía invadir el
medio siendo difícil su lectura.
13. La lectura se realizó con base en los
tubos que presentaron ente 5-50
colonias de color negro y para los
resultados se calculó el número total
de colonias multiplicándolo por el
inverso de la dilución. Fig 7. Placas de agar PCA, dilución 10-3 de una
muestra de arroz. Fuente propia.
10-2 = incontables
10-3 = 25 y 54
25+54 79
N= =
1 ml ( 0+ 0.1 ( 2 ) ) 0.01 0.002
¿ 39.500 UFC /g
Mohos y levaduras
143+33+34 210
N= =
1 ml ( 1+0.1 ( 2 ) ) 0.01 0.002
¿ 9.545 UFC /g