LABORATORIO QUÍMICO

INTRUCTIVO PARA CONTEO CELULAR DE MICROALGA

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Versión 1 Vigencia:
DBOCC–01

CONTEO CELULAR

1. INTRODUCCIÓN

Las microalgas requieren elevados volúmenes de medios de cultivo para su

crecimiento a gran escala, lo que conlleva mayores costos de operación asociados al
suplemento de nutrientes. La implementación de una estrategia eficiente para
combinar el tratamiento de efluentes líquidos con la producción de biomasa
microalgal como materia prima para biocombustibles permitirá minimizar el uso de
agua fresca que es un recurso muy preciado actualmente. Un tratamiento de aguas
residuales a base de algas es más ambientalmente sustentable que algunas otras
formas de tratamiento ya que este no genera contaminantes adicionales, si se hace
uso de la biomasa generada. La habilidad de las microalgas para crecer en ambientes
ricos en nutrientes y acumular metales del agua residual, las hace atractivas para
tratamientos de agua sostenibles y de bajo costo (Mendoza J, 2019).

2. OBJETIVO:
Lograr una concentración óptima de células de la microalga chlorella vulgaris

3. ALCANCE:
Microalga chlorella y agua residual de remojo

4. RESPONSABILIDAD:
Todo el personal de laboratorio químico de Curtiembre Lizberth SAC

5. CONTENIDO:
5.1 PRINCIPIO
5.1.1. Microalgas
Las microalgas son una especie de alga verde de forma elipsoidal, la cual crece en
forma de células simples. Las microalgas son microorganismos microscópicos (2-
200 um). Pertenece a la división Chlorophyta y a la clase de las Chlorophyceae.
Dentro de la gran gama de especies de microalgas, existen algunas especies poco
exigentes, que pueden vivir en condiciones extremas: cavernas, suelos desérticos,
hielos o nieves perpetuas, lagos hipersalinos, acídulos, alcalinos y con elevadas
temperaturas (Carbonell y Tamayo, 2018).

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5.1.2. Chlorella vulgaris

Según Infante (2011) menciona que la microalga chlorella por el tamaño que
presenta es posible observarla en microscopio, una célula individual mide 6/1000
mm de ancho; el color verde característico se debe al elevado contenido de clorofila
(Infante et al., 2011).
Estos microorganismos representan una materia prima que se caracteriza por tener
una alta tasa fotosintética, es decir que son de rápido crecimiento, tener adaptabilidad
ambiental, producciones mayores de biomasa y tasas de crecimiento superiores
comparadas con las plantas oleaginosas (Lee at al, 2012).

5.1.3. Variables de crecimiento

El crecimiento eficiente de microalgas en aguas residuales y su contenido en lípidos
depende de varios factores tales como el pH, la temperatura del medio de cultivo,
disponibilidad de luz, CO2 y la concentración de nutrientes esencial en el medio de
cultivo como el nitrógeno, fósforo y carbono orgánico, además de la relación entre
estos nutrientes. (Mendoza J., 2019)

5.1.4. Biomasa microalgal – aplicaciones

Entre sus ventajas más significativas de las microalgas encontramos su bajo costo de
tratamiento, la recuperación de los nutrientes en forma de biomasa que puede ser
empleada en diversos usos como para fertilizante, cosmética, medicina
biocombustibles, reducción de los niveles de CO2 atmosférico, entre otros
(Carbonel y Tamayo, 2018)

5.2. INTERFERENCIAS
5.2.1. Contaminantes perjudiciales

Entre los principales escollos que inhibe o perjudica el crecimiento de las células
son: Dureza, salinidad, hipoclorito de sodio, ácidos, etc.

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5.2.2 Pesticidas

La exposición de las células microalgales a agentes contaminantes como los

pesticidas puede inducir alteraciones en la morfología celular, tanto en lo que se
refiere al volumen y forma de las células como a alteraciones producidas a nivel
subcelular (cambios en la morfología de cloroplastos o mitocondrias, aparición de
inclusiones citoplasmáticas, alteración de las membranas, etc. (Esperanza M., 2017).

5.2.3 Actividad enzimática

La toxicidad ejercida por los contaminantes ambientales se puede reflejar en diversas

actividades enzimáticas, que pueden ser inducidas o inhibidas por la presencia del
agente tóxico. Generalmente se suelen estudiar actividades enzimáticas relacionadas
con mecanismos antioxidantes (catalasa, peroxidasa, glutatión reductasa, etc.), pues
los contaminantes ambientales suelen desencadenar un estrés oxidativo que puede
inducir mecanismos antioxidativos tanto enzimáticos como no enzimáticos, que de
este modo se pueden usar como biomarcadores de la toxicidad (Esperanza M., 2017).

5.3. EQUIPOS Y MATERIALES

 Jarrones cilíndricos de vidrio de 1,5 L; 2 L y 4 L

 Pipetas de 1 y 5 ml
 Vasos de precipitados 250 y 1000 ml
 Viales de vidrio con tapa
 Cámara de neubauer
 Cubreobjetos
 Microscopio binocular Greetmed
 Bomba de aire (acuario) RS electrical 1000 9L/min
 Micropipeta Boeco 10 L
 Cámaras de incubación lumínica
 Equipo de filtro al vacío
 Tapas de madera
 Mangueras de plástico
 Focos blancos
 Luxómetro digital
 Papel tisú
 Caja papel filtro whitman

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5.4. REACTIVOS
 Microalgas
 Fuente de nutrientes
 Agua destilada
 Hipoclorito de sodio

5.5. PROCEDIMIENTO

5.5.1. Limpieza y acondicionamiento de jarrones

Limpiar los jarrones, lavando con agua de caño 2 veces y un poco de detergente.
Posterior se enjuaga bien con agua de caño y agua destilada.

Mientras tanto, realizar agujeros a las tapas por el medio y pasar por ella las
mangueras, teniendo de un lado la piedra difusora y del otro extremo conectado a la
bomba de aire.

5.5.2. Preparación de cultivos

Se debe tener en cuenta que los porcentajes volumen/ volumen para preparar los
cultivos de microalga (en primera instancia para lograr una concentración óptima y
un buen volumen, se debe mezclar con agua destilada o desionizada) son:

 Microalgas 25% V/V

 Agua destilada 75% V/V
 Micronutrientes 1 ml

5.5.3. Montaje de área de crecimiento

En la cámara de incubación lumínica (como se puede observar en anexos) tiene 3

espacios: 1 foco, 2 focos y 3 focos. Esto es para el primer estudio y verificar a que
condición de luz o fotones lux, se logra un crecimiento óptimo. Con referencia a
esto, se puede lograr trabajar para futuros estudios en donde se ha de mezclar la
microalga con aguas residuales.

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5.5.4. Lectura óptica de células

Una vez que los cultivos hayan dado su punto de partida en la cámara de incubación
lumínica, se procede al conteo de células. El procedimiento es el siguiente:

 Se instala el microscopio, se limpian los lentes con papel tisú y se procede a

encender.

 Se limpia la cámara de neubauer, con agua destilada y secando con papel tisú,
también se limpia un cubreobjeto y se coloca encima del neubauer.

 Posterior a esto, se extrae con la micropipeta unos 10 microlitros de solución

de cultivo de los jarrones y se colocan por la parte media de entre el
cubreobjeto y el neubauer (en los días posteriores, cuando aumenten la
concentración celular, será necesario diluir en viales para tener una fácil
lectura en el microscopio).

 Se coloca el neubauer en el microscopio, y se va ajustando la lectura óptica

(en primer lugar a una dimensión de 4, una vez fijo se cambia a 10 y
finalmente a 40; colocándose en el primer cuadrante).

 Se comienza el conteo en las partes interiores del primer cuadrante,

anotándolos en una hoja o cuaderno, posterior se hace el mismo
procedimiento en el 4to cuadrante. Una vez listos se suma y se promedia para
tener el valor de número de células (si se hizo dilución, multiplicar por el
factor por ejemplo: Si diluyes a 5 ml, este valor se multiplica con 5)

 Una vez realizado el conteo, se acondiciona nuevamente el neubauer

lavándolo y secándolo, para en seguida realizar el siguiente conteo.

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5.5.5. Mezclado de microalgas con agua residual

Cuando se ha logrado una concentración celular mayor 1 x 10 6 cels/ml de microalgas

(Bayomed, 2019), es óptimo poder llevar a cabo su aplicación en biorremediación,
mezclándola con agua residual por lo que antes de ello se debe realizar las siguientes
etapas: Acondicionamiento, caracterización química y física. Posterior se realiza el
mezclado en la proporción que indique el nivel de estudio (al igual que los encisos
anteriores, las mezclas contenidas en jarrones se colocan en la cámara de incubación
lumínica, controlando su concentración celular interdiariamente y sin agregar
nutrientes).

5.5.6. Cosecha de biomasa microalgal

Una vez realizado el nivel de estudio asignado, la microalga ha cumplido con el

objetivo de descontaminar el agua residual, disminuyendo parámetros importantes
como dqo, dbo, etc. Por lo tanto, es momento de separar la biomasa microalgal de la
mezcla centrifugando, caracterizando y analizando a partir de sus propiedades su uso
en distintas aplicaciones.

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6. REFERENCIAS
Para la correcta redacción del presente instructivo se tuvo que consultar a los siguientes
documentos:

- Infante, C.; Angulo, E.; Zárate, A.; Florez, J. & Barrios, F., . (2011). Propagación de
la microalga Chlorella sp. En cultivo por lote: cinética del crecimiento celular.
Avances en ciencias , 3(2) pp: 159-164 .
- Mendoza Jorge. (2019). Influencia de la intensidad de luz y ph en la remoción de
materia orgánica (dbo5), de efluentes de remojo de curtiembre, utilizando microalga
chlorella vulgaris, a nivel laboratorio. Tesis para obtener maestría en Ecología y
Gestión Ambiental. Universidad Nacional José Faustino Sanchez Carrión: Arequipa
- Carbonell y Tamayo. (2018). Influencia de la iluminancia y tiempo de remoción de
materia orgánica, expresada en DBO5, de efluentes de remojo en curtiembres,
utilizando chlorella pyreneidosa en un fotobiorreator a escala laboratorio. Tesis para
obtener título en Ingeniería Química. Universidad Nacional de Trujillo.
- Esperanza M. (2017). Toxicidad ejercida por contaminantes acuaticos sobre
microalgas de agua dulce. Tesis para obtener el grado de doctor. Universidad Da
Coruña.
- Lee, D.Y., Park, J.J., Barupal, D.K. and Fiehn, O. (2012). System response of
metabolic networks in Chlamydomonas reinhardtii to total available ammonium.
Mol Cell Proteomics , 973-88.

Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:

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Responsable de Laboratorio Responsable de Proyecto Gerente General
Fecha: Fecha: Fecha
7. ANEXOS

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DISPOSICIÓN DE JARRONES CON CULTIVOS

PREPARACIÓN DE DILUCIONES

PREPARACIÓN DEL NEUBAUER

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ESQUEMATIZACIÓN DEL CONTEO CELULAR

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