“Año de la universalización de la salud”

UNIVERSIDAD ROOSEVELT

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE CIENCIAS

FARMACEÚTICAS Y BIOQUÍMICA

EL ESPECTROFOTOMETRO
AUTORES : QUISPE CALDERON, KENIA

ALBARRAN RIVERA, JHAN

MARTINEZ VIDAL, KENT

ESPINAL PEREZ, HELVA

SALHUANA JUAN DE DIOS, FIORELA

HUAMAN CCAHUIN, ERIKA

ASIGNATURA :

DOCENTE :

Huancayo – 2020
 DEDICATORIA

A nuestros padres y mis hermanos que me apoyan

incondicionalmente y son el equipo de soporte,

necesario para cumplir mis objetivos y metas.

 INTRODUCCION

Cada compuesto químico absorbe, transmite o refleja luz (radiación electromagnética) a lo largo de

un cierto rango de longitud de onda. La espectrofotometría es una medida de la cantidad que una

sustancia química absorbe o transmite.

Un espectrofotómetro es un instrumento que mide la cantidad de fotones (la intensidad de luz

absorbida después de que pasa a través de una solución de muestra. Con el espectrofotómetro, la

cantidad de una sustancia química conocida (concentraciones) también se puede determinar mediante

la medición de la intensidad de la luz detectada. Dependiendo de la gama de longitud de onda de la

fuente de luz, se puede clasificar diferentes tipos:

En espectrofotometría visible, la absorción o la transmisión de una cierta sustancia se puede

determinar por el color observado. Por ejemplo, una muestra de solución que absorbe la luz en todos

los rangos visibles (es decir, no se transmite ninguna de las longitudes de onda visibles) aparece

negro. Por otro lado, si se transmiten todas las longitudes de onda visibles (es decir no se absorbe

nada), la muestra de solución aparece blanca. Si una muestra de solución absorbe la luz roja (-

700nm), parece ser verde porque el verde es el color complementario del rojo. Espectrofotómetros

visibles, en la práctica, utilizaban un prisma para reducir un cierto rango de longitud de onda (para

filtrar las otras longitudes de onda), de modo que el haz particular de la luz se hace pasar a través de

una muestra de solución.

 Contenido

INTRODUCCION.............................................................................................................................2
1. ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN................................................................................4

2. PRINCIPIOS ESPECTROFOMETRICOS.............................................................................5

2.1 -Caracteristicas de la luz.................................................................................................5

2.2 .-Caracteristicas de la longitud de onda..........................................................................5
3. Espectro electromagnético......................................................................................................6

4. ESPECTROFOTÓMETRO....................................................................................................8

5. MANTENIMIENTO DE EL ESPECTOFOTROMETRO...................................................17

6. BUENAS PRÁCTICAS DE USO DEL ESPECTROFOTÓMETRO...................................20

7. FENOMENOS QUE AFECTAN LA LEY DE BEER :.......................................................21

8. CONCLUSION:...................................................................................................................21

Bibliografía......................................................................................................................................22
1. ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN
¿El color de las cosas se mantiene cuando hay oscuridad total? ¿El color es dependiente de una fuente

externa de energía luminosa?

Si observamos una disolución acuosa de Cu2+ a trasluz percibimos un color azulado. Esta coloración

se debe a la interacción de los iones cobre con la radiación lumínica que atraviesa la disolución. Más

concretamente, se debe a la absorción de algunas radiaciones lumínicas que corresponden al “color

complementario” (en este caso el amarillo). Las radiaciones no absorbidas son las que atraviesan la

disolución sin obstáculo alguno y llegan a nuestro ojo. En nuestro ejemplo, estas radiaciones

“transmitidas” corresponden al color azul. Una solución roja absorbe la luz verde y transmite o refleja

la luz roja. En ausencia de luz, las sustancias no tienen color.()

Siguiendo con el ejemplo de la solución de cobre, si comparamos el color de dos disoluciones de

Cu2+ con diferente concentración, observamos que a mayor concentración corresponde una mayor

intensidad de color azul de la disolución. Por lo tanto podemos saber la concentración de la sustancia

según la intensidad del color. Esta propiedad de la interacción de la luz con una gran cantidad de

especies químicas nos permitirá identificar y cuantificar analitos, dando lugar a una rama de la

química analítica denominada espectrofotometría.()

La espectrofotometría estudia los fenómenos de interacción de la luz con la materia. En general,

cuando una lámpara ilumina cualquier objeto, pueden suceder algunos fenómenos: La luz puede ser

emitida, reflejada, transmitida o absorbida. Desde que sabemos que la energía no puede ser destruida,

la cantidad total de luz debe ser igual al 100%; por lo tanto, cuando un objeto es iluminado, se puede

medir cuánta radiación ha sido reflejada o transmitida y podemos decir entonces cuánta fue absorbida,

cuál es la cantidad que ha interactuado con el objeto.()

La espectroscopia de absorción, está relacionada con el hecho de que una sustancia absorbe la luz,

provocando que los electrones “salten” de un nivel de energía a otro mayor; este fenómeno permite
explicar por qué algunas sustancias son coloreadas como el I2 y el CrO4 2-, mientras que otras como

el agua y el NaCl no.()

La espectroscopia ha jugado una parte importante en el desarrollo de la bioquímica. Se ha utilizado

para medir velocidades de reacción catalizadas por enzimas, para medir concentraciones de

compuestos, determinar conformaciones estructurales e interacciones moleculares.()

En los años sesentas y setentas esta técnica se volvió muy utilizada que fue una continuación de la

colorimetría. En estas décadas se hacían análisis de sustancias inorgánicas, principalmente metales a

niveles de traza. En combinación con la extracción líquido-líquido, se conseguían determinaciones de

compuestos de interés.()

Las longitudes de onda utilizadas en el laboratorio comprenden a la luz visible y ultravioleta. Para

entender mejor cómo se lleva a cabo el fenómeno de la espectroscopia, es necesario entender lo que es

la radiación electromagnética y la Ley de Lambert-Beer.()

2. PRINCIPIOS ESPECTROFOMETRICOS
2.1 -Caracteristicas de la luz

Debido a que la espectrofotometría comprende mediciones con detectores de la radiación

electromagnética que se transmite, es fundamental conocer las principales características de la ración

electromagnética. La luz es una forma visible de radiación electromagnética, o sea, se comporta como

si tuviera campos eléctricos y magnéticos oscilando en planos perpendiculares entre sí.()

2.2 .-Caracteristicas de la longitud de onda

La luz como toda radiación electromagnética, está formada de fotones o paquetes de energía

que viajan en ondas. El espectro electromagnético se describe en términos de longitud de

onda (ʎ), número de onda (cm−1), y electrón volts.()

La longitud de onda del espectro electromagnética del espectro electromagnético es la

distancia entre los máximos de ondas sucesivas. En el sistema internacional se mide en

nanómetros (nm = 10−9 m).()

El número de onda es el reciproco de la longitud de onda. El número de ondas por segundo se

denomina frecuencia. La longitud de onda se relaciona inversamente con la energía. Mientras

mayor es la longitud de onda, menor es el número de fotones que contiene. En otras palabras,

la longitud de onda larga es de baja energía. De manera similar, la longitud de onda corta

posee más energía.()

3. Espectro electromagnético
La radiación electromagnética consta de rayos gamma, rayos X, ultravioleta (UV), visible, infrarrojo

(IR), microondas de radio.

-Los rayos gamma tienen mayor energía (longitud de onda corta)

-Las ondas de radio tienen menor energía (longitud de onda larga).

-En espectrofotometría de absorbancia se utilizan en las regiones UV cercana (200-280 nm),

ultravioleta (10-200nm)

-La región visible (380-780 nm).

-La región infrarroja cercana (780-3000 nm), medio (3000-20000 nm), lejano (30000-300000 nm).

En la mayor parte de los instrumentos del laboratorio de química clínica se emplea la radiación

electromagnética UV y visible. Ocasionalmente se utiliza la espectroscopia de infrarrojo en el

laboratorio de toxicología para identificar y confirmar fármacos o productos químicos tóxicos. Los

rayos gamma se usan en contadores de ensayo radio inmunológico.()

El conjunto de radiaciones electromagnéticas se llama espectro electromagnético y es conveniente

agruparlas en regiones para poder conocer sus propiedades. En la figura se muestran las zonas del
espectro según la clasificación más aceptada. Como se puede observar la zona del visible (radiaciones

percibidas por nuestro ojo) es muy pequeña en comparación con la gran amplitud del espectro.

Aunque hablamos de una radiación determinada (λ), físicamente es imposible aislar dicha radiación.

Siempre podremos obtener un rango de radiaciones pequeño según la exactitud del dispositivo de

selección (difractares de radiación y filtros), pero nunca una sola. De la misma manera que no

podemos obtener o aislar un punto de una recta, sino un trozo pequeño (un conjunto de puntos).()

Fig. 2. Espectro de radiaciones electromagnéticas

4. ESPECTROFOTÓMETRO
La palabra espectrofotómetro se deriva de la palabra latina spectrum, que significa imagen, y de la

palabra griega phos o photos, que significa luz. El espectrofotómetro, construido mediante procesos

avanzados de fabricación, es uno de los principales instrumentos diagnósticos y de investigación

desarrollados por el ser humano. Utiliza las propiedades de la luz y su interacción con otras

sustancias, para determinar la naturaleza de las mismas. En general, la luz de una lámpara de

características especiales es guiada a través de un dispositivo que selecciona y separa luz de una

determinada longitud de onda y la hace pasar por una muestra. La intensidad de la luz que sale de la

muestra es captada y comparada con la intensidad de la luz que incidió en la muestra y a partir de esto

se calcula la transmitancia de la muestra, que depende de factores como la concentración de la

sustancia.()

Un espectrofotómetro es un instrumento utilizado para determinar a qué longitud de onda la muestra

absorbe la luz y la intensidad de la absorción. Aunque varían en el diseño, todos los

espectrofotómetros consisten de una fuente de luz, un selector de longitud de onda, un contenedor

transparente en el cual se deposita la muestra, un detector de luz y el medidor.()

Las aplicaciones de la espectrofotometría son amplias y variadas. En este trabajo se revisarán los

conceptos ya enumerados con más detalle.

4.1 PROPÓSITO DEL EQUIPO

El espectrofotómetro se usa en el laboratorio con el fin de determinar la concentración de una

sustancia en una solución, permitiendo así la realización de análisis cuantitativos.()

4.2 PRINCIPIOS DE OPERACIÓN

Como principio básico se considera que la luz es una forma de energía electromagnética, que en el

vacío tiene una velocidad constante [C] y universal de aproximadamente 3 x 108 m/s. En cualquier

otro medio (transparente) por el que pase la luz, su velocidad será ligeramente inferior y podrá

calcularse mediante la siguiente ecuación.()

v0 =C
n

Dónde:

v = velocidad a través del medio por el que pasa la luz

n = índice de refracción del medio, cuyo valor oscila, por lo general, entre 1,0 y 2,5
La luz, al pasar o interactuar con diversos medios, presenta una serie de fenómenos, entre los que

destacan la reflexión, refracción, difracción, absorción, difusión, polarización y otros que son

utilizados en diversos instrumentos y dispositivos. La siguiente tabla muestra los rangos de longitud

de onda en donde se utiliza el espectro luminoso para realizar pruebas de espectrofotometría.

Con respecto a la interacción de la luz con la materia, el siguiente esquema ayuda a entender la

complejidad de los fenómenos que ocurren:

El esquema muestra que la radiación incidente [Io] sufre una serie de transformaciones. Parte de la

misma se refleja [Ir], parte se transmite [It], parte se difunde [Id] y parte se absorbe e incide

directamente en fenómenos como la fluorescencia [If]. Los fenómenos en los que se basa la

espectrofotometría son principalmente la absorción y la transmisión. Para entender cómo se utilizan,

es necesario adicionalmente tener en cuenta la ley de Beer Lambert.()

Ley de Beer Lambert. Se conoce también como ley de Beer o de Beer Lambert Bouguer e identifica la

relación existente entre la concentración de la muestra y la intensidad de la luz transmitida a través de

la misma. Con relación a la ley en mención hay implícitos dos conceptos: transmitancia [T] y

absorbancia [A].

La transmitancia [T] es la fracción de la luz incidente que a una determinada longitud de onda pasa a

través de la muestra. Se define por la siguiente relación:

 T = It
Io

Dónde:

It = intensidad de la radiación transmitida

Io = intensidad de la radiación incidente

El porcentaje de transmitancia [%T] puede expresarse por la siguiente ecuación:

A = x l x c
Dónde:
A = absorbancia medida
ε = coeficiente de absortividad molar [litros/moles/cm]
l = distancia de la trayectoria recorrida por la luz dentro de la muestra
c = concentración de la muestra [moles/litros]

La absorbancia [A] se relaciona con la transmitancia [T] mediante la siguiente ecuación:

El siguiente esquema explica el fenómeno de la absorbancia A:

Fenómeno de Absorbancia

Las curvas que se presentan a continuación muestran cómo varía la absorbancia [A] y la transmitancia

[T] en función de la concentración [C], de acuerdo con la ley de Beer Lambert, en la que se basa la

espectrofotometría.()
Grafica de transmitancia

Grafica de Absorbancia

Como conclusión puede inferirse que, a medida que aumenta la concentración de una sustancia, la

tramitación disminuye y que, al aumentar la concentración de la sustancia, aumenta la absorbancia.

La linealidad de la ley de Beer Lambert se ve afectada, si se presentan las siguientes condiciones:

1.- Corrimientos en el equilibrio químico de la muestra cono una función de concentración.

2.-Desviaciones en los coeficiente de absortividad, concentraciones mayores de 0.01 M debido a la

interacción electrostática entre moléculas cercanas.

3.-Cambios en el índice de refracción a altas concentraciones de analito.

4.-Difusion de la luz debido a partículas en la muestra.

5.-Fluorescencia o fosforescencia de la muestra.

6.-Radiacion monocromática.

4.3COMPONENTES DEL ESPECTROFOTOMETRO

El esquema que se presenta a continuación describe la interrelación de los diversos componentes de

un espectrofotómetro.

Se muestra un espectrofotómetro con detector simple y con un simple rayo. Un filtro del

monocromador selecciona un rango de longitudes de onda de la fuente de radiación para ser enviada a

la muestra en el mismo compartimento. La radiación trasmitida es detectada con un fotodiodo y

convertido a una señal por un procesador de señales.()

Los componentes más importantes son:

1.-Fuente Luminosa

2.-El Monocromador

3.-El Portador de Muestras

4.-El sistema detector

5.-El sistema de lectura

4.3.1 FUENTE LUMINOSA

Dependiendo del tipo de espectrofotometría, la fuente luminosa puede ser una lámpara con filamento

de tungsteno para luz visible, o una lámpara de arco de deuterio para luz ultravioleta.

Algunos fabricantes han diseñado espectrofotómetros con lámparas intermitentes de xenón de alta

duración que emiten luz en el rango de la luz visible y ultravioleta. La lámpara o lámparas vienen

montadas de fábrica en una base que permite asegurar una determinada posición, para que se

mantengan las condiciones de ajuste óptico y enfoque cuando está en operación o se requiere

reemplazarla. La energía radiante típica que emite una lámpara de tungsteno está entre los 2 600 y los

3 000 °K (grados Kelvin).

4.3.2 MONOCROMADOR
Está compuesto por un conjunto de elementos. En general, dispone de una rendija o ranura de entrada

que limita la radiación lumínica producida por la fuente y la confina en un área determinada, un

conjunto de espejos para pasar la luz a través del sistema óptico, un elemento para separar las

longitudes de onda de la radiación lumínica, que puede ser un prisma o una rejilla de difracción, y una

rendija de salida para seleccionar la longitud de onda con la cual se desea iluminar la muestra. Las

rejillas de difracción tienen la ventaja de eliminar la dispersión no lineal y son insensibles a los

cambios de temperatura.

4.3.3 PORTADOR DE MUESTRAS

Está diseñado para sostener la muestra que se quiere analizar dentro del rayo de luz de longitud de

onda determinada por el monocromador. El elemento que contiene la muestra es una celda o cubeta se

fabrican de vidrio, si se requieren efectuar estudios en el rango de los 340 a los 1000nm y de sílice, si

el análisis está en el rango comprendido entre los 220 y 340 nm. También hay celdas de materiales

plásticos como estireno o poliestireno. El portador de muestras lo diseñan los fabricantes de acuerdo

al tipo de espectrofotómetro y de muestra a analizar, por ello se encuentran portadores de muestra con

microceldas, aunque también tubos de ensayo y otras variantes como las celdas de flujo continuo.

4.3.4 SISTEMA DETECTOR

El sistema de detección puede estar diseñado con fotoceldas, fototubos, fotodiodos o

fotomultiplicadores. Esto depende de los rangos de longitud de onda, de la sensibilidad y de la

velocidad de respuesta requeridas. El sistema de detección recibe la energía lumínica proveniente de

la muestra y la convierte en señal eléctrica proporcional a la energía recibida. La señal eléctrica puede

ser procesada y amplificada, para que pueda interpretarse a través del sistema de lectura.()

Tabla de ventajas y desventajas de dispositivos de deteccion

4.3.5 SISTEMA DE LECTURA

La señal que sale del detector recibe diversas transformaciones. Se amplifica y se transforma para que

su intensidad resulte proporcional al porcentaje de transmitancia/absorbancia. Existen sistemas de

lectura de tipo análogo (muestra la magnitud leída sobre una escala de lectura) o digital (muestra la

magnitud leída en una pantalla).()

Los indicadores de tipo análogo reciben tradicionalmente el nombre de metros. Su exactitud depende,

entre otros factores, de la longitud de la escala y del número de divisiones que tenga. (Mientras más

divisiones, más exacto). Su principal desventaja es que pueden ser mal leídos, por la fatiga de los

operadores o errores, cuando disponen de varias escalas, al tratar de identificar las escalas sobre las

que deben realizar las lectura.Los indicadores digitales usualmente presentan los resultados en una

pantalla, en forma de caracteres alfanuméricos luminosos. Esto los hace menos propensos a que se

cometen errores de lectura.()

5. MANTENIMIENTO DE EL ESPECTOFOTROMETRO

6. BUENAS PRÁCTICAS DE USO DEL ESPECTROFOTÓMETRO

  Realizar la calibración del espectrofotómetro, cada vez que se realiza el análisis de un grupo

de muestras.

 Mantener cerrada la tapa del portamuestras durante el proceso de medición, para asegurar una

lectura adecuada.

 No reutilizar las cubetas desechables.

 Utilizar únicamente cubetas de cuarzo, para efectuar análisis por debajo de los 310 nm.

 Evitar el uso de cubetas plásticas, si se utilizan solventes orgánicos.

 Utilizar cristalería de boro silicato de alta calidad para preparar los estándares. Evitar el uso

de cristalería de sodio –óxido de sodio– siempre que sea posible, debido a que el contacto

prolongado con los estándares puede permearla y, en consecuencia, producir resultados

erróneos.

 Limpiar cuidadosamente las cubetas de vidrio después de utilizarlas. Desechar aquellas que

presenten rayones en la superficie pulida.

 Utilizar en lo posible reactivos de alta calidad.

 Reactivos de baja calidad pueden causar contaminación incluso en concentraciones muy

bajas.

 Los diluyentes utilizados–agua o solventes– deberán estar libres de impurezas.

 Verificar que las muestras o estándares no se han desgastado dentro de las cubetas.

 Este fenómeno produce burbujas sobre la superficie interna de las cubetas y errores en las

lecturas.

 Tener en cuenta, cuando se pretenda utilizar nuevos procedimientos, que no todas las

sustancias cumplen con la ley de Beer.

 Efectuar pruebas de linealidad sobre el rango de concentraciones a ser utilizadas.

 Se recomienda preparar un grupo de soluciones fuertes –conocidas– y verificar los resultados.

7. FENOMENOS QUE AFECTAN LA LEY DE BEER :

 Las altas concentraciones de asociación molecular de especies iónicas.
  Variaciones en la hidratación de bajas concentraciones dan cambios a la naturaleza de los

iones.

 Absorciones que no obedecen, lo que indica la gráfica de estándares conocidos lo que indica

lectura versus concentración.

8. CONCLUSION:
Se ha llegado a la conclusión de que la espectrofotometría es un método analítico indirecto porque se

basa en la medición de la absorbancia  o transmitancia de las radiaciones; es de gran utilidad en la

actualidad para la identificación de un analito en una muestra problema.()

La espectrofotometría es el método más usado, debido a que es sencillo, específico y sensible.-

Bibliografía

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