Versión: 001

LABORATORIO DE CIENCIAS BÁSICAS

Código: PR-PSA-005
PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN Y Vigencia: 1 Junio de 2017
CUANTIFICACIÓN DE COLIFORMES TOTALES
Y E.coli POR EL MÉTODO DE NÚMERO MÁS
PROBABLE

1. OBJETIVO.
Establecer un procedimiento para la detección y cuantificación de coliformes
totales y E. coli en muestras de agua tratada, de consumo, residual y
superficial, por la técnica de Número Más Probable, aplicando la metodología
de Fermentación en Tubos Múltiples con Sustrato Definido.

2. RESPONSABLE.
La preparación del material necesario y la ejecución de este procedimiento
corresponde a auxiliar (es) de laboratorio y profesional (es) en el área de
Microbiología.

3. ALCANCE
El procedimiento aplica para la detección y cuantificación de coliformes totales
y E. coli en muestras de agua de consumo, tratada, residual y superficial,
usando para cada muestra máximo tres series de cinco tubos con caldo LMX
Florocult modificado.

4. DEFINICIONES.

 Coliformes: Se refiere a un grupo de bacterias pertenecientes a la

familia de las entero bacterias, incluyen bacterias bacilares, gram
negativas, aeróbicas y anaeróbicas facultativas, no formadoras de
esporas, fermentadoras de lactosa con producción de gas en 48 horas
de incubación a 35°C

 E. coli (Escherchia coli): Bacilo gram negativo, capaz de fermentar la

lactosa a temperaturas de 35°C +/- 2°C, con producción de ácido, gas y
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aldehído en un lapso de 18 a 48 horas. Oxidasa negativa, no formador

de esporas y reductor de nitrato a nitrito. También es capaz de producir
indol a partir de triptófano a una temperatura de 44 +/- 5 °C en un tiempo
de 21 a 24 horas. Poseen la enzima B-glucoronidasa, la cual es
detectada por medios cromógenos o fluorógenos. Su presencia en agua
indica la presencia de bacterias provenientes de heces fecales humanas
o de animales de sangre caliente causantes de diarrea, vómito,
gastroenteritis y otros desórdenes del sistema digestivo.

 Cromógeno: Se refiere a una bacteria que produce colorantes u origina

coloraciones.

 Ultravioleta: Radiación electromagnética con longitud de onda entre los

400 y 15 nm.

5. GENERALIDADES

5.1. Principio del Método1

El caldo LMX Florocult modificado contiene buffer fosfato que garantiza
la alta tasa de crecimiento de coliformes totales y lauril sulfato que inhibe
la microbiota gram positiva acompañante. El sustrato cromogénico 5-
bromo-4-cloro-3-indolil-ß- D-galactopiranosido -X GAL- es hidrolizado
por la B-D galactosidasa presente en las especies de coliformes, y el
sustrato fluorogénico 4-metilumberiferil-ß-D-glucuronido –MUG- es
hidrolizado por la enzima glocoronidasa presente en E. coli. La
combinación de estos sustratos en el medio de cultivo permite la
detección de coliformes y E. coli simultáneamente. El medio contiene
además triptófano, que es transformado a indol por la enzima
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triptofanasa de E. coli,. El indol es detectado por la adición del reactivo

de Kovac’s. La formación de un anillo rojo después de la adición del
reactivo indica la presencia de indol y por lo tanto confirma la presencia
de E. coli.

5.2. Elementos de protección personal requeridos:

 Bata manga larga.
 Guantes de látex.
 Tapabocas.

5.3. Materiales y equipos

 Probetas graduadas de 100,500 y 1L.
 Erlenmeyer de 500 ml y 1L.
 Tubos de borosilicato de 18 x 125 mm ó 20 x 125 mm.
 Pipetas estériles de 10 ml y 1ml.
 Pipeteadores
 Micropipetas de 1 ml y 0.1 ml.
 Puntas respectivas a las micropipetas estériles.
 Toallas de papel absorbente.
 Gradilla.
 Autoclave.
 Incubadora.
 Plancha de calentamiento.
 Balanza analítica.
 Cabina da flujo laminar.
 Lámpara de luz ultravioleta.

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5.4. Reactivos y medios de cultivo.

 Caldo LMX Florocult modificado
 Reactivo de Kovac’s
 Agua destilada.
 Etanol al 70%
 Peptona

6. DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES 2

No. Actividad Responsable Registro /documento

1. Asegurar un área de trabajo Profesional en N/A
limpia, desinfectando microbiología.
superficies con etanol al 70 Auxiliar de
%. Si el procedimiento se laboratorio de
llevará a cabo en cabina de microbiología
flujo laminar, operarla la de
manera rutinaria, de lo
contrario encender el
mechero y dejar el área de
trabajo despejada con el
mechero encendido durante
10 minutos.

2. Si los medios de cultivo, el Profesional en Formato Interno de

agua Peptonada y la muestra microbiología. Resultados F-PSA-
han sido refrigerados, permitir Auxiliar de 007
que se atemperen dejándolos laboratorio de
por fuera de la nevera 20 microbiología

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minutos antes de comenzar el

análisis. Verificar que los
tubos con medios y agua
Peptonada no presenten
algún tipo de turbidez o
precipitado. Si se observa
alguna turbidez, descartar el
tubo.

3. Ubicar los tubos con 10 ml de Profesional en N/A

caldo LMX Florocult en una microbiología.
gradilla, formando tres filas Auxiliar de
cada una con cinco tubos. laboratorio de
Para muestras de agua microbiología
tratada utilizar sólo un set de
5 tubos. Ubicar en la misma
gradilla dos series adicionales
de tres tubos cada una.
4. Marcar todo el material de Profesional en N/A
trabajo indicando: Identidad microbiología.
de muestra, medio, dilución y Auxiliar de
responsable del análisis. Las laboratorio de
dos series de tres tubos microbiología
adicionales deben marcarse,
como “Control de LMX” y
“Control Peptonada-LMX”.
5. Ubicar los tubos con 10 ml de Profesional en N/A
caldo LMX Florocult en una microbiología.
gradilla, formando tres filas Auxiliar de
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cada una con cinco tubos. laboratorio de

Para muestras de agua de microbiología
consumo o tratada utilizar
sólo una serie de 5 tubos.
Ubicar en la misma gradilla
los seis tubos con LMX
correspondientes a los
controles.
6. Diluir la muestra en agua Profesional en Bitácora.
Peptonada estéril al 1%, microbiología.
teniendo en cuenta la Auxiliar de
procedencia de la misma. laboratorio de
Para agua de consumo o microbiología
tratada no diluir la muestra.
Para aguas residuales y
superficiales aplicar
diluciones acuerdo a la carga
de coliformes esperada,
teniendo en cuenta resultados
previos. Agitar cada tubo
antes de tomar la alícuota
para la siguiente dilución.
Usar en lo posible pipetas o
puntas estériles desde la
dilución inicial hasta la
dilución final. Si no se cuenta
con el número de pipetas o
puntas para todas las

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diluciones, purgar la pipeta

con cada dilución, antes de
pasar la muestra al siguiente
tubo. Evitar, en lo posible, el
arrastre la punta de la pipeta
por la pared y el cuello de los
tubos contenedores de la
dilución. Al momento de
sustraer la muestra, para las
diluciones o la siembra final,
sumergir la pipeta máximo a
2.5 cm de la superficie de las
mismas.
7. Seleccionar las diluciones o Profesional en Bitácora.
los volúmenes de cada microbiología.
muestra que serán Auxiliar de Formato Interno de
analizados. Para muestras de laboratorio de Resultados F-PSA-
agua de consumo o tratada, microbiología 007
inocular los 5 tubos con 10 ml
ó 20 ml de la muestra directa.
Para aguas superficiales o
residuales, pueden inocularse
volúmenes, de 10 ml, 1ml, y
0.1 de la muestra directa; ó 1
ml de tres de las diluciones
aplicadas a la muestra. Agitar
la muestra o las diluciones e
inocular los tubos desde la

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dilución menos concentrada

hasta la más concentrada.
Si el volumen de muestra que
se va a aplicar a alguna serie
de cinco tubos es de 10 ml o
más, ésta serie debe contener
10ml de LMX al doble de
concentración.
8. Incubar los tubos a 35 ± 0.5ºC Profesional en N/A
durante 24 ± 1ºC horas. microbiología.
Auxiliar de
laboratorio de
microbiología
9. Leer y reportar los resultados Profesional en Bitácora.
en el formato F-PSA-007 de microbiología.
acuerdo las recomendaciones Auxiliar de Formato Interno de
de cálculo para la laboratorio de Resultados F-PSA-
determinación de la densidad microbiología 007
de coliformes totales y E. coli
(Anexo 1). Tubos positivos
para coliformes totales
mostrarán un cambio de color
de amarillo a verde azul. Los
tubos positivos para E. coli
mostraran fluorescencia bajo
luz ultravioleta. A los tubos
positivos de E. coli realizar
prueba confirmatoria de
producción de indol,
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adicionando dos gotas del

reactivo de Kovac’s. La
formación de un anillo rojo en
la parte superior del caldo,
confirma la presencia de
E.coli.

7. Control de cambios

No. Ítem del Cambio Motivo del Fecha del

versión Cambio realizado Cambio cambio
1
2

8. Bibliografía.
1. MercK Millipore. Fluorocult ® LMX Broth modified. 1–2
2. American Public Health Association (APHA). Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater. (1999).

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Anexo 1

Determinación del Número Más Probable (NMP) de coliformes totales y E.

coli en muestras de agua.
 Las Tablas I, II y III relacionan el valor del NMP de Coliformes y E. coli en 100
ml (NMP/100ml) de agua con el número de tubos positivos y negativos
obtenidos tanto para la determinación de coliformes totales como E. coli. Las
Tablas I y II, se usan cuando se inoculan 10 o 20 ml de agua de consumo o
tratada a series de cinco tubos con caldo LMX. La Tabla III, muestra los
valores de NMP para combinaciones de tubos positivos y negativos cuando se
usan volúmenes de muestra de 10 ml, 1ml, y 0.1ml.

Tabla I NMP para combinaciones de tubos positivos y negativos cuando se
inoculan 10 ml de muestra en un set de cinco tubos
Número de
tubos con Índice de
reacción NMP/
positiva con 100ml
10 ml.
0 <1.1
1 1.1
2 2.2
3 3.6
4 5.1
5 6.9
6 9.2
7 12
8 16.1
9 23
10 >23

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Tabla II. NMP para combina combinaciones de tubos positivos y negativos
cuando se inoculan 20 ml.

Número de
tubos con
Índice de
reacción
NMP/
positiva con
100ml
20 ml de
muestra.
0 <1.1
1 1.1
2 2.6
3 4.6
4 8.0
5 >8.0

Tabla III. Número más probable para varias combinaciones de tubos positivos y
negativos cuando se usan volúmenes de muestra de 10ml, 1.0 ml, y 0.1 ml.
Combinación Combinación
Índice Índice
de tubos de tubos
NMP/100 ml NMP/100 ml
positivos positivos
0-0-0 <2 4-2-0 22
0-0-1 2 4-2-1 26
0-1-0 2 4-3-0 27
0-2-0 4 4-3-1 33
4-4-0 34

1-0-0 2 5-0-0 23
1-0-1 4 5-0-1 30
1-1-0 4 5-0-2 40
1-1-1 6 5-1-0 30
1-2-0 6 5-1-1 50
5-1-2 60

2-0-0 4 5-2-0 50
2-0-1 7 5-2-1 70
2-1-0 7 5-2-2 90
2-1-1 9 5-3-0 80
2-2-0 9 5-3-1 110
2-3-0 12 5-3-2 140

3-0-0 8 5-3-3 170

3-0-1 11 5-4-0 130
3-1-0 11 5-4-1 170
3-1-1 14 5-4-2 220
 3-2-0 14 5-4-3 280
3-2-1 17 5-4-4 350

4-0-0 13 5-5-0 240

4-0-1 17 5-5-1 300
4-1-0 17 5-5-2 500
4-1-1 21 5-5-3 900
4-1-2 26 5-5-4 1600
    5-5-5 >1600

 Cuando la serie de diluciones decimales es diferente a las presentadas en la

Tabla III, debe seleccionarse el valor de NMP de tubos positivos de la Tabla III
y aplicarse la siguiente fórmula:

NMP NMP (tabla ) x 10

=
100 ml Factor de dilución más alto de los analizados enla serie de tubos

Por ejemplo: Si en cada serie de cinco tubos se inoculara 1ml de la muestra

que ha sido diluida seriadamente tres veces mediante diluciones 1:10, (10 -1, 10-
2
, y 10-3); a cada serie de tubos correspondería los factores de dilución 0.1,
0.01, 0.001. Entonces, el factor de dilución usado para el cálculo será 0.1.

 Cuando se analizan más de tres diluciones, deben escogerse sólo tres de ellas
para calcular el NMP/100ml. Debe seleccionarse en primer lugar, la dilución
más alta (mayor factor de dilución) que arrojó cinco tubos positivos y las dos
diluciones siguientes.
Por ejemplo: Una muestra fue inoculada en 4 series de cinco tubos así: Serie
1, 1 ml de la muestra directa; Serie 2, 1 ml de la dilución 10 -1, Serie 3, 1 ml de
la dilución 10-2; Serie 4 1 ml de la dilución 10 -3, y se obtienen los siguientes
resultados:

Tubos positivos/
Factor de
Serie Tubos
dilución
analizados
1 - 5/5
 2 0.1 5/5
3 0.01 2/5
4 0.001 0/5

La combinación correspondiente es 5-2-0, que de acuerdo con la tabla

corresponde al NMP 50. Siguiendo las indicaciones de cálculo arriba descritas,
se tiene:

NMP 50 x 10
=
100 ml 0.1

NMP
=5000
100 ml