PRACTICA PARA CULTIVO INVITRO

SEMILLAS DE ORQUIDEA CATTLEYA

METODO DE CAPSULA VERDE
(PASO A PASO)

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INDICE

PREVIO ………………………………………………………………………………………………………..………………….. Pag. 3

LEYENDAS…………………………………………………………………………………………………………………...….. Pag. 4

LISTADO (A) - ESTERILIZACION TARROS ………………………………………………………………………….. Pag. 5

LISTADO (B) - ESTERILIZACION INSTRUMENTOS …………………………………………………………….. Pag. 5

LISTADO (C) - ANEXOS……………………………………….…………………………………………………………….. Pag. 6

LISTADO (D) - MEDIO DE CULTIVO……………………..…………………………………………………………….. Pag. 6

MEDIOS DE CULTIVO EXPERIMENTADOS…………..……………………………………………………………….. Pag. 7

AJUSTE DE PH EN MEDIOS DE CULTIVOS…………………………………………………………………………….. Pag.8

PRACTICA ……………………………………………………………………………………………………………………...….. Pag. 9

PRESUPUESTO…………………………………………………………………………………………………………………… Pag.11

NOTAS DE SEGURIDAD………………………………………………………………….………………………………….. Pag. 14

IMAGENES...…………………………………………………………………………………………………………………….. Pag. 15

AUTORIA. ………………………………………………………………………………………………………………………….. Pag. 16

AGRADECIMIENTOS………………………………………………………………………………………………………….. Pag. 17

APUNTES ………………………………………………………………………………………………………………………….. Pag. 18

Notas:
V

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PREVIO

 Aplicar medidas de protecciones individuales y colectivas a todo el proceso.

 Se recomienda el uso de gafas de protección, mascarilla, guantes y ropa adecuada.
 Este documento se confecciona a título informativo desde el punto de vista de la experimentación
casera, por personal no profesional, sin pretender ser un manual o tutorial a seguir.
 Solo se describe la forma en que ha realizado esta práctica, ejecutada de forma totalmente
privada, con uso de equipos de protecciones individuales y colectivas.
 Los tarros con el medio de cultivo esterilizado (Listado D), deben de estar preparados previamente
con al menos siete días de antelación (7).
 Este periodo de maduración de siete días (7), se considera suficiente para poder observar el
comportamiento del medio de cultivo en el interior de los tarros y comprobar que no existe
contaminación.
 El comportamiento del medio de cultivo en el interior de los tarros, dependerá de las condiciones
del entorno y manipulación en el que se desarrolle la práctica, el tiempo efectivo de maduración,
el tipo de tarro empleado, la esterilización aplicada, etc.
 La aparición o no de contaminación puede o no coincidir con estos parámetros o tiempos.
 Descartar los tarros afectados por contaminación si ésta ocurriera.

- Los tarros para envasar el medio pueden ser de varios tipos, pero es
muy importante que todos sean transparentes, plásticos opacos no
sirven, y aptos para esterilización en autoclave u olla a presión.

- Cristal con tapa metálica forrada de teflón. Comúnmente los tarros que
usamos para las conserva.

- Procurad que la tapa este en buenas condiciones sin arañazos ya que

esto puede provocar oxido después del envasado.

- Plástico: El mejor resultado lo da el polipropileno (pp5) aunque existen

otras composiciones plásticas que pueden ser esterilizados.

- Las tapas: a rosca o a presión, metálicas forradas por el interior o

completas de polipropileno(pp5)

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LEYENDAS

En este documento se han usado algunas leyendas para abreviar nombres que aparecerán de forma
repetida.

LEYENDAS USADAS

MS Medio Murashige &

Skoog
CA Carbón activado CV Carbón vegetal
AB Agar bacteriológico AC Agar culinario en fibras
CC Agua de coco filtrada DD Agua destilada ph
neutro
SR Sacarosa / Azúcar Lj Lejía uso comercial 5%
AH7 Alcohol 70º AH9 Alcohol 96º
AO Agua Oxigenada MBB Mezcla desinfectante B
MAA Mezcla desinfectante A GloveBox Caja hermética

Desinfectante para el hogar, sustituto de lejía, elimina de forma efectiva:

BACTERIAS: E-coli Staphylococcus aureus Pseudomona aeruginosa Enterococcus hirae

Clostridium sporegens Shigella flexneri Salmonella entérica Listeria Monocitogenes

Campylobacter jejuni

HONGOS

Candida albicans Aspergilus Niger (moho) Microsporum canis Trichosporon cutaneum

Trichosporon asahii

OTROS
Herpes simplex tipo 1 Influenza A H1N1 (gripe)

ALÉRGENOS

Ácaros del Polvo Alérgenos del gato (Feld D1) Alérgenos del Polen
Esporas del moho

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LISTADO (A) - ESTERILIZACION TARROS

✔ Nº LISTA
1 Tarro para aislado y transporte de capsula
1 Tarro para desinfección de semilla con Alcohol
1 Tarro para desinfección de semilla con Lejía
2 Tarro con agua destilada de lavado y enjuague
capsula
1 Tarro para lejía de evaporación en GloveBox
1 Tarro para alcohol desinfección instrumentos en
GloveBox
OBSERVACIONES
Sin líquidos
Sin líquidos.
Añadir mezcla después de esterilizar.
(Mezcla descrita en Observaciones
Procedimiento)
Sin líquidos.
Añadir mezcla después de esterilizar.
(Mezcla descrita en apartado
Observaciones de la Practica)
Llenar con DD 2/3
Sin líquidos.
Añadir mezcla después de esterilizar.
(Mezcla descrita en apartado
Observaciones de la Practica)
Sin líquidos.
Añadir mezcla después de esterilizar.
(Mezcla descrita en apartado
Observaciones de la Practica)

LISTADO (B) ESTERILIZACION INSTRUMENTOS

✔ Nº LISTA OBSERVACIONES
1 Pinza recta 15 – 18 cms Manipulación capsula
1 Pinza curva 15 – 18 cms Manipulación capsula
1 Pinza grande recta Ayuda para Limpieza superficies
1 Pinza de tijeras Opcional/Manipulación instrumentos
1 Tijeras de corte Opcional/Manipulación
Instrumentos/Cortes Envoltorios cuchillas
1 Bisturí y cuchilla Esterilizados – Colocar cuchilla y esterilizar
1 Placa Petri o plato de trabajo Esterilizados
1 Cubre placa o tapa para plato de trabajo Proteger capsula si se tiene que abrir
momentáneamente la GloveBox. (Cultivo
por fases). Aplicar después, una vez
cerrada de nuevo, pulverización, limpieza
y tiempo de curado con vapores de lejía.

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LISTADO (C) - ANEXOS

Además, se contara con otros materiales, instrumentos y útiles como:

✔ Nº LISTA OBSERVACIONES
1 Pulverizador con mezcla de limpieza MAA para Desinfectante sustituto de lejía.(50%)
superficies en interior de la GloveBox
Opcional 1 .- Alcohol 96º - AH9 (30%)
Opcional 2.- Agua Oxigenada – (20%)
Opcional 3.- 50% Desinfectante - AH9
(30%) –AO (20%) (Probad antes reacción de
la mezcla al contacto con superficies,
metales, vapores,etc)

1 Pulverizador con mezcla de limpieza MBB para Alcohol 96º AH9 rebajado: 73 ml de alcohol
frotar guantes y tarros a manipular 96º y 27 ml DD esterilizada.
Opcional 1.- Alcohol 70º - AH7
(Alcohol isopropilico)
1 Gasas esterilizadas, Bayeta esterilizada Para limpieza de superficies

1 Cuchillas bisturí esterilizadas Corte de Capsula/ Repuestos. Colocar

cuchilla y esterilizar

1 Cepillo para lavar y frotar capsula Cepillo dental

LISTADO (D) - MEDIO DE CULTIVO

 El número de frascos dependerá de cada sesión y del tamaño de la Glovebox, con estos y los
demás con líquidos se reduce mucho el espacio disponible para trabajar cómodamente.

✔ Nº LISTA OBSERVACIONES
4 Tarros con medio de cultivo: (Variante 4 ) Nº de tarros opcionales, según
DD+CC+SR+MS+CA+AB necesidades, se pueden realizar cultivos en
varias fases
1 Tarros con medio de cultivo: (Variante1 ) Nº de tarros opcionales, según
DD+CC+SR+MS+CV+AC necesidades, se pueden realizar cultivos en
varias fases.

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MEDIOS DE CULTIVOS EXPERIMENTADOS

COMPUESTO Formula ½ Variante 1 Variante 2 Variante 3 Variante 4

Por orden de mezclado Origen Dosificación
Aguas destilada 1000 ml 500 ml 500 ml 500 ml 500 ml 500 ml
Sacarosa 20 g 10 g 10 g 10 g 10 g 10 g
Medio MS 2,21 g 1,105 g 1,105 g 1,105 g 1,105 g 1,105 g
Carbón Vegetal 1g 1g
(Opcional)
Carbón Activado 2g 1g 1g 1g
Agua de coco Filtrada 100 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml
Ajustar PH medio a: 5.70 5.70 5.70 5.70 5.70 5.70
Agar Culinario 5g 5g
opcional)
Agar Bacteriológico 6g 3g 3g 4g

Formula Origen: Dosificación original.

½ Dosificación: Dosificación original reducida al 50%

Variante 1: Dosificación modificada. 50% original. Uso de carbón vegetal común y agar culinario.

Difícil ajuste de ph. Mala disolución de estos compuestos. Restos e impurezas flotan en la mezcla.
Decantación. Gelatinización en diferentes texturas para la misma medida según el tipo de agar.

Variante 2: Dosificación modificada. 50% original. Uso de carbón activado y agar culinario. Sencillo ajuste
de ph, Mejor disolución de estos compuestos. Limpio de impurezas en la mezcla. Algunos restos.
Decantación. Gelatinización en diferentes texturas para la misma medida según el tipo de agar.

Variante 3: Dosificación modificada. 50% original. Uso de carbón vegetal común y agar bacteriológico.

Difícil ajuste de ph. Mala disolución de estos compuestos. Restos e impurezas flotan en la mezcla.
Decantación. Gelatinización en diferentes texturas para la misma medida según el tipo de agar

Variante 4: Dosificación modificada. 50% original. Uso de carbón activado y agar bacteriológico.

Perfecto ajuste de ph. Buena disolución de estos compuestos. Sin restos ni impurezas. Sin decantación.
Gelatinización en diferentes consistencias según gramos: 3 g a 5g para 1 litro de agua.

Verter 25 Ml y 50 Ml de medio por cada tarro, de 1,5 cm a 2 cm.

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AJUSTE DE PH EN MEDIOS DE CULTIVOS

Base para subir el ph:

 El bicarbonato de sodio (también llamado bicarbonato sódico, hidrogenocarbonato de sodio,

carbonato ácido de sodio o bicarbonato de soda) es un compuesto sólido cristalino de color blanco
soluble en agua, con un ligero sabor alcalino parecido al del carbonato de sodio (aunque menos
fuerte y más salado que este último), de fórmula NaHCO3.

 Hidróxido de potasio (también conocido como potasa cáustica) es un compuesto químico

inorgánico de fórmula KOH. (Opcional)

Acido para bajar el ph:

 El ácido clorhídrico, ácido muriático, espíritu de sal, ácido marino, ácido de sal o todavía
ocasionalmente llamado, ácido hidroclórico (traducción del inglés hydrochloric acid), agua fuerte o
salfumán (en España), es una disolución acuosa del gas cloruro de hidrógeno (HCl).

 Vinagre blanco (Opcional)

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PRACTICA

✔ Nº PASO A PASO OBSERVACIONES

1 Esterilizar tarros Olla a presión 20” ( Ver Listado A)
2 Esterilizar Instrumental Olla a presión 20” (Ver Listado B)
3 Preparar tarro, después de esterilizado, con lejía pura Lj 100% -Tiempo de curado por
(Curación mediante Evaporación en GloveBox). evaporación de lejía en interior
Cerrar GloveBox: de 15 a 30 minutos
mínimo.
4 Preparar tarro, después de esterilizado, con alcohol AH7
70º para (Limpieza y conservación de Instrumentos)
Cerrar
5 Preparar tarro, después de esterilizado, con alcohol AH7
70º para (Desinfección semilla)
Cerrar
6 Preparar tarro, después de esterilizado, con lejía al DD 70% - Lj 30%
30% para (Desinfección semilla)
Cerrar
7 Lavar GloveBox con agua corriente y detergente. Eliminar restos de pegamentos,
(Exterior e Interior) grasas, siliconas, etc.
Escurrir
8 Limpiar con gasa estéril y mezcla de limpieza MAA Ver (C )
para superficies el interior de la GloveBox. Dejar
evaporar y secar. Abrir tarro con lejía para
evaporación. Cerrar Glovebox
9 Pulverizar tarros, paso 3-4-5 y 6, con mezcla MBB Ver (C
10 Introducir tarros, paso 3-4-5 y 6, en GloveBox.
(Reservar cerrado el que usaremos para transportar
capsula después de lavar con agua/detergente)
11 Meter Instrumental Listado B en GloveBox Ver (B)

12 Meter tarros con Medio de Cultivo en GloveBox Ver (D)

13 Lavar capsula con agua corriente y detergente, Cepillo dental

cepillar con cuidado y escurrir evitando contacto con
cualquier superficie.
14 Almacenar capsula en tarro de transporte, limpio y
esterilizado.(Cerrar)
15 Pulverizar exterior tarro con capsula lavada con
mezcla MBB
16 Introducir tarro con capsula lavada en GloveBox
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Continuación…

✔ Nº PASO A PASO OBSERVACIONES

17 Recuerda, si no lo has hecho: Abrir tarro con lejía para
evaporación. Preparación en Paso 3 –Abrir en Paso 8

18 Abrir tarro con Alcohol para instrumentos

Preparación en Paso 4
19 Volver a Cerrar GloveBox y esperar tiempo de curado 30 “ mínimo

20 Trabajando en la glovebox: Preparación

Pulverizar guantes con MBB y frotar antes de tocar
nada. Colocar instrumentos esterilizados dentro del
tarro con Alcohol.

21 Abrir tarro con capsula y trasladar a tarro con mezcla Tiempo sumergida:
de Alcohol = AH9 70% - DD 30% 5 minutos
Agitar o remover
22 Abrir tarro con capsula y trasladar a tarro con mezcla Tiempo sumergida:
de Lejia = DD 70% - Lj 30% 15 minutos
Agitar o remover
23 Abrir tarro con capsula y trasladar a primer tarro con 1º Enjuague:
Agua destilada = DD 2/3 1 minuto
Agitar o remover
24 Abrir tarro con capsula y trasladar a segundo tarro con 2º Enjuague:
Agua destilada = DD 2/3 1 minuto
Agitar o remover
25 Sacar capsula y proceder al corte sobre placa Petri , Escurrir, eliminar agua
plato de trabajo, o recipiente esterilizado.
26 Esparcir semillas en tarros con medio de cultivo Espolvorear sobre borde de tarro,
Cerrar tarros con la ayuda de la pinza,
aplicando pequeños golpes, sin
que tocar la superficie interior del
frasco.
27 Sellar tapa de tarros con film transparente Esta operación se puede realizar
una vez terminados de sembrar
todos los tarros.

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PRESUPUESTO

Compra de Coste € Envío Iva Tienda Enlace al producto

material
Coste Aproximado
Absolvedor 0,75 Bazar
Humedad
Ácido Clorhídrico 1,00 Ferretería
Agar 8,21 4,29 € Phygenera El enlace y el producto agar-agar
Bacteriológico ha sido sustituido:
AD108-50 https://phygenera.de/Agar-
50g Standard-grade-50-g

En el momento de la publicación
de este presupuesto, el enlace y
el producto disponible es:
https://phygenera.de/Gellan-
Powder-50-g
Agar culinario 6,00 ALDI
Agua de coco 1,20 Mercadona
Agua Destilada 0,80 Mercadona
Agua Oxigenada 1,35 Bazar
Ajuga ganchillo 0,75 Bazar
Alcohol 70º 1,50 Bazar
Bascula precisión 8,99 3,95 Amazon https://www.amazon.es/gp/pro
duct/B06Y1Z2BS7/ref=od_aui_de
tailpages00?ie=UTF8&psc=1
Bayetas 0,40 Bazar
Bisturí c/cuchilla 3,40 Farmacia
estéril
Bridas500x4.8 0,80 Bazar
Caja Glove Box 5,50 IKEA https://www.ikea.com/es/es/cat
alog/products/30102974/
Carbón activado 8,21 4,29 € Phygenera https://phygenera.de/Activated-
AD123-50-50g Charcoal_1
Carbón vegetal 2,50 Bazar
Cierre Cajas 0,50 IKEA https://www.ikea.com/es/es/cat
alog/products/20293455/
Cuchillas 1,20 Bazar
Cuentagotas 1,20 Farmacia
Envases pequeños 1,50 Primark
para semillas
Film Transparente 0,75 Bazar
Frasco 0,50 Bazar
Pulverizador
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Compra de Coste € Envío Iva Tienda Enlace al producto

material
Coste Aproximado
Gasas 0,75 Bazar
Guantes de goma 0,80 Bazar
(Limpiezas)
Guantes de 3,30 Ferretería
neopreno
(Limpiezas lejías,
tóxicos, corrosivos)

Guantes 1,20 Bazar

desechables
(manipulación)
Guantes neopreno 11,66 3,29 2,99 Amazon https://www.amazon.es/gp/pro
largos para duct/B0716R4MK8/ref=oh_aui_
Glove-box detailpage_o01_s00?ie=UTF8&ps
c=1
Jarra Graduada 3,00 IKEA
0,5l
Jeringuilla 30ml 0,85 Bazar
Jeringuilla 5ml 1,00 Farmacia
Lejía 1,00
Manguito GloveBox 3,40 Bazar
Mechero 1,20 Bazar
Medidor Ph Digital 7,99 3,95 Amazon https://www.amazon.es/gp/pro
duct/B00OK1PE3S/ref=oh_aui_d
etailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc
=1
Medio MS 3,21 4,29 € Phygenera https://phygenera.de/Murashig
MD105-1 e-Skoog-Basis-Salze-ohne-
Vitamine
Pinza curva 0,75 Bazar
Pinza grande 7,00 BriCor
Plancha 7,00 Ferretería
metacrilato
Plato cristal 0,85 Bazar
Pulverizador 1,50 IKEA
Plantas
Set tijeras 2,00 Bazar
Bazar
Silicona blanca 1,00
Tapa Caja 2,00 IKEA https://www.ikea.com/es/es/ca
talog/products/70110302/
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Compra de Coste € Envío Iva Tienda Enlace al producto

material
Coste Aproximado
Tarros cristal 7,00 Bazar
c/tapa
Termómetro 2,00 Bazar
Tiras espuma 0,90 Bazar
aislante
Tiras papel prueba 4,13 Amazon https://www.amazon.es/gp/pro
Ph, duct/B00YWK3MOK/ref=oh_aui_
detailpage_o02_s00?ie=UTF8&ps
c=1
Vaso medidor 0,50 Bazar
250ml
Vaso medidor 0,85 Bazar
500ml
Filtro de papel 0.78 Lidl
Totales € 133,85 24,06 2,99

1. En el caso del transporte para el pedido de los útiles del presupuesto se utiliza la tarifa más
económica. Se estima un porte por pedido, si se piden por separado, según la tarifa de la empresa
para envíos. Unificar pedidos para reducir los costes de envío.

2. Todos los productos y compuestos han sido utilizados en alguna fase del proceso.

3. Los precios son informativos pudiendo variar según la zona donde sean adquiridos.

4. Portes de envío e Impuestos, separados en los casos que no están incluidos en el precio unitario del
producto.

5. Bazar equivale a tienda de artículos económicos, tipo todo a 100, chinos, etc. Ferretería, tienda
especializada y repuestos y herramientas.

6. Son marcas registradas ® y de sus respectivos propietarios: Mercadona, Phygenera, Amazon, ALDI,
IKEA,BriCor,Primark,Lidl

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NOTAS DE SEGURIDAD

Descripción del proceso para personal mayor de edad en plenas facultades físicas y mentales, siendo
conscientes en todo momento del buen uso y manipulación de los productos enunciados, especialmente
los corrosivos como la lejía o inflamables como el alcohol.

En caso de ser menor de edad, no realizar este procedimiento, ni experimentar con los productos
enunciados ni con sus mezclas.

Aplicar medidas de protecciones individuales y colectivas a todo el proceso. Se recomienda el

uso de gafas de protección, mascarilla, guantes y ropa adecuada.

Especial atención a los líquidos inflamables como el Alcohol, pueden causar quemaduras y
lesiones. Alejar del fuego o cualquier fuente de calor.

Ver las indicaciones de seguridad del producto.

Tener localizado extintor de incendios y salidas de emergencia.

Especial atención a los líquidos corrosivos como la Lejía, pueden causar quemaduras y lesiones.

Deterioran tejidos y superficies.

Ver las indicaciones de seguridad del producto.

Tener localizado lugar de enjuague y limpieza.

Bajo ningún concepto incluir productos como Alcohol, Lejía, detergentes o desinfectantes en la olla a
presión. En la olla a presión aplicar los límites en tiempos de cocción y temperaturas descritas en las
indicaciones de seguridad de la olla a presión.

Si no estás seguro de poder experimentar con las suficientes garantías de seguridad para usted y su
alrededor (incluido otras personas y bienes) bajo ningún concepto realice esta práctica.

Asegúrese de que todo el material, útiles y productos están en perfectas condiciones de uso, siguiendo
siempre las indicaciones de sus respectivos fabricantes. Vea las indicaciones de seguridad.

El autor de este documento declina expresamente sus responsabilidades por el uso inadecuado de los
productos mencionados.

El autor de este documento declina expresamente sus responsabilidades por el uso de cualquier tipo de
mezcla realizada, proceso o material empleado.

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IMAGENES

Capsula Cattleya Donante

Cattleya Receptora GloveBox v.1.0

GloveBox v.1.0 GloveBox v.1.9 Frascos

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AGRADECIMIENTOS

Agradecimiento especial Usuaria Cati del foro InfoJardin, por su amabilidad y disposición para el envío de
las capsulas de semillas. Muchas gracias.

Agradecimiento a los miembros del foro InfoJardin, por sus hilos llenos de buenas prácticas,
conocimientos, experiencia y ganas de colaborar. Muchas gracias a todos

Agosto – 2018

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