CROMOSOMA PHILADELPHIA

Pruebas genéticas
Algún tipo de prueba genética se realizará para determinar si está presente el cromosoma
Philadelphia y/o el geneBCR-ABL. Este tipo de prueba se usa para confirmar el diagnóstico de
CML.
Citogenética convencional: esta prueba involucra la observación de los cromosomas (secciones
de ADN) con un microscopio para detectar cualquier cambio. También se llama determinación del
cariotipo. Los cromosomas celulares se observan mejor durante la división celular. Por esta razón,
para realizar esta prueba se debe cultivar en el laboratorio una muestra de sangre o de médula
ósea, para que las células comiencen a crecer y dividirse. Esta técnica requiere tiempo y no
siempre tiene éxito. Las células humanas normales tienen 23 pares de cromosomas, cada una de
las cuales tiene un tamaño definido. Las células leucémicas de muchos pacientes con CML
contienen un cromosoma anormal llamado cromosoma Philadelphia, que tiene la apariencia de un
cromosoma 22 corto. Esto sucede cuando se intercambian secciones (translocación) entre los
cromosomas 9 y 22 (lea la sección “¿Sabemos qué causa la leucemia mieloide crónica?”. La
detección del cromosoma Philadelphia es útil en el diagnóstico de CML. Aunque no se puede ver el
cromosoma Philadelphia, frecuentemente otras pruebas pueden detectar el gene BCR-ABL.
Hibridización fluorescente in situ  (FISH): la hibridización fluorescente in situ es otra manera de
ver los cromosomas. En esta prueba se utilizan tintes fluorescentes especiales que sólo se
adhieren a ciertas partes de los genes o los cromosomas. El FISH se puede usar para ver
secciones específicas del gen BCR-ABL  en los cromosomas. Se puede usar en muestras
regulares de sangre o de médula ósea sin necesidad de primero hacer cultivos de las células. Por
lo tanto, los resultados pueden estar disponibles en menos tiempo que con las citogenéticas
convencionales.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): es una prueba súper sensible que se puede usar
para identificar el oncogén BCR-ABL en las células de la leucemia. Puede hacerse en muestras de
sangre o de médula ósea y puede detectar cantidades muy pequeñas de BCR-ABL, aun cuando
los médicos no puedan detectar el cromosoma Philadelphia en las células de la médula ósea
mediante pruebas citogenéticas. La PCR se puede usar para ayudar a diagnosticar CML, y también
es útil después del tratamiento para ver si aún hay copias del gen BCR-ABL. Si aún se encuentran
copias de este gen, esto significa que la leucemia sigue presente, aun cuando las células no son
visibles en el microscopio.
El cromosoma Philadelphia descrito por Nowell y Hungerford en 19601, es la
anormalidad citogenética más común observada en leucemias. Esta anormalidad
cromosómica es originada por una translocación recíproca entre los cromosomas 9 y
22 t(9;22)(q34;q11)2.

En el cromososma 22 se encuentra la región BCR (breakpoint cluster region),

denominada también gen BCR, en el cual se puede distinguir la región mayor (M-bcr)
entre los exones 12 y 16 (originalmente descritos como exones b1-b5), la región
menor (m-bcr) ubicada entre los exones e2’ y e2 y la micro región (µ-bcr) ubicada en
el exon 193-5.

Cuando una parte del gen ABL (Abelson) localizado en el cromosoma 9, es transferida
e insertada dentro del gen BCR se origina el gen de fusión BCR-ABL. Los puntos de
ruptura más frecuentes en el gen BCR ocurren en los exones: 1(e1), 12(b2), 13(b3) y
19(e19) y el punto de ruptura en el gen ABL habitualmente se produce en el exon
2(a2), generando los reordenamientos e1a2, b2a2 o b3a2 y el e19a2. Los productos de
estos reordenamientos corresponden a proteínas de fusión de 190 kd (p190 BCR-ABL), de
210 kd (p210BCR-ABL) y de 230 kd (p230BCR-ABL), asociadas principalmente a leucemia
linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC) y LMC neutrófila
respectivamente4,6-9.

Normalmente el gen ABL codifica una proteína de 145 kd, con actividad tirosinaquinasa
que juega un rol crítico en el control y proliferación celular. Además se le ha asociado
un rol en la respuesta celular al estrés genotóxico. En cambio las proteínas generadas
del gen de fusión BCR-ABL tienen actividad tirosinaquinasa aumentada, lo que
favorece la proliferación neoplásica de las células hematopoyéticas a nivel de células
primitivas pluripotenciales, tanto en la LMC como en la LLA10-12. Recientemente se ha
introducido como tratamiento en la LMC, la droga Gleevec (STI 571) que actúa
precisamente inhibiendo la actividad de la tirosinaquinasa, con la cual se ha logrado
respuestas clínicas en un alto porcentaje de pacientes con LMC, especialmente en la
fase crónica o en la fase acelerada13,14.

El gen de fusión BCR-ABL está presente en más del 95% de las LMC y su detección
tiene importancia diagnóstica6,15,16. Se ha visto que se negativiza el gen de fusión BCR-
ABL con terapias prolongadas de Interferón Alfa16 y la detección de este gen post-
trasplante alogénico de médula ósea, es considerado un predictor independiente de
recaída15,18,19. En pacientes con LLA se ha detectado en el 3-5% de los niños y en el 20-
30% de los adultos6,7,16,20,21. Su presencia es un factor de mal pronóstico y de riesgo
independiente; presentando los pacientes una remisión de corta duración, por lo que
se recomienda terapias más agresivas y/o considerar el trasplante de médula
ósea18,20,21,23,24. En la LMA se ha detectado el gen de fusión BCR-ABL en el 2% de los
casos y sobre el 30% en la leucemia bifenotípica, siendo en ambas también un factor
de mal pronóstico16,25-27.

Durante varias décadas la detección y estudio de anormalidades citogenéticas se ha

realizado mediante el análisis o mapeo cromosómico. Actualmente técnicas de biología
molecular basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han permitido
identificar más de 50 translocaciones cromosómicas, muchas de las cuales han
demostrado ser específicas para distintos subtipos de leucemias. Una de las técnicas
más usadas, es la PCR con transcripción reversa (RT-PCR), mediante la cual a partir de
secuencias del ARN mensajero es posible detectar transcriptos de fusión del gen BCR-
ABL e identificar diferentes reordenamientos según el punto de ruptura dentro del gen
BCR con una mayor sensibilidad y especificidad que con el estudio citogenético 15,28,29.
De este modo, el uso de la técnica de RT-PCR entrega mayor información para el
diagnóstico y pronóstico de las leucemias, como también es de gran utilidad en la
detección de la enfermedad residual mínima (ERM) durante la remisión clínica 15,20,23,29.

Aun cuando la técnica de RT-PCR está disponible en nuestro país, no existe

información sobre la detección del gen de fusión BCR-ABL mediante esta técnica en
pacientes con leucemia; sólo existen trabajos donde se ha utilizado citogenética y
Southern Blot para la detección del cromosoma Philadelphia y reordenamientos del gen
BCR, respectivamente30,31.

Dada la escasa información existente en nuestro medio y considerando que en la IX

región el diagnóstico de los pacientes con leucemia no cuenta con el estudio
citogénetico ni molecular, nos propusimos detectar transcriptos de fusión que codifican
las proteínas p210BCR-ABL y p190BCR-ABL, mediante RT-PCR, en pacientes con leucemia
mieloide crónica y pacientes con leucemia aguda.

MATERIAL Y MÉTODO

Casos. Se estudiaron 58 pacientes en forma consecutiva, niños y adultos, durante

1999-2000, con diagnóstico de LMC y leucemia aguda. Todos procedían de la Unidad
de Hemato-Oncología del Hospital Temuco. Las muestras fueron obtenidas previo
consentimiento informado del paciente o de un familiar cercano. El presente estudio
fue aprobado de acuerdo a la Declaración de Helsinki, por el Comité de Etica del
Hospital Temuco.

Recolección de muestras. Se procesaron indistintamente muestras de aspirado de

médula ósea o sangre periférica32. Se recolectaron con EDTA, separando los leucocitos
con una solución de Lymphoprep (Nycomed Pharma Norway). El concentrado de
leucocitos se almacenó en tiocianato de guanidina a -70°C hasta la extracción de ARN
la cual se realizó según el método de Chomczynski33.

RT-PCR. Esta técnica amplifica secuencias de ADN a partir de ARN mensajero.

Mediante el uso de la enzima transcriptasa reversa, M-MLV (Gibco), se obtuvo una
copia del ADN. Se utilizó como control interno un PCR simple, empleando un par de
iniciadores dirigidos al gen DRB134. Posteriormente se realizó una PCR en nido con 30 y
35 ciclos y 64°C de temperatura de hibridación, usando 6 iniciadores (Tabla 1, Figura
1), que amplifican segmentos génicos de los transcriptos de fusión que codifican las
proteínas p210BCR-ABL (456 ó 385 bp) y p190BCR-ABL (444 bp) 15,28 (Figuras 2 y 3). Los
segmentos amplificados fueron visualizados por electroforesis en gel de agarosa al
1,8% teñido con bromuro de etidio.