FACULTAD DE TECNOLOGÍA MÉDICA

ESCUELA DE LABORATORIO Y ANATOMÍA PATOLÓGICA

HEMATOLOGÍA
Alumno: Espinoza Palomino Adrian.
Docentes:
 Mg. Prado Maggia Carlos Toribio

2020
 Dr. Soto Brito Ernesto
 Lic. Silva Quispe Vicenta Catalina
 Mg. Lazón Mansilla David
 Técnicas de Biología
molecular en el
diagnóstico y pronóstico
de las malignidades
hematológicas.
 CONTENIDO

¿Que es la biología molecular?

Aplicaciones de biología molecular en
hematología
Estrategias para la detección de enfermedad
residual mínima
Conclusiones
Bibliografia.
 ¿QUE ES LA BIOLOGÍA
MOLECULAR?
Disciplina científica que tiene como objeto de
estudio:
Composición
Desarrollo De los organismos
Relaciones vivos, desde un punto de
vista molecular.
Funcionamient
o
En un sentido moderno, la biología molecular
pretende explicar los fenómenos de la vida a partir
de sus propiedades macromoleculares,
Macromoléculas principales tomadas
como objeto de estudio en la biología
molecular:
Los ácidos nucleicos:
 Ácido desoxirribonucleico (ADN)
 Ácido ribonucleico (ARN)

Las proteínas.

Ambas moléculas son las que esencialmente

permiten el funcionamiento de los organismos
que existen en el planeta.
DOGMA CENTRAL DE LA
BIOLOGÍA MOLECULAR
¿Qué es el PCR?
PCR, o la reacción en cadena de la
polimerasa, es una reacción enzimática
in vitro en donde se amplifica
exponencialmente (se crean copias)
fragmentos de ADN, mediante la
utilización de la enzima de ADN
polimerasa.
Esta reacción permite que unos pocos
fragmentos de ADN se repliquen en
millones o miles de millones de copias.
La amplificación del ADN nos permite
estudiar la molécula del ADN en
detalle en el laboratorio.
¿Cómo se realiza?

Agua
ultrapura
Buffer
Mg ++
dNTPs
Primers
ADN
polimerasa
ADN de
interés
Variantes de la PCR
RT-PCR: Es una variante de la PCR muy utilizada en la que se utiliza ARN como
molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa reversa (una polimerasa
de ADN‐ARN dependiente) para realizar la síntesis de un ADN complementario al
ARN (ADNc).

PCR anidada o nested: Se trata de una técnica que aumenta la sensibilidad de la

PCR. En este caso se trabaja con 4 cebadores, en una primera ronda se amplifica de
manera convencional con los dos cebadores más externos a la región que se desea
amplificar.

PCR in situ: La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones

histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el
sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos.
En la técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificación de ADN blanco y
luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de
ADN/ARN.

PCR múltiplex: PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma
reacción. Emplea dos o más pares de cebadores en un único tubo con el fin de
amplificar simultáneamente diferentes fragmentos de ADN.
¿Qué es la electroforesis?
La electroforesis es una técnica de biología
molecular utilizada para separar el ADN, el
ARN, o moléculas o proteínas en base a su
tamaño y carga eléctrica.
Se utiliza una corriente eléctrica para mover
las moléculas y que se separen a través de un
gel.
Los poros del gel actúan como un colador,
permitiendo que las moléculas más pequeñas
se muevan más rápido que las grandes.
Las condiciones utilizadas durante la
electroforesis se pueden ajustar para separar
moléculas en el rango de tamaño que se
desee.
 APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA
MOLECULAR EN HEMATOLOGÍA
APLICACIONES
ÁREA
DIAGNOSTICAS
La utilización de técnicas
 Hemoglobinopatías
de biología molecular es Anemia  Talasemias
imprescindible para el  Enzimopatias
diagnostico de ciertas  Translocaciones
patologías. Hemoglobinas  Rearreglos genéticos
malignas  Detección de Enfermedad residual
Una de las grandes mínima.
ventajas que se tiene al Hemofilia y
trabajar con esta técnica Trombofilia
 Mutaciones en factores de coagulación

es por su alta sensibilidad. Hemocromatosis  Mutaciones del gen HFE

Trasplante  Tipificación de antígenos HLA

hematopoyético  Detección de quimerismo
Hemoglobinopatías Talasemias
En el caso de En el caso de las Talasemias se va a
hemoglobinopatías se trata tratar de un trastorno a nivel
cuantitativo de la proteína globina
de un trastorno a nivel
donde se tomará en cuenta la ausencia
cualitativo de la proteína o la síntesis reducida de las cadenas.
globina.
 Leucemias y
tratamiento
Las leucemias resultan de alteraciones clonales
que incrementan la tasa de duplicación o la
supervivencia, o ambas, de las células afectadas.
En muchas ocasiones, las alteraciones
moleculares son específicas para una neoplasia
particular, al punto de que el diagnóstico
definitivo se fundamenta en algunos casos en la
demostración de la anormalidad molecular.
El reto del diagnóstico consiste en diferenciar las
células malignas mediante criterios moleculares.
En general, estas alteraciones afectan el
funcionamiento o la regulación de oncogenes y
anti oncogenes que intervienen en la mitosis o de
proteínas que controlan la diferenciación y la
apoptosis.
 Leucemias y
tratamiento
La comprensión de las bases moleculares de la
transformación leucémica no sólo ha sido útil
para mejorar su diagnóstico, sino que ha abierto
un nuevo panorama en el tratamiento de algunas
variantes.
Un ejemplo muy ilustrativo es la leucemia
promielocítica, cuyo defecto causal es una
translocación que afecta al receptor del ácido
retinoico que participa en la diferenciación
celular.
Gracias al descubrimiento del defecto molecular
subyacente, el tratamiento incluye la
administración de ácido holotransretinoico a El 95% de las LPA se deben a la traslocación t(15;17)
(q24.1;q21.2) resultando la fusión génica PML/RARα que
dosis altas, para promover la diferenciación de codifica una proteína híbrida que bloquea la diferenciación
las células malignas y reducir así de manera de los promielocitos (8). Esta fusión presenta tres subtipos
moleculares según el punto de corte en el gen PML en el
radical la masa tu moral. cromosoma 15 (9) (Figura 1), si sucede en el intrón 6 será
Además de detectar las lesiones moleculares isoforma L (Long) o bcr1, en el exón 6 será isoforma V
(Variable) o bcr2 y en el intrón 3 será isoforma S (Short) o
 TRASLOCAC PADECIMIENTO
Traslocaciones IÓN RELACIONADO
cromosómicas IgH/MYC/CEP8
 Leucemia linfoblástica
 Linfoma no Hodgkin
 Linfoma de Burkitt
Se han descrito múltiples AM L I/ETO  Leucemia mieloide (M2)
alteraciones cromosómicas en las
BCR/ABL p190  Leucemia linfoblástica
células neoplásicas de pacientes
con neoplasias hematopoyéticas. BCR/ABL p210  Leucemia granulocítica crónica
La detección por métodos Fusiones con MLL  Leucemias agudas
puramente morfológicos ha  Leucemia linfoblástica en edad
TEL/AM ILI
pasado a la historia. pediátrica
Mediante técnicas de biología Bc12AgH  Linfoma centrofolicular
molecular es posible
Translocaciones de  Linfomas de estirpe B
identificarlas con gran Bcl6
sensibilidad y especificidad, de
PML/RARa  Leucemia promielocítica
tal manera que la utilidad de su
detección no se limita al CBFB/MYH 11  Leucemia mielomonocítica
diagnóstico, sino que encuentra Deleción 5q‑  Síndromes mielodisplásicos
gran aplicación en la detección de
Cromosoma Filadelfia en la
leucemia
granulocítica crónica
La citogenética y la biología molecular han
demostrado que la leucemia granulocítica crónica
(LGC) tiene su origen en una mutación de una
célula madre pluripotencial mieloide-linfoide.
En biología molecular la alteración se define
como una fusión bcr/abl, que describe que el
defecto molecular afecta al oncogén abl, ubicado
en la banda q34.1 del cromosoma 9 y a la cinasa
de serina/ treonina bcr localizada en la banda
q11.2 del cromosoma 22.
El análisis del cromosoma Filadelfia mediante
RT-PCR tiene una sensibilidad muy alta, ya que El descubrimiento de que el gen de fusión BCR-ABL1
permite detectar una célula maligna en 10 000 a codifica a una cinasa de tirosina constitutivamente
activada llevó al descubrimiento del mesilato de imatinib,
100 000 células normales.
un inhibidor específico de esta enzima
La información sobre la cantidad de enfermedad
 CROMOSOMA FILADELFIA
(Ph1)
t(9;22) (9q34;22q11): 95% LMC adultos,5% aLMC (LMC atípica, en
ancianos, pierden cromosoma Filadelfia, otras alteraciones
cromosómicas), ; 2-3-% LAL adultos; 5% LAL niños

ABL: 9q34 : codifica dos proteínas de 145 KDa, dominio tirosín kinasa.
Expresión amplia, localización mayormente nuclear.
Función: inhibe crecimiento celular.

BCR: 22q11 : codifica una forma principal de 160 KDa. Expresión

amplia, localización citoplasmática.
Función: rol probable en transducción de señales

Fusión BCR/ABL: proteína codificada: una forma de 210 KDa de

ONCOGÉNESIS
localización citoplásmatica.
Función: carcinogenético.
La proliferación es inducida cuando BCR/ABL
activa la vía Ras de señales de transducción.

Se inhibe la apoptosis celular.

BCR/ABL provoca anomalías de adhesión

celular de células estromales a la médula ósea
con proliferación descontrolada de progenitores
mieloides leucémicos que, se mantienen más
tiempo en fase de proliferación antes de ir a la
diferenciación.
 Cuantificación de bcr/abl
p210/p190/p230
PCR en tiempo real
LMC: t(9;22) -> gen de fusión bcr/abl

Estudiamos RNA
quimérico
PCR cuantitativa en tiempo
Real de bcr/abl
La molécula de partida es cDNA (molécula estable y
fácil de manipular) sintetizado a partir del RNA
extraído.
Para la amplificación tenemos que emplear unos
cebadores (primers) uno en el gen bcr y otro en el gen
abl y una sonda fluorescente que generalmente es
TaqMan que se sitúa en el gen abl. Estos primers y
sondas nos van a permitir amplificar la zona de fusión
bcr/abl y monitorizar la amplificación mediante la
emisión de fluorescencia.
La reacción de PCR se debe hacer en un
termociclador al que se ha adaptado un fluorímetro.
 Objetivos clave del tratamiento
Inhibidores de tirosina-cinasa (TKI)
Finalidad del tratamiento:
El objetivo inmediato es reducir la masa leucocitaria.
El objetivo final es alcanzar la remisión molecular.
En la actualidad y con el uso de los ITK, la enfermedad
se ha cronificado, incluso los pacientes con buena
respuesta a estos fármacos tienen expectativa de vida
similar a la población sana.
Mejoría en la supervivencia de los pacientes.
Cambios en la práctica clínica habitual.
Repercusión económica.
Prevenir la progresión a fase aguda.
Potenciar y conseguir la RMM, individualizando el
tratamiento para cada
tipo de paciente:
Excelente pronóstico a largo plazo.
 ESTRATEGIAS PARA LA DETECCIÓN
DE ENFERMEDAD RESIDUAL MÍNIMA
Desde varios decenios, una de las preguntas que Es por eso que se necesita un método con una
se hace el medico participante en el tratamiento capacidad lo suficientemente sensible para
de padecimientos oncohemtológicos es el poder manejar estos datos, es ahí donde entra a
momento en que debe suspender o continuar la tallar la biología molecular, no obstante, el uso
terapia de consolidación, con base en el grado de citometría de flujo, así como los métodos
de erradicación de la enfermedad. inmunológicos no deben dejarse de lado.
Este termino de enfermedad residual hace
alusión a la masa tumoral que persiste en un
enfermo después de completar un esquema de
tratamientos considerado como completo o
eficaz.
Se acepta de manera unánime que, si un
individuo con leucemia aguda tiene una o más
células malignas por cada 1000 células
normales, la recaida será inminente.
Por otro lado, si e encontramos una celula
 CONCLUSIONES
La biología molecular tiene un papel importante en la
mayoría de las ciencias, y la hematología no es la
excepción, esta técnica genera muchos avances en el
diagnostico de ciertas patologías, así como también en la
verificación de su tratamiento.
Es importante conocer los métodos de biología molecular
y sus fundamentos para tener una visión mas amplia del
diagnostico de ciertas patologías.
 BIBLIOGRAFÍA

1. Jaime Pérez, J., & Gómez Almaguer, D. (2015). Hematología (pp. 289-295). México: McGraw-Hill.

2. Castro-Mujica, M., & Sullcahuamán-Allende, Y. (2014). Subtipos moleculares de PML/RARa en

pacientes con leucemia promielocítica aguda. Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud
Pública, 30(1). doi:https://doi.org/10.17843/rpmesp.2013.301.153

3. Amor Vigil, Ana María, & Hernández Miranda, Londy Lorena. (2019). La biología molecular en el
diagnóstico de la leucemia mieloide aguda. Revista Cubana de Hematología, Inmunología y
Hemoterapia, 35(3), e987. Epub 30 de noviembre de 2019. Recuperado en 23 de octubre de 2020, de
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-02892019000300002&lng=es&tlng=es.

4. Provan D, Viswanatha DS, Larson RS. Técnicas  moleculares  en  el diagnóstico de 

neoplasias hematopoyéticas. En: Henry, JB (editor).  El laboratorio  en  el 
diagnóstico  clínico. Madrid, España: Marbán  Libros, 2005:1355-1371.