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Las norma s técnicas perua nas y extranjeras, están

protegidas por las leyes de derecho de autor (N°822),
quedando prohibido la reproducción total o parcial con fines
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los documentos técnicos.
I NTERNATIONAL ISO
STANDARD 15214

Firstedition

1998-08-01

Microbiología de alimentos y piensos. Método horizontal

para la enumeración de bacterias mesófilas ácido lácticas.
Técnica de recuento de colonias a 30 ° C.

Microbiologie des aliments–Methodehorizontalepour le denombrementdes

bacterieslactiquesmesophiles- Techniques par comptage des colonies30°C
ISO15214:1998(E)

Contenido

1. Alcance.........................................................................................1

2. Referencias Normativas................................................................1

3. Definiciones...................................................................................1

4. Principio.........................................................................................2

5. Diluyente y medio de cultivo..............................................................2

6. Aparatos y artículos de vidrio.........................................................3

7. Muestreo........................................................................................3

8. Preparación en la muestra............................................................4

9. Procedimiento...............................................................................4

10. Expresión de resultados..............................................................5

11. Límites de confianza.............................................................................6

12. Informe de prueba.............................................................................6

Anexo A (informativo) Bibliografía..................................................7

©ISO ISO
15214:1998(E)

Prefacio

ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de

organismos nacionales de normalización (organismos miembros de ISO). El trabajo de
preparación de las Normas Internacionales normalmente se realiza a través de los
comités técnicos de ISO. Cada organismo miembro interesado en un tema para el cual
se ha establecido un comité técnico tiene el derecho de estar representado en ese
comité. Las organizaciones internacionales, gubernamentales y no gubernamentales,
en contacto con ISO, también participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente
con la Comisión Electrotécnica Internacional (IEC) en todos los asuntos de
estandarización electrotécnica.

Los proyectos de Normas Internacionales adoptados por los comités técnicos se

distribuyen a los organismos miembros para su votación. La publicación como Norma
Internacional requiere la aprobación de al menos el 75% de los organismos miembros
que emiten un voto.

La Norma Internacional ISO 15214 fue preparada por el Comité Técnico ISO / TC34,
Productos alimenticios agrícolas, Subcomité SC9, Microbiología.

El Anexo A de esta Norma Internacional es solo para información.

ISO 15214:1998(E) ©ISO

Introducción

Debido a la gran variedad de alimentos y piensos, este método horizontal puede no

ser apropiado en todos los detalles para ciertos productos. En este caso, se pueden
utilizar diferentes métodos específicos de estos productos si es absolutamente
necesario por razones técnicas justificadas. Sin embargo, se debe hacer todo lo
posible para aplicar este método horizontal en la medida de lo posible.

Cuando se revise a continuación esta Norma Internacional, se tendrá en cuenta toda la

información disponible en lo que respecta a la medida en que se ha seguido este
método horizontal y las razones de las desviaciones de este método en el caso de
productos particulares.

La armonización de los métodos de prueba no puede ser inmediata y, para ciertos

grupos de productos, es posible que ya existan estándares internacionales y/o
estándares nacionales que no cumplan con este método horizontal. Se espera que
cuando se revisen dichos estándares se modifiquen para cumplir con estos
Estándares Internacionales o que, finalmente, las únicas desviaciones restantes de
este método horizontal sean aquellas necesarias por razones técnicas bien
establecidas.
INTERNATIONAL STANDARD ©ISO ISO15214:1998(E)

Microbiología de alimentos y piensos. Método horizontal para

el recuento de bacterias mesófilas ácido lácticas. Técnica de
recuento de colonias a 30 ° C.

1. Alcance

Esta Norma Internacional especifica un método horizontal para la enumeración de

bacterias mesófilas viables ácido lácticas contando las colonias que crecen en un
medio sólido después de la incubación a 30 ° C durante 3 días.

NOTA: En algunos productos alimenticios, existen bacterias acido lácticas

psicotrópicas o termófilas que requieren temperaturas de cultivo diferentes a 30 ° C.
Además, no todas las bacterias ácido lácticas crecen en agar MRS a pH 5,7 y algunas
crecen solo débilmente.

Sujeto a las limitaciones discutidas en la introducción y en la nota anterior, esta Norma

Internacional es aplicable a productos destinados al consumo humano o alimentos
para animales.

2. Referencias Normativas
Las siguientes normas contienen disposiciones que, mediante su referencia en este
texto, constituyen disposiciones de esta Norma Internacional. En el momento de la
publicación, la edición sindicada era válida. Todas las normas están sujetas a revisión,
y se recomienda a las partes del acuerdo basadas en la Norma Internacional que
investiguen la posibilidad de aplicar las ediciones más recientes de las normas que se
detallan a continuación. Los miembros de IEC e ISO mantienen registros de las
normas internacionales vigentes.

ISO6887-1:-1), Microbiología de alimentos y piensos.- Preparación de muestras de

prueba, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico. Parte 1:
Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y diluciones decimales.

ISO7218: 1996, Microbiología de los alimentos para consumo humano y alimentación

animal. Reglas generales para los exámenes microbiológicos.

3. Definiciones

A los fines de esta Norma Internacional, se aplica la siguiente definición.

3.1
Bacterias mesófilas ácido lácticas
Bacterias que forman colonias a 30 ° C en un medio sólido selectivo (MRS a pH 5,7)
bajo las condiciones de prueba especificadas en esta Norma Internacional.
ISO15214:1998(E) ©ISO

4 Principio

4.1 Preparación de dos placas con agar MRS a pH 5,7 contenido en placas Petri. Verter en
placa o, posiblemente, en 2) inoculación de las placas con una cantidad específica de la
muestra de prueba si el producto inicial es líquido, o con una cantidad especificada de la
suspensión inicial en el caso de otros productos.

4.2 Inoculación de otros pares de placas, en las mismas condiciones, usando diluciones
decimales de la muestra de prueba o de la suspensión inicial.

Incubación de los platos a 30 ° C durante 72 h.

4.3 Cálculo del número de bacterias mesófilas ácido lácticas (3.1) por gramo o por mililitro de
muestra de prueba a partir del número de colonias obtenidas en 4.2 en las placas
seleccionadas, y posiblemente confirmadas 3).

5 Diluyente y medio de cultivo.

5.1 General

Para la práctica de laboratorio actual, ver ISO 7218.

5.2 Diluyente

Consulte la norma ISO 6887-1.

NOTA El agua de peptona tamponada no siempre permite la reanimación satisfactoria de las

bacterias del ácido láctico (ver anexo A-references [1], [2], [3]).

5.3 Medio de cultivo: medio MRS (de Man, Rogosa y Sharpe) a pH 5,7 (ver referencia [4])

NOTA El uso de medios listos para usar disponibles comercialmente es aceptable. Sin
embargo, se debe prestar atención al hecho de que las variaciones en la composición y el pH
pueden ocurrir entre productos de diferentes fabricantes y, por lo tanto, pueden dar resultados
diferentes a los obtenidos con el medio como se especifica en esta Norma Internacional.

5.3.1 Composición
 Digestivo enzimático de la caseína 10,0g
 Extracto de carne 10,0g
 Extracto de levadura 4,0g
 Citrato de triamonio [(NH4) 3C5H507] 2,0 g
 Acetato de sodio (CH3COONa) 5,09
 Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 • 7H20) 0,2 9
 Tetrahidrato de sulfato de manganeso (MnS04 • 4H20) 0,05g
 Hidrofosfato de dipotasio (K2HP04) 2,0g
 Glucosa (C5H1205) 20,0g
 Monooleato de polioxietilenorbita (Tween80) 1,089
 Agar 12gto18g1)
 Agua 1000ml
1) Dependiendo de la fuerza del gel del agar.

2) Ver nota 1 en 9.2.

3) Ver nota 2 en 9.3.
ISO15214:1998(E) ©ISO

5.3.2 Preparación

5.3.2.1 Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en el agua hirviendo.

Usando el medidor de pH (6.7), ajuste el pH de modo que después de la esterilización sea de
5,7 ± 0,14) a 25 ° C.
Transfiera el medio a botellas de la capacidad adecuada.

Esterilizar durante 15 minutos en el autoclave (6.1) a 121 ° C.

Si el medio se va a usar inmediatamente, enfríelo antes de usarlo a aproximadamente 47 ° C

en el baño de agua (6.5), o mediante cualquier otra técnica que dé resultados equivalentes
(consulte ISO7218).

Si no, para evitar cualquier retraso al verter el medio antes de comenzar el examen
microbiológico, derrítalo completamente en un baño de agua hirviendo (6.6), luego enfríelo a
aproximadamente 47 ° C en el baño de agua (6.5).

5.3.2.2 Si existe el riesgo de una gran contaminación por levaduras (por ejemplo, en salchichas
secas), agregue ácido sórbico al medio MRS de la siguiente manera.

Disuelva 1,4 g de ácido sórbico en aproximadamente 10 ml de una solución de hidróxido de

sodio 1 mol / l. Esterilizar por filtración. Agregue esta solución a 1000 ml de agar MRS
esterilizado, previamente enfriado a aproximadamente 47 ° C. El pH final del medio será de 5,7
± 0.1 a 25 °C.

6. Aparatos y Cristalería.

Aparatos de laboratorio microbiológicos habituales (ver ISO 7218) y, en particular, los

siguientes.

6.1 Aparatos para esterilización en seco (horno) o esterilización húmeda (autoclave)

Ver ISO 7218.

6.2 Incubadora, capacidad de funcionamiento a 30 °C ± 1 ° C.

6.3 Placas de Petri, de vidrio o plástico, con un diámetro de 90 mm a 100 mm.

6.4 Entrega total de pipetas graduadas, de capacidad nominal de 10 ml y 1 ml, graduadas

respectivamente en divisiones de 0,5 ml y 0,1 ml.

6.5 Baño de agua, o aparatos similares, capacidad de funcionamiento a 47 °C ± 2 °C.

6.6 Baño de agua hirviendo.

6.7 pH - metro, capaz de ser leído a la unidad más cercana de pH 0,01 a 25 ° C, lo que
permite realizar mediciones con una precisión de ± 0,1 pH.

7 Muestreo

El muestreo no es parte del método especificado en esta Norma Internacional. Si no hay una
Norma Internacional específica que trate con el muestreo del producto en cuestión, se
recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este tema.
4) Para que el valor de pH no caiga por debajo de 5,6, la tolerancia aquí es de ± 0,1 en lugar de ± 0,2
como de costumbre.
ISO15214:1998(E) ©ISO

Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa y
que no haya sido dañada o cambiada durante el transporte o el almacenamiento (ver ISO
7218).

8 Preparación de la muestra de ensayo.

Prepare la muestra de prueba de acuerdo con la Norma Internacional específica
correspondiente al producto en cuestión. Si no existe una Norma Internacional específica, se
recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este tema.
9 Procedimiento

9.1 Porción de prueba, suspensión inicial y diluciones.

Prepare la suspensión inicial y las diluciones de acuerdo con ISO 6887-1.

9.2 Inoculación e incubación.

NOTA1 Se puede aplicar un revestimiento de superficie en combinación con la incubación en

condiciones anaeróbicas o microaeróbicas en lugar del procedimiento de revestimiento por
placa vertida. Los frascos de velas pueden usarse para obtener las condiciones apropiadas.

NOTA2 También es posible utilizar un medio MRS de doble capa.

9.2.1 Tomar dos placas de Petri estériles (6.3). Con una pipeta estéril (6.4), transfiera a cada
placa 1 ml de la muestra de prueba si el producto es líquido, o 1 ml de la suspensión inicial en
el caso de otros productos.

Tome otras dos placas de Petri estériles. Usando una pipeta estéril nueva, transfiera a cada
plato 1 ml de la primera dilución decimal de la muestra de prueba si el producto es líquido, o 1
ml de la primera dilución decimal de la suspensión inicial en el caso de otros productos.
Repita el procedimiento descrito con las diluciones adicionales, utilizando una pipeta estéril
nueva para cada dilución decimal.
NOTA Si se esperan grandes cantidades de bacterias ácido lácticas, es posible aislar solo las
diluciones necesarias para poderlos enumerar de acuerdo con el caso general (ver 10.1).
9.2.2 Vierta en cada una de las muestras aproximadamente 15 ml del medio de MRS (5.3) el
cual ha sido preparado luego enfriado 47 °C en el baño de agua (6.5).
Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio y permitir que la mezcla se solidifique.
9.2.3 Invertir las placas preparados e incubarlos en el la incubador (6.2) a 30 ° C durante 72 h ±
3 h. Evitar la desecación de los inventos que se encuentren en ese momento y que no tengan
efecto inhibidor.

9.3 Recuento de colonias

Después del período de tiempo especificado (Ver 9.2.3), cuente las colonias en cada punto
(ver notas 1 y 2).

Los residuos que contienen menos de 300 colonias en las siguientes soluciones, y más de 15
colonias en un plato de levadura.

NOTA1 Algunos Leuconostoc sp. Debe formar colonias largas y delgadas que pueden ocultar
el desarrollo de otras colonias, lo que puede provocar una subestimación de las numerosas
bacterias ácido lácticas.
©ISO ISO15214:1998(E)

NOTA 2 Debido al posible desarrollo de microorganismos distintos de las bacterias ácido

lácticas en el medio MRS, como se describe en 9.2, puede ser necesario en algunos casos y
para algunos productos confirmar las colonias obtenidas en 9.2 mediante técnicas simples
(como la tinción de Gram, o la prueba de la catalasa). En el informe de la prueba debe
mencionarse un procedimiento, si se realiza.

10.1 Caso general

Calcule el número N de bacterias mesófilas ácido lácticas presentes en la muestra de prueba,

como la media ponderada de dos diluciones sucesivas, utilizando la ecuación:

Donde:
∑C :Es la suma de las colonias contadas en todos los platos de dos diluciones sucesivas, al
menos una de las cuales contiene al menos 15 colonias.
V: Es el volumen de inóculo aplicado a cada plato, en mililitros.
n1: Es el número de platos retenidos en la primera dilución
n2: Es el número de platos retenidos en la segunda dilución
d: Es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución retenida

Redondee los resultados calculados a dos cifras significativas (véase ISO7218).

Tome como resultado el número de bacterias mesófilas ácido lácticas por mililitro (productos
líquidos) o por gramo (otros productos), expresado como un número entre 10 y 9,9 multiplicado
por la potencia adecuada de 10.

EJEMPLO

∑C 168+215+14+25 422
N= = 2 = = 19182
V(n1+0,1n2)𝑑 1(2+0,1x2)10− 0,022

El redondeo a dos cifras significativas da 19000 o 1,9x104 bacterias mesófilas ácido lácticas
por gramo de producto.

10.2 Estimación de números bajos

10.2.1 Si las dos placas, a nivel de la muestra de prueba (productos líquidos) o de la

suspensión inicial (otros productos) contienen menos de 15 colonias, calcule la media
aritmética y de las colonias contadas en dos placas.

Exprese los resultados de la siguiente manera:

- Para productos líquidos: número estimado de bacterias mesófilas ácido láctico por
mililitro NE = y
- Para productos líquidos: número estimado de bacterias mesófilas ácido lácticas por
gramo de NE= y/d

donde D se encuentra el factor de dilución de la suspensión inicial.

©ISO ISO15214:1998(E)

10.2.2 Si los dos platos, a nivel de la muestra de prueba (productos líquidos) o de la

suspensión inicial (otros productos) no contienen colonias, exprese los resultados de la
siguiente manera:

Menos de 1 bacteria mesófila de ácido láctico por mililitro (productos líquidos); menos
de 1 / d bacteria mesófila de ácido láctico por gramo (otros productos);
Donde se encuentra el factor de dilución de la suspensión inicial.

11 límites de confianza

Para el cálculo de los intervalos de confianza, ver ISO 7218.

12 Informe de prueba

El informe del ensayo especificará:

- Toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra.

- El método de muestreo utilizado, si se conoce el método de prueba utilizado, con
referencia a esta Norma Internacional.
- todos los detalles de operación no especificados en esta Norma Internacional, o
considerados como opcionales, para obtener con ella detalles de cualquier incidente
que pueda haber influido en los resultados de la prueba;
- El (los) resultado (s) de la prueba obtenidos
- Si se ha verificado la repetibilidad, se obtiene el resultado final cita

©ISO ISO15214:1998(E)
 Bibliografía
Anexo A
(informativo)
1) HARTMAN,P.A.andHUNTSBERGER,D.V.Influenceof
subtledifferencesinplatingprocedureonbacterialcountsofpreparedfrozenfood
s.J.Appl.Microbiol.,9,1961,p. 32.
2) 2) JAYN-
WILLIAMS,D.J.Reportofadiscussionontheeffectofthediluentontherecoveryof
bacteria J.Appl.Bacteriol.,26, 1963,p.398.
3) KING,W.L.andHURST,A.Anoteonthesurvivalofsomebacteriaindifferentdiluents.J
.Appl.Bacteriol.,26,1963,p.504.
4) PharmacopoeiaofCultureMediaforFoodMicrobiology:deDeMan,RogosaandShar
peagarwithsorbicacid(MRS-Sagar).Int.J.FoodMicrobio/.,5,1987,pp.230-232.