Identificación de ​Haemophilus sp​ y ​Neisseria sp

​ ​Neisseriaceae
Familia ​Pasteurellaceae y

Resumen

En esta práctica se realizó una identificación de cocos Gram-negativos,

pertenecientes a la familia ​Pasteurellaceae ​y ​Neisseriaceae​; para la

identificación de la especie de​ Haemophilus​ inicialmente se realiza una

coloración de Gram en el cual se deben encontrar cocos Gram-negativos

aunque son pleomórficos, también se realizan las siguiente pruebas

bioquímicas: oxidasa, catalasa, se realiza aislamiento en agar chocolate y agar

sangre, prueba de requerimiento de factores X (HEMINA) y V (NICOTINAMIDA

ADENINA-DINUCLEÓTIDO) en agar BHI; para la identificación de la especie

de ​Neisseria​ inicialmente se aplica una coloración de Gram en la cual se

encontrarán cocos Gram-negativos en la cual se realizan las siguientes

pruebas bioquímicas: catalasa , oxidasa,siembra en medio Thayer Martin,

finalmente, realice la prueba de utilización de azúcares al 1% en medio CTA

(Cistina Tripticasa-Agar), con los siguientes carbohidratos: glucosa, maltosa,

sacarosa, lactosa y fructosa.

Neisseria sp ​pertenece a la familia Neisseriaceae, son cocos Gram-negativos

catalasa y oxidasa positivas; ​Neisseria ​si es patógena requiere ambiente

microaerofílico ( CO​2​ del 5%), y soportes nutricionales especiales, entre los

patógenos más importantes para el humano se encuentran : ​Neisseria

meningitidi​s​ y​ ​Neisseria gonorrhoeae​ (1). Haemophilus perteneciente a la

familia Pasteurellaceae, son bacterias Gram- negativas pleomórficas pero

típicamente cocobacilares, son catalasa positiva y oxidasa negativa entre las

especies patógenas más conocidas están: ​H. influenzae​ y ​H. ducreyi​.(1)

Familia ​Pasteurellaceae ​y ​Neisseriaceae

Palabras clave​: Bacillus, Identificación, asimilación, bioquímica, azúcares

Introducción

Esta práctica tiene como objetivo identificar la especie de las cepas Neisseria y

Haemophilus (cocos Gram-negativos) entregadas en laboratorio, provenientes

del cepario de la Pontificia Universidad Javeriana nombrados como cepa 1

(​Neisseria​) y cepa 2 (​Haemophilus)​ , entregadas en agar chocolate , iniciando

con una coloración de Gram, para ambas cepas al igual que prueba de oxidasa

y catalasa; para ​Haemophilus​ se realiza aislamiento en agar chocolate y agar

sangre, prueba de requerimiento de factores X (HEMINA) y V (NICOTINAMIDA

ADENINA-DINUCLEÓTIDO) en agar BHI y para ​Neisseria s​ iembra en medio

Thayer Martin por aislamiento, y la prueba de utilización de azúcares al 1% en

medio CTA (Cistina Tripticasa-Agar), con los siguientes carbohidratos: glucosa,

maltosa, sacarosa, lactosa y fructosa.

Neisseria sp ​pertenece a la familia Neisseriaceae, son cocos Gram-negativos

aerobios catalasa y oxidasa positivas, agrupados en parejas, poseen los lados

adyacentes aplanados que originan formas características de granos de café,

Neisseria si es patógena requiere ambiente microaerofílico ( CO​2​ del 5%), y

soportes nutricionales especiales, estas crecen en medios de cultivo

enriquecidos adicionados con antibióticos que actúan como inhibidores como el

agar chocolate. mientras​ Neisseria​ no patógena es menos exigente; entre las

especies más patógenas en humanos están ​Neisseria gonorrhoeae​ ​causante

de enfermedades de transmisión sexual, las infecciones causadas por esta

bacteria ​Familia ​Pasteurellaceae ​y ​Neisseriaceae

suelen estar localizadas en las superficies mucosas del área de exposición

inicial como cuello uterino, conjuntiva, superficie faríngea, región anorectal

entre otras también esta ​Neisseria meningitidi​s​, una de las más comunes

causas de ​meningitis​ bacteriana y agente causal de ​sepsis​ meningocócica.(1)

Haemophilus​ perteneciente a la familia Pasteurellaceae, bacterias Gram-

negativas pleomórficas pero típicamente cocobacilares, son catalasa positiva y

oxidasa negativa. La mayoría de las especies de Haemophilus necesitan para

su crecimiento hemina (factor X) y nucleótido de nicotinamida y adenina (factor

V), dependiendo de su especie pueden utilizar uno solo o ambos, algunas

especies son parte de la flora normal del tracto respiratorio, pero pueden

producir diversos infecciones, como faringitis. La superficie de muchas de las

cepas de H. influenzae está recubierta de una cápsula de polisacárido, y se

han identificado seis serotipos antigénicos (de la a a la f). ​H. influenzae

ocasiona meningitis y septicemia a niños. ​H. ducreyi​ es un agente causante de

una enfermedad de transmisión sexual (​chancro​ide), una enfermedad de

transmisión sexual que se caracteriza por la aparición de llagas dolorosas en

el área genital llamadas chancros.(1)

Materiales y métodos

Se reciben dos cepas la cepa 1 (​Neisseria sp​) y la cepa 2 ( ​Haemophilus sp​)

provenientes del cepario de la Pontificia Universidad Javeriana sembradas en

agar sangre (​Neisseria sp​) ​ que es un medio altamente nutritivo​ ​, las fuentes de

nutrientes en este medio son el extracto de levadura y triptona​, la inhibición de

​ ​Neisseriaceae
la ​Familia ​Pasteurellaceae y

mayoría de enterobacterias se da por las altas concentraciones de tiosulfato y

citrato, pH alcalino y bilis, posee como indicadores el azul de timol y el azul de

bromotimol, la presencia de cloruro de sodio favorece el crecimiento de, el

tiosulfato de sodio también realiza un aporte de azufre y junto con el citrato

férrico permiten la detección de producción de ácido sulfhídrico(2) ​y en ​agar

chocolate ​ ( ​Haemophilus sp​) ​que es un medio altamente nutritivo ya que

contiene peptona, triptona, extracto de levadura, extracto de corazón,sangre

ovina y almidón(3); este agar se obtiene calentando la sangre antes de añadirla

al medio por esta razón este agar contiene hemoglobina que aporta al medio el

factor X o hemina (4)

El primer paso a realizar en una lámina con la ayuda del asa redonda, es una

coloración de Gram, la cual está constituida por una serie de compuesto que

deben ser aplicados en su orden primero está el cristal violeta que es un

colorante catiónico que posee la capacidad de penetrar todas las células

bacterianas a través de su pared, a este le sigue el lugol que está formado por
yodo en equilibrio con yoduro de potasio y siulterio, este compuesto actúa

como mordiente con el fin de que el cristal violeta se fije con mayor intensidad

debido a la formación de un complejo insoluble en solución acuosa con el

cristal violeta, el siguiente compuesto es el alcohol-acetona que sirve para

realizar la decoloración ya que solubiliza el complejo formado por el lugol y el

cristal violeta, el cuarto compuesto es un colorante de contraste llamado

fucsina .(5)

Se realiza la prueba de la oxidasa la cual resulta positiva para ​Neisseria sp​ la

cual se encarga de identificar la producción de citocromo oxidasa de la bacteria

Familia ​Pasteurellaceae ​y ​Neisseriaceae

al mezclarse con​ ​N,n,n,n-tetrametil-p-fenilendiamina​ produce una coloración

azul lo cual indica un resultado positivo (6) posteriormente se inicia la prueba

de la catalasa en la cual se evalúa la producción de la enzima catalasa que la

poseen la mayoría de las bacterias aerobias, esta enzima descompone el

peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, el desprendimiento de burbujas

procedentes del oxígeno indica que la prueba es positiv​a.(6)

En la identificación de la especie de​ Haemophilus s​ e realiza aislamiento en

agar chocolate que es un medio altamente nutritivo ya que contiene peptona,

triptona, extracto de levadura, extracto de corazón,sangre ovina y almidón(4);

este agar se obtiene calentando la sangre antes de añadirla al medio por esta

razón este agar contiene hemoglobina que aporta al medio el facto X o hemina

(5) y agar sangre que es un medio altamente nutritivo, compuesto por infusión

de músculo de corazón y la peptona, permitiendo el crecimiento de una gran

variedad de microorganismos se añade sangre al medio de cultivo, en una

concentración final de 5-10 %, y este permite detectar hemólisis (4),

seguidamente se realiza la prueba de requerimiento de factores X (HEMINA) y

V (NICOTINAMIDA ADENINA-DINUCLEOTIDO) en agar BHI, en esta prueba

se observa el desarrollo de ​Haemophilus​ dependiente de la presencia del factor

X , V o ambos, lo cual permite diferenciar sus especies; el factor X ​ ​es la región

hem de la hemoglobina (protoporfirina) la cual es necesaria para sintetizar las

enzimas respiratorias llamada también hemina y hematina, posee

termoestabilidad, el factor V es una coenzima llamada Nicotinamida Adenina

Dinucleotido mas ​Familia ​Pasteurellaceae ​y ​Neisseriaceae

conocida como NAD la cual es termolábil (6)

​ ara la identificación de ​Neisseria,​ a parte de las pruebas y procedimientos

P

comunes a los dos microorganismos se realiza: siembra en medio Thayer

Martin que contiene los mismos componentes del agar chocolate sumados a

un suplemento llamado IsoVitaleX y los antimicrobianos colistina (inhibe bacilos

Gram-negativos), nistatina (para inhibir levaduras) y vancomicina (para inhibir

bacterias Gram-positivas)(8), finalmente, realice la prueba de utilización de

azúcares al 1% en medio CTA (Cistina Tripticasa-Agar) el medio CTA es un

medio nutritivo que permite el crecimiento de microorganismo exigentes que

posee tripteina como fuente de nitrógeno, aminoácidos y vitaminas,la cistina y

el sulfito de sodio favorecen el crecimiento bacteriano, el indicador de pH es el

rojo de fenol y es un medio semisólido con los siguientes carbohidratos :

glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa y fructosa ideal para verificar la capacidad

de fermentación por ​Neisseria ​lo cual genera un viraje amarillo del medio (6)

Resultados

​Neisseria sp

Coloración de Gram: cocos Gram-negativos

Catalasa: positivo

Oxidasa: positiva

cepa/ Lactosa Glucosa Fructosa Maltosa Sacarosa

prueba

Neisseria - + + + +
sp
Tabla 1. ​Resultados prueba de utilización de azúcares al 1% en medio CTA

Haemophilus sp

Coloración de Gram: cocos Gram-negativos

Catalasa: positiva

Oxidasa: negativa

Agar chocolate: crecimiento

Agar sangre: sin crecimiento

microorganismo Factor X Factor V Factores X-V

Haemophilus sp + - +
Tabla 2.​ Resultados de las pruebas de requerimiento de factores X y V en agar

BHI

Discusión

Los resultado de la coloración de Gram (cocos Gram-negativos),

oxidasa(negativa) y catalasa (positiva) nos indican el género ​Haemophilus

pero para la identificación de la especie de ​Haemophilus​ se tiene en cuenta la

prueba de requerimiento de factores X (HEMINA) y V (NICOTINAMIDA

ADENINA-DINUCLEÓTIDO) en agar BHI reportados en la literatura (7) en

comparación con los resultados observados en la práctica de laboratorio se

Familia ​Pasteurellaceae ​y ​Neisseriaceae

identifica que la especie analizada es ​H. ducreyi​ ya que requiere el factor X

pero no el V.

Al igual que en el ensayo anterior los resultados de la coloración de Gram

(cocos Gram-negativos), oxidasa(positivo) y catalasa (positivo) nos llevan al

género ​Neisseria;​ en la identificación de la especia de​ Neisseria s​ e tiene en

cuenta los resultados de la prueba de utilización de azúcares al 1% en medio

CTA (Cistina Tripticasa-Agar), con glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa y

fructosa; en comparación con lo reportado en la literatura se identifica que la

especie es ​ Neisseria mucosa o Neisseria sicca​ ya que estos dos

microorganismos utilzan glucosa,maltosa,sacarosa, pero no lactosa (7)

Referencias

1. Bayley, Scott (2007), Diagnóstico Microbiológico, 12​a ​edición, Ed Medica

Panamericana.Pp 403-406,447-449,

2. Negroni (2009) Microbiología Estomatológica, fundamentos y guía práctica.

2​a​ edición.Ed Médica Panamericana.Pp 553

3. Murray P.R., Baron, Pfaller, Tenover and Yolken(1999). Manual of

clinical microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology,

Washington, D.C.

4. G, Prats (2007) Microbiología Clínica.1​a​ edición. Ed Médica

Panamericana.Pp 30

5. Rodríguez.E et all, (2002).2​a​ edición. Ed Universidad de Costa Rica.Pp 63-64

Koneman et al (2006), Diagnóstico MIcrobiológico,sexta edición, Ed Médica

Panamericana. pp 333-334

6. Mc Faddin (2003) Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias

de Importancia Clínica. Tercera edición, Ed Médica Panamericana.pp

73-74,​75.312-314, 422-423.

7. Forbes, Sahm, Weissfeld (2007) Microbiologia y Parasitologia

Humana.décimo segunda edición, Ed Médica Panamericana.pp 407.451