PRACTICA N4: NUMERACIN DE

STEPHYLOCOCUS AUREUS COAGULASA

POSITIVO

NUMERACION DE STAPHYLOCOCUS
AUREUS COAGULASA POSITIVO
I.

INTRODUCCIN
Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por
formas cocceas de 0,8-1,0 mm de dimetro, que se dividen en
ms de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en
racimos. Son inmviles y no forman esporas. Son gram positivas.
Es una especie muy sensible a la accin del calor y de los
desinfectantes.
Ms del 50 % de las personas son portadoras de S.aureus en fosas
nasales, garganta, fornculos, manos o pelo. Por eso su presencia
en determinados niveles en los alimentos es un signo evidente de
falta de higiene en la manipulacin.
Adems algunas cepas de S.aureus son patgenas para el hombre
porque producen enterotoxinas que dan lugar a la intoxicacin
estafiloccica. La dosis infectiva es alta ya que es necesario un
nmero de al menos 106 ufc/g para producir cantidad suficiente de
enterotoxina para producir la enfermedad en el consumidor.
El queso fresco artesanal es un derivado lcteo ampliamente
consumido en Per y se expende en una cantidad apreciable en
los mercados municipales, donde el pblico consumidor
generalmente no conoce la procedencia ni la forma de
elaboracin, la cual se realiza sin la debida calificacin tcnica.
Puede ocurrir que no se detecte S. aureus en un alimento, que el
nmero detectado sea pequeo y que, sin embargo, exista
cantidad detectable suficiente de enterotoxina estafiloccica. En
este caso, los microorganismos que originaron la toxina han ido
descendiendo en nmero e, incluso, desapareciendo, mientras que
la toxina, por su mayor resistencia, permanece en el alimento.

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El mtodo de recuento en placa se utiliza cuando se sospecha que el
alimento por analizar contiene ms de 100 S. aureus por gramo.

II.

FUNDAMENTO TEORICO
a) GENERALIDADES
Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se
presentan solos, en pares o racimos, no
son
mviles, ni esporulados; algunos biotipos
son
capaces de producir una toxina altamente
termoestable,
as
por
ejemplo,
Staphylococcus aureus produce 5 toxinas,
que
pueden provocar severas intoxicaciones
en el
hombre.
Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede
metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones aerbicas,
con la subsecuente liberacin de cido, principalmente cido actico con
pequeas cantidades de bixido de carbono; en condiciones anaerobias, el
producto principal de la fermentacin es el cido lctico.
Las tres condiciones necesarias para su ptimo desarrollo son: pH cercano a
la neutralidad, temperatura alrededor de 30C y ausencia de
microorganismos competitivos. Este ltimo punto es importante, ya que
Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros
microorganismos.

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STAPHYLOCOCCUS SE PUEDE ENCONTRAR EN:

a ) m e d io a m b ie n te c o m o
p u ed e ser:

b ) e n a lim e n to s :

c ) ta m b i n s e p u e d e
lo c a liz a r e n p e r s o n a s y
a n im a le s .

p o r e je m p lo lo s q u e
E s to s ltim o s ,
p re se n ta n u n a lto c o n te n id o
p ro te ic o , c o m o p u e d e s e r la
lo s a n im a le s y
le c h e y d e riv a d o s l c te o s ,
la s p e rs o n a s s o n
ta m b i n s e d e s a rro lla e n
a q u e llo s a lim e n to s q u e
lo s p rin c ip a le s
p re se n ta n a lta s
re s e rv o rio s d e
c o n c e n tra c io n e s d e s a l, u n o
d e e llo s se ra e l ja m n ; o tro
e s to s
fa c to r im p o rta n te e n lo s
a lim e n to s e s e l p H , a s
m ic ro o rg a n is m o s
te n e m o s e n e l c a s o d e la
.
m a y o n e s a , s ta tie n e u n p H
lo s u fi c ie n te m e n te b a jo p a ra
in h ib ir e l d e sa rro llo d e
S .a u re u s , s in e m b a rg o , a l
d ilu irs e y n e u tra liz a rs e e n
u n a e n s a la d a p o r e je m p lo , e l
p H a s c ie n d e lo s u fi c ie n te
Con respecto a las condiciones
los alimentos son susceptibles
c o m o p a ra p eambientales,
rm itir e l
d
e
s
a
rro
llo
d
e
e
s
te
a una contaminacin
postproceso con tipos enterotoxignicos de
m ic ro o rg a n is m o
e n tepor
ro tox igejemplo,
n ic o y
Staphylococcus aureus,
si son sometidos a un inadecuado
fi n a lm e n te ,

a ire , p o lv o ,
s u p e rfi c ie s e n
d o n d e se
m a n e ja n
a lim e n to s, a g u a ,
a g u a re s id u a l,

manejo o bien a temperaturas de conservacin inapropiadas; este problema

se acenta por la ausencia de flora competitiva, que normalmente restringe
el desarrollo de este microorganismo.

El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos, tiene gran

importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una
poderosa enterotoxina, que al ingerirse causa intoxicaciones severas al
hombre. Como se mencin o con anterioridad son 5 enterotoxinas: A, B, C, D
y E, siendo la A la ms nociva.

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La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente
toxina (1.0microgramo), para causar intoxicacin, es de 10 6UFC/g de
alimento, sin embargo Jablonski et al, comentan que el FDA, establece que
una cantidad de Staphylococcus aureus patgeno, en el que se encuentren
105UFC/g de alimento, provoca intoxicaciones y que un nivel basal de
aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocccica por gramo de
alimento, es suficiente para causar sntomas asociados con la intoxicacin
antes mencionada. Tambin es importante observar, que en la mayora de
los brotes de intoxicacin causados por este microorganismo, se han
detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina ingerida, aunque
en algunos casos las concentraciones de toxina han sido an ms bajas, del
orden de 0.01 microgramo, suficientes para provocar una intoxicacin en el
hombre.
Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias, no presentan
ninguna diferencia perceptible en cuanto a su apariencia, sabor y olor, por
lo que no se distinguen de los alimentos que no estn contaminados con
este microorganismo, por esta razn el peligro de ingerir alimentos
contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto. Los
alimentos sometidos a intensa manipulacin durante su preparacin y que
se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7.2 C y por debajo
de 60 C) despus de su preparacin, son los alimentos ms involucrados
en la intoxicacin estafilocccica.
Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas,
ensaladas, productos de pastelera, como pasteles rellenos con crema, pies
de crema, coberturas de chocolate, leche y sus derivados, rellenos para
sndwiches y papas, son los ms comnmente asociados con intoxicaciones
estafilocccicas.
En los humanos, las cepas de Staphylococcus habitan en forma especfica
en el tracto nasofarngeo, cabello y piel del 50% o ms de los individuos, sin
causar dao aparente (portadores asintomticos), pudiendo transferirse de
los dedos y manos a los alimentos y desarrollarse con rapidez en ellos.

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La especie aureus, es la considerada patgena
del gnero Staphylococcus y est comnmente
a casos de artritis, osteomielitis, meningitis,
neumona y en algunos casos puede llegar a
ocasionar prdida del conocimiento. Las cepas
microorganismo
que
producen
enzimas
extracelulares
y
toxinas,
son
las
ms
importantes por ser causante de intoxicaciones
alimentarias.

dentro
asociado

de

este

El trmino Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir

aquellas cepas que secretan una enzima que provoca coagulacin del
fibringeno sanguneo, utilizando el microorganismo esta capacidad contra
la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del husped. Esta reaccin se
utiliza in vitro para la identificacin de cepas de Staphylococcus productoras
de toxinas, mediante el uso de plasma. Algunas razones para determinar
Staphylococcus aureus son:

Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal

de intoxicaciones.
Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente
potencial de este microorganismo enterotoxignico.
Demostrar la contaminacin postproceso, la cual es usualmente
debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente
sanitizadas.

b) Morfologa
El S. aureus es un coco inmvil, de 0.8 a 1 micrmetro de dimetro, que
se divide en tres planos para formar grupos de clulas irregulares
semejantes a racimos de uvas. En extendidos de pus los cocos aparecen
solos, en pares, en racimos o en cadenas cortas. Los racimos irregulares
son caractersticos de extendidos tomados de cultivos que se desarrollan
en medios slidos, mientras que en otros cultivos son frecuentes las
formas de diplococos y en cadenas cortas. Unas pocas cepas producen

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una capsula o capa de baba que incrementa la virulencia del
microorganismo.
El S. aureus es un microorganismo Grampositivo pero las clulas viejas y
los microorganismos fagocitados se tien como gramnegativos.

c) FUNDAMENTO DEL LA PRUEBA

La presente tcnica para la deteccin de Staphylococcus aureus, consiste en
los siguientes pasos:
1. Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo slido, el cual inhibe
el desarrollo de gneros diferentes al Staphylococcus, pero adems
permite reconocer el desarrollo caracterstico del microorganismo
buscado.
2. Recuperacin de la cepa, este paso permite restaurar las clulas
daadas de Staphylococcus aureus.
3. Identificacin bioqumica, en este punto se identifica el gnero y
especie de Staphylococcus aureus enterotoxignico.
Estas pruebas bioqumicas (de acuerdo
la Norma Oficial) son: presencia de la
enzima coagulasa y presencia de la
enzima
termonucleasa.
La
caracterizacin
bioqumica
de
Staphylococcus aureus toxignico en
estas pruebas es la siguiente:
Presencia de coagulasa

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positiva
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Presencia de termonucleasa

positiva

La determinacin del Staphylococcus aureus mediante extensin del inculo

en superficie, es adecuado para el anlisis de alimentos en los que se
espere encontrar ms de 100 clulas de Staphylococcus aureus/g 10
clulas de Staphylococcus aureus/
mL de alimento.
El aspecto cuantitativo en la
investigacin de Staphylococcus
aureus es de suma importancia, no
slo desde el punto de vista
econmico, sino en el de salud
pblica; la Norma establece un
lmite mximo de 106UFC/g de
alimento para que ste pueda ser
consumido.
Desde este punto de vista y de acuerdo con la tcnica mencionada, la
sensibilidad mnima de deteccin en el recuento en placa, utilizando el
mtodo de extensin de superficie es de: 100UFC/g de alimento para
muestras slidas 10UFC/mL para alimentos lquidos.

EL QUESO PARIA
Es un queso semiduro que se produce en el altiplano peruano. Es de leche bovina
y su produccin est muy extendida sobretodo en el norte de la Regin Puno, de
donde a su vez es originaria. Posee una corteza corrugada debido a que se utiliza
mol-des hechos de paja, es de color marfil amarillento. Tiene un sabor
caracterstico y posee una textura firme.

QUESO FRESCO

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El queso fresco o queso blanco es un tipo de
queso blando, es decir retiene gran parte del
suero y no tiene proceso de maduracin o
refinado.
La fabricacin de este queso es muy
sencilla. El cuajado es esencialmente lctico
y
dura normalmente 24 horas, aunque a veces
ms. El desuerado, cuando es estimulado
por
ruptura de la cuajada seguida de presin, no es nunca excesivo y adems
los quesos frescos son siempre hmedos (60-80% de agua), lo que causa
que sean muy poco conservables y que su transporte en largas distancias
sea muy difcil.
Podemos distinguir los quesos frescos segn su modo de desuerado:
desuerado en moldes (quesos de pie, de rgimen), en sacos o en telas
(procedimiento Berge); la pasta que se obtiene se vende a granel (cuajada
magra o grasa) y tambin moldeada y con forma (Neuschtel, Gournay,
Suisse, etc.).

NORMA SANITARIA SOBRE CRITERIOS MICROBIOLOGICOS DE CALIDAD

SANITARIA E INOCUIDAD PARA LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO

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HUMANO

III. OBJETIVO
Realizar el recuento en placa de los microorganismos staphylococus
aureus presentes en cada muestra de alimento
.
Determinar si las muestras son aptas para consumo de acuerdo con el
nmero de unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro de
muestra, referidos en la bibliografa.
Comparar que muestra tiene mayor cantidad de microorganismos
staphylococus aureus y a que se debe eso.

IV. MATERIALES Y EQUIPOS

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Los requisitos necesarios para la preparacin y dilucin de la muestra
de alimentos.
Muestras de queso fresco y queso pariaa.
Placas Petri de vidrio (100x15mm) o de plstico de 90x15mm.
Pipetas de 1ml. Graduadas al 0.1.
Extensores de vidrio.
Bao de agua regulado a 44-46C.
Incubadora regulada a 35-37C.
Agar Baird-PARKER.
Caldo de cerebro corazn.
Tubos de ensayo de 75x10ml, contenido 0.3ml de plasma de conejo.
Gradillas

V.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Preparar diluciones de las muestras de alimento al 10 -1, 10-2, 10-3, 10-4 y
10-5.

2. Pipetear 0.1ml del homogeneizado y las diluciones por duplicado en la

superficie de las placas de agar Baird Parker previamente secadas y,
distribuir cada inoculo con un extensor de vidrio hasta que la superficie
del medio aparezca seca.

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3. Incubar las placas en posicin invertida a 37C durante 30 y 48 horas.

4. Despus de 30 horas de incubacin seleccionar las placas que presentan

entre 20 y 200 colonias y contar todas aquellas colonias negras y
brillantes con borde blanco angosto rodeadas de zonas claras que
contrastan con el medio opaco. Estas colonias corresponden a
sthaphylococus aureus.<

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5. Marcar la posicin de estas colonias a incubar las placas durante 18
horas adicionales.

6. Al final del periodo de incubacin (48horas) contar todas las colonias con
las caractersticas descritas anteriormente y adems aquellas colonias
negras brillantes con o sin borde blanco y sin zonas claras. Someter un
nmero significativo de colonias sospechosas (no menor a 5) a la prueba
de la coagulasa. Algunas cepas de S. aureus pueden aparecer rodeadas
de una zona opaca despus de 30 horas de incubacin de 35-37C, para
un gran nmero de cepas a veces no muestra esta apariencia despus
de 48 horas. Por esta razn se recomienda contar tales colonias despus
de 48 horas y someter a un nmero equivalente de ellas a la prueba de
la cuagulasa. Esta prueba servir para distinguir aquellos cultivos de S.
aureus (cuagulasa positivo) de S. epidermidis (coagulasa negativo) que
pueden dar una apariencia similar.

7. PRUEBA DE LA COAGULASA

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a) Sembrar las colonias seleccionadas en Caldo de cerebro corazn e
incubar a 35-37C. durante 20 a 24 horas.
b) Adicionar 0.1ml del cultivo a tubos de 75x10mm que contenga
0.3ml de plasma de conejo incubar a 35-37C.
c) Examinar despus de 4 horas de incubacin si el plasma ha perdido
su fluidez o se encuentra un cogulo ms o menos grande. Si la
reaccin es negativa, incubar los tubos a temperatura de
laboratorio y re-examinar despus de 24 horas. Las diferentes
reacciones de coagulasa se observan en la tabla de puntuacin.
8. Calcular del total de colonias caractersticas, la proporcin de la colonias
positivas a las prueba de la coagulasa teniendo en cuenta la dilucin
empleada y expresar el nmero de Staphylococcus coagulasa positivo
por gramo o mililitro de muestra

VI. RESULTADOS

Luego de extraer las placas de la incubadora al transcurrir las 48 horas,

se observ lo siguiente:

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Se enumer la cantidad de colonias de staphylococus aureus presentes

en cada placa de cada muestra obteniendo la siguiente tabla de
resultados.
10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

Resultado

n
Numero de
colonias en:
Queso fresco

200

200

100

Queso paria

200

200

64

6.5x104ufc/
g
6.2x104ufc/
g

Diluci

Coagulasa positiva
La reaccin es positiva
cuando el cogulo
formado es firme.
Coagulasa negativa
La reaccin es negativa
cuando no se cuagula el
plasma.

OBSERVACIONES: Los datos y resultados obtenidos en la presente practica fueron sacadas de pginas
web y tomadas como referencia las indicaciones de la profesora en clase; debido a que no se pudo
realizar la practica por problemas de construccin.

VII. DISCUSIN DE RESULTADOS

Como se puede ver en el cuadro de resultados el queso fresco posee
mayor cantidad de colonias S. aureus aunque sea por una ligera
diferencia de cientos de clulas.
De acuerdo a los resultados se puede decir que las razones por las
que el queso fresco tiene mayor cantidad de S. auresus que el queso
paria, son la falta de higiene al momento de elaborar el queso fresco,
ya que el S. aureus se encuentra en los seres humanos y por
descuidos estos se transportaron al queso; otra razn puede la

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manera en cmo se guarda el queso en los mercados donde se
venden, ya que estos quesos frescos son expuestos al medio sin
ninguna proteccin y por ser un lugar donde circula mucha gente
tambin pudo contraer clulas de S. aureus. Y al decir todo esto se
debe creer que el queso paria estaba en mejores condiciones de
higiene al prepararse y venderse.
Comparando los resultados con los valores permisibles de ufc/g de S.
aureus, de acuerdo a la bibliografa, se tiene que la cantidad de S.
aureus en las muestras de queso es mayor a la cantidad permitida
para ambas muestras, pero aun as se permite su consumo en las
personas puesto que es menor a 10 6ufc/g que es la cantidad
necesaria para que el consumidor se enferme, aun as no se
recomienda su consumo.

VIII.

CONCLUSIONES
En resumen, la presencia de un nmero elevado de Staphylococcus
aureus en un alimento refleja higiene defectuosa por mala
manipulacin. Si, adems, el S. aureus aislado son cepas
enterotoxignicas, suponen un riesgo para la salud.
Se obtuvo para el queso fresco 6.5x10 4ufc de S. aureus/g. de alimento
y para el queso paria 6.2x104ufc/g. de alimento.
Comparando ambas muestras, el queso fresco tiene mayor cantidad
S. aureus presente en su composicin, lo cual debera ser al contrario,
esto se debe a la falta de higiene en su elaboracin y al exponer el
queso finalizado al medio ambiente antihiginico por mucho tiempo.
Esto tambin se aplica para el queso paria.
La determinacin de microorganismos s. aureus es importante para
determinar la calidad que tienen los alimentos, que son destinados
para consumo o elaboracin de productos de consumo y verificar que
no tengan otro tipo de bacterias o agentes patgenos. Para ello se
utiliza la propiedad del S. aureus de coagular el plasma (cuagulasa +)

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y la formacin de colonias negras con halo transparente en medio de
cultivo Agar Baird Parker.

IX. CUESTIONARIO

1. Cmo se aplica este indicador microbiolgico en la produccin de la

leche y productos lcteos?
La determinacin del Staphylococcus aureus mediante extensin del inculo
en superficie, es adecuado para el anlisis de alimentos en los que se espere
encontrar ms de 100 clulas de Staphylococcus aureus/g 10 clulas de
Staphylococcus aureus/ mL de alimento.
El aspecto cuantitativo en la investigacin de Staphylococcus aureus es de
suma importancia, no slo desde el punto de vista econmico, sino en el de
salud pblica; la Norma establece un lmite mximo de 10 6UFC/g de alimento
para que ste pueda ser consumido.
Desde este punto de vista y de acuerdo con la tcnica mencionada, la
sensibilidad mnima de deteccin en el recuento en placa, utilizando el mtodo
de extensin de superficie es de: 100UFC/g de alimento para muestras slidas
10UFC/mL para alimentos lquidos.

2. Cmo se aplica este indicador para evaluar la calidad del aire de los
talleres de produccin de alimentos?
Los alimentos entran en contacto con los mas diversos materiales a lo largo de toda
su cadena de produccin (elaboracin, envasado, conservacin, distribucin y
consumo), lo que incluye todo tipo de utensilios alimentarios (vajilla, cristalera) ,
aparatos, envases y embalajes, as como las envolturas, revestimientos y coberturas
(tales como las que cubren los quesos, los productos de charcutera, o las frutas). Por
tanto, cualquier material u objeto destinado a entrar en contacto directa o
indirectamente con alimentos , ha de ser lo suficientemente inerte para evitar que se

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transfieran sustancias a los alimentos en cantidades lo suficientemente grandes
para poner en peligro la salud humana o para ocasionar una modificacin inaceptable
de la composicin de los productos alimenticios o una alteracin de las caractersticas
organolpticas de stos

3. Cmo se aplica este indicador para evaluar la calidad de

comidas preparadas y productos de pastelera?
El mtodo de recuento en placa se utiliza cuando se sospecha que el
alimento por analizar contiene ms de 100 S. aureus por gramo.
Puede ocurrir que no se detecte S. aureus en un alimento, que el nmero
detectado sea pequeo y que, sin embargo, exista cantidad detectable
suficiente de enterotoxina estafiloccica. En este caso, los microorganismos
que originaron la toxina han ido descendiendo en nmero e, incluso,
desapareciendo, mientras que la toxina, por su mayor resistencia,
permanece en el alimento.
4. Indique como se realiza la prueba de la coagulasa
La presente tcnica para la deteccin de Staphylococcus aureus, consiste en
los siguientes pasos:
1. Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo slido, el cual
inhibe el desarrollo de gneros diferentes al Staphylococcus, pero
adems permite reconocer el desarrollo caracterstico del
microorganismo buscado.
2. Recuperacin de la cepa, este paso permite restaurar las clulas
daadas de Staphylococcus aureus.
3. Identificacin bioqumica, en este punto se identifica el gnero y
especie de Staphylococcus aureus enterotoxignico.
Estas pruebas bioqumicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de
la enzima coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. La

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caracterizacin bioqumica de Staphylococcus aureus toxignico en estas
pruebas es la siguiente:
Presencia de coagulasa
Presencia de termonucleasa

X.

positiva
positiva

BIBLIOGRAFIA

Bourgeois

S.A.1995.
Frazier ,W.C. Microbiologa de los alimentos .Ed. Acribia . Espaa 2000.
Mossel.D.Microbiologa de los alimentos. Ed. Acribia. Espaa 2000.
DIFCO Manual de medios de cultivo. Ed. Difco.
MERCK. Manual de medios de cultivo Ed. Merck, Alemania.
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Alimentos.
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C.M.

Microbiologa

Alimentaria.

Editorial

Continental

agricultura y la Alimentacin. Roma.

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http://www.promamazonia.org.pe/SBiocomercio/Upload/Lineas/Docum
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XI. ANEXOS

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