I.

INTRODUCCIÓN

Vibrio es un género de bacterias Gram +, presenta 3 especies patogénicas, Vibrio

parahaemolyticus, Vibrio cholerae y Vibro vulnificus.

Vibrio parahaemolyticus es una bacteria de la familia Vibrionaceae y su hábitat es el mar, a la

cual también pertenecen el Vibrio cholerae y Vibrio vulnificus. El V. parahaemolyticus es una de
las especies más frecuentes causantes de infección intestinal a través del consumo de alimentos.
Se encuentra principalmente en ambientes marinos como: plancton, pescados y mariscos
(almejas, ostiones, camarón, calamar y cangrejo), por lo que los alimentos que provienen de
esta hábitat son considerados los principales vehículos de transmisión del agente etiológico al
ser humano, provocando cuadros de gastroenteritis e inclusive septicemia. Su dosis infectiva es
de 105 a 107 UFC, el periodo de incubación es de 12-24 horas.

Vibrio cholerae se diferencia de otros Vibrios por su antígeno somático 0 (lipopolisacárido

termoestable). La forma clínica más común producida por este microorganismo es la
gastroenteritis, cuyo espectro clínico es muy parecido al del cólera: diarrea líquida,
deshidratación, dolores abdominales y disentería. A esta especie le son atribuibles infecciones
extraintestinales como son: infecciones de heridas, infecciones biliares y renales, otitis, así como
septicemia primaria y secundaria. El rango de temperaturas para el crecimiento de este
microorganismo es de 16 y 42ºC con un óptimo de 37ºC, mientras que su rango de pH es de 6.8
a 10.2 y pH óptimo de 7.0 a 8.0.

Es por ello que nuestro objetivo es determinar la presencia o ausencia de Vibrio sp. en una
muestra de alimento a través del agar TCBS.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales

- Muestra de Alimento.
- Homogenizador de una o dos velocidades, con control por reóstato, podría utilizarse
también una licuadora.
- Vasos o recipientes de vidrio o de metal, adecuados para el homogenizador, de 1 litro
de capacidad, resistentes a las temperaturas de esterilización en autoclave.
- Balanza de una capacidad no inferior a 2 500 g y de una sensibilidad de 0,1 g.
- Instrumentos para preparar las muestras: pinzas, tijeras, mangos de bisturí, espátulas;
todo ello previamente esterilizado en autoclave o por aire caliente.
- Incubadora a 35-37° C

a) Método: Detección de Vibrio parahaemolyticus.-

- Pipetas estériles de 5 y 1 mL.

- Caldo APA (Agua peptonada alcalina)
- Placas petri estériles con Agar TCBS (tiosulfato citrato bilis sacarosa)
- Asa de siembra con alambre de nicrom

Procedimiento

1. Se pesó 25 g de la muestra y luego se diluyó con 225 mL de APA (agua peptonada

alcalina), licuar por 1-2 min.
2. Las diluciones se realizarón hasta 10-3.
3. El homogenizado se incubó por 8 horas y las diluciones de APW a 37° C por 24 horas.
4. Se estrió y sembró las diluciones a placas conteniendo Agar TCBS. Después se incubó las
placas a 37° C durante 24 horas.
5. Se seleccionó las colonias de color azul (que indica características de no descomponer
la sacarosa). El V. Cholerae y los vibrios que si descomponen la sacarosa forman colonias
de color amarillo.
6. Después se calculó el número de Vibrio parahaemolyticus por gramo o mililitro de
alimento.

b) Prueba Confirmatoria: Vibrio parahaemolyticus (Test de Halofilidad).-

1. Se seleccionó colonias para sembrarlas en tubos con Agar TSI- NaCl 3%, Caldo Peptonado
con NaCl al 3% y Caldo Peptonado Simple.
2. Para el Agar TSI-NaCl 3%; si es V. parahaemolyticus, la parte inclinada es de color rojo y la
del agar vertical es amarillo. No hay generación de gas (-) ni producción de H2S (-) (no hay
cambio de coloración a negro).
3. Para el Caldo peptonado con 3% NaCl; si es V. parahaemolyticus, se vuelve turbio debido
al desarrollo de bacterias.
4. Para el Caldo peptonado simple no hay turbidez.
 III. RESULTADOS
La muestra usada fue conchas de mar, se extrajeron 25g de muestra y se mezclaron Agua
peptonada alcanina (APA), obteniendo así la dilución 10-1, se realizaron 3 diluciones sucesivas,
10-2, 10-3 y 10-4 usando APA del mismo modo. Y se llevó a la incubadora por 24hrs a 35-37°C.

Luego del periodo de incubación, cada dilución se sembró en Agar Tiosulfato Citrato Bilis
Sacarosa (TCBS) por separado y se incubo por 24hr a 37°C. Luego del periodo de incubación
transcurrido se obtuvo lo siguiente:

10-1 10-2

10-3 10-4

Las colonias amarillas eran las presuntivas para ser Vibrio cholerae, mientras que las verdes
Vibrio parahaemolyticus. Posterior a esta identificación se realizaron 2 procedimientos para
identificar cada especie de Vibrio (V. cholerae y V. parahaemolyticus) las cuales fueron: prueba
bioquímica en batería completa (TSI, LIA, C. Simmons, SIM, RM, VP y Urea) y prueba de
halofilidad (caldo triptona con concentraciones de 3,6 y 10% NaCl).

1. El inóculo verde tomado de la placa 10-3, la cual era una presuntiva colonia de Vibrio
parahaemolyticus dio los siguientes resultados luego del sembrado y periodo de incubación
(24-48 Hrs a 37°C) en ambas pruebas de identificación de especie.
 TSI LIA C. S. SIM RM VP Urea
3% 6% 10%

K/A A/A (-) S (+) (-) (-) (+)

SH2 + I (-)
M (?)

(+) (-) (+)

Se descarta que el microorganismo que formo la colonia verde sea Vibrio parahaemolyticus
porque ninguna especie de Vibrio da positivo a SH2 en la batería bioquímica, en adición a
esto la prueba de halofilidad fue descartada dado que a 6% no hay crecimiento, pero a 10%
si lo hay. Sin embargo, basta con la prueba bioquímica para descartar presencia de Vibrio
parahaemolyticus.

2. El inóculo amarillo tomado de la placa 10-4, la cual era una presuntiva colonia de Vibrio
cholerae dio los siguientes resultados luego del sembrado y periodo de incubación (24-48
Hrs a 37°C) en ambas pruebas de identificación de especie.

TSI LIA C. S. SIM RM VP Urea

3% 6% 10%

A/A K/K (-) S (-) (-) (-) (-)

SH2 - I (-)
M (?)
(+) (+) (+)
Se descarta que el microorganismo que formo la colonia amarilla sea Vibrio cholerae porque las
pruebas de Citrato de Simmons, SIM y RM salieron negativos en la batería bioquímica, en adición
a esto la prueba de halofilidad dio positiva a las 3 concentraciones de sal (3,6 y 10%) Lo cual no
es característica de V. cholerae, esta solo crece a una concentración del 3%.

En adición a todas las pruebas anteriores, se realizó la prueba de la oxidasa la cual nos indica si
el microorganismo es o no del genero Vibrio. Esto es de suma importancia porque las pruebas
bioquímicas y de halofilidad hechas previamente salieron negativas tanto para Vibrio cholerae y
Vibrio parahaemolyticus.

Se extrajo un inóculo de la placa con Agar TCBS de la colonia amarilla (10-4) y se sembró en Agar
BHI. Luego del periodo de incubación (24-48Hrs a 37°C) se obtuvo lo siguiente.

* No se usaron las colonias verdes dado que estas produjeron SH2 en la prueba bioquímica y
sería una pérdida de material y reactivo hacer esta prueba porque ya deducimos que no es del
género Vibrio.

Colonia amarilla 10-4

AGAR BHI

Se empapó tiras de papel filtro con el reactivo oxidasa (dehidrocloruro de tetrametil-

parafenilendiamina 1%) y se colocaron dentro de la placa. Al paso de unos minutos se observó
la reacción positiva del genero Vibrio (reacción de color morada). Por lo tanto las colonias
amarillas SÍ correspondían al género Vibrio, pero no era de las especies choleare.

Reactivo Oxidasa (+)

Oxidasa
Por motivos de un exceso de NaCl en las pruebas de la batería bioquímica no se puede
determinar con exactitud que especie de Vibrio es. Por ende el resultado final queda como
VIBRIO SP.

Basándonos en los criterios microbiológicos publicados por el MINSA podemos catalogar al

alimento usando la siguiente tabla:

Las conchas de mar, compradas en el terminal pesquero de Villa Maria del triunfo presentaron
ausencia/25g tanto para Vibrio cholerae como para Vibrio parahaemolyticus, lo que quiere decir
que el producto es aceptable y es adecuado para el consumo, porque la presencia de Vibrio
expuesta por la prueba de la oxidasa representa alguna especie no patógena del género.

IV. DISCUSION

1. Fundamentos

Agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS)

Es un medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio en especial Vibrio cholerae,

Vibrio parahaemolyticus a partir de heces, agua y alimentos contaminados.

Este medio va a contener peptona de carne y tripteína para el aporte de nutrientes del
desarrollo de los microrganismo; al ser un medio selectivo quiere decir que va a poner en
manifiesto exclusivamente a la especie Vibrio basándose en la inhibición de otras especies
producto de la alta concentración de tiosulfato, citrato, bilis y el pH fuertemente alcalina.

La degradación de la sacarosa nos va a permitir diferenciar el género de Vibrio en el

medio, ya que las que no fermenten sacarosa se manifestaran de color verde, y las que si
fermenten producirán un ácido manifestándose de color amarillo. El viraje del color es
debido a los indicadores pH: azul de timol y azul de bromotimol. El NaCl siempre va a
favorecer el crecimiento de los Vibrio, y la proporción de la sacarosa siempre debe ser
equilibrada para no inhibir el crecimiento bacteriano por un exceso de ácido.

Tener en cuenta que el tiosulfato de sodio aporta azufre al medio y junto con el citrato
férrico permitirán la detección de producción de ácido sulfhídrico dando un color negro;
en caso suceda esto se descartara la presencia de Vibrio ya que esta no produce ácido
sulfhídrico.
Batería bioquímica y Test de halofilidad

El caldo triptona del test de halofilidad es un medio líquido recomendado para

enriquecimiento y para verificar la producción de indol por los microorganismos, por su
base nutritiva, permite el desarrollo de diversas especies bacterianas, y debido a su alto
contenido de triptofano, es un buen sustrato para la producción de indol.

- Vibrio parahaemolyticus pertenece al tipo gram negativo, es móvil y no presenta

cápsula ni espora. Descarboxila la lisina, más no la arginina. Tolera hasta un 8%
de sal común por lo que se desarrolla en el agua del mar y puede crecer a pH 9 en
medios ligeramente básicos, no puede fermentar la sacarosa ni la lactosa.
- Vibrio cholerae es una bacteria Gram negativas. Bioquímicamente se caracterizan por
dar positivo en las pruebas de la catalasa y de la oxidasa, también dan negativo en la
adenina dihidrolasa y positivo en la ornitina descarboxilasa. Vibrio cholerae
concretamente es sacarosa y manitol positivo y nitrato reductasa positivo. Es una
bacteria anaerobia facultativa, y su metabolismo es fermentativo; pueden fermentar,
entre otros sustratos, la glucosa. Poseen flagelación polar, que les otorga una
movilidad máxima. Puede crecer al 0% y al 3% de sal, rara vez al 6% de sal y no crecen
en concentraciones del 8% ni 10% de cloruro de sodio.

Prueba de la oxidasa

Esta prueba sirve para detectar la presencia de citocromo c en la cadena respiratoria del
microorganismo. El resultado da positivo ya que el reactivo dihidrocluro de tetrametil-
parafenilendiamina es un aceptor de electrones artificial la cual actúa por la presencia
de citocromo oxidasa (propia de gel género Vibrio) y el oxígeno del medio, dando un
color morado (azul de indofenol) por su degradación; de lo contrario se mantendría
incoloro.

2. Las conchas marinas fueron positivo a Vibrio ya que su hábitat es el medio marino a
presencia de sal no tan elevadas. Al no haber un adecuado tratamiento sanitario esta
aun permaneció en el producto, otra de las causa por la cual puede deberse esta
contaminación es por la poca o escasa higiene por parte del manipulador mediante el
mecanismo ano-mano-alimento al ser un portador; por el uso de aguas servidas
previamente contaminadas o contaminación cruzada con otros alimentos. En adición un
alimento puede encontrarse contaminado debido a problemas de almacenamiento, por
falta de congelación de los productos marinos, ya que estos microorganismos crecen a
entre temperaturas de 5 y 43 °C.

V. CONCLUSIONES

 En el agar TCBS se encontraron colonias verdes (presuntivas para Vibrio

parahaemolyticus) como colonias amarillas (presuntivas para Vibrio cholerae), las cuales
se diferencian por la capacidad de fermentar sacarosa, siendo las colonias verdes
aquellas que carecen de esta capacidad y las amarillas aquellas que la poseen además
de generar ácido. De ambas colonias se realizó la bioquímica.
 Se concluyó que ambas colonias eran negativas para las especies que se quería
identificar. En primer lugar la colonia presuntiva para Vibrio parahaemolyticus se
descartó con facilidad debido a la producción de SH2, ya que ninguna especie del género
Vibrio tiene esta capacidad. En segundo lugar, las colonias presuntivas para Vibrio
cholerae no tuvieron un resultado exacto en la batería por problemas de preparación
de agar, sin embargo se descartó su presencia por el test de halofilidad el cual dio
positivo hasta 10% de NaCl.

 La prueba oxidasa realizada con la colonia amarilla sembrada en agar BHI, dio un
resultado positivo que se aprecia por la formación del azul de indofenol, esto quiere
decir que el microorganismo pertenece al género Vibrio, sin embargo no se pudo
identificar la especie, por lo que la cepa queda como Vibrio sp. No patógena.

 La muestra de conchas de mar compradas en el terminal pesquero de villa Maria del

triunfo son aptas para el consumo porque no se encontró presencia de Vibrio cholerae
y Vibrio parahaemolyticus (patógenos) establecidas en las normas publicadas por el
MINSA.

VI. BIBLIOGRAFIA

1. Brock T. Biología de los microorganismos. 10ma ed. Reino Unido: Pearson Pretince hall;
2004.
2. Tortora G. Introducción a la microbiología. 9ª ed. México: Editorial médica
panamericana; 2007.
3. Microbiología Blog [en línea] [fecha de acceso; 29 de Junio del 2017], disponible en:
http://microbitosblog.com/2010/06/14/vibrio-parahaemolyticus/
4. Microbiología Blog [en línea] [fecha de acceso; 29 de Junio del 2017], disponible en:
http://microbitosblog.com/2010/06/14/vibrio-cholerae/
5. Facult. farmacia [en línea] [fecha de acceso; 29 de Junio del 2017], disponible
en:http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/tiosulf
ato-citrato-bilis-sacarosa
6. Facult. farmacia [en línea] [fecha de acceso; 16 de Junio del 2017], disponible en:
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/oxidase-
test
7. Senasa, ministerio de salud [en línea] [fecha de acceso; 03 de Junio del 2017],
https://www.senasa.gob.pe/senasa/wp-content/uploads/2015/07/CRITERIOS-
MICROBIOLOGICOS-RM-591-2008-MINSA.pdf