Evaporación, Destilación y Cristalización - Escuela de Ingeniería Química

CRISTALIZACIÓN DE LA ALBUMINA DEL HUEVO

Evaporación, Destilación y Cristalización

Fernanda Calderón, Marcos Carpio, David Méndez, Jeniffer Va

2015 Sexto Nivel 1
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Contenido
Índice de figuras................................................................................................................iii
Índice de gráficos..............................................................................................................iv
Índice de tablas..................................................................................................................v
Cristalización de la Albumina del Huevo...........................................................................1
Objetivo.............................................................................................................................1
Marco Teórico...................................................................................................................1
Purificación de sustancias orgánicas: Recristalización..................................................1
Consideraciones teóricas...........................................................................................1
Cristalización de proteínas............................................................................................1
¿Qué Materiales se Pueden Usar Como Precipitante?.................................................3
Propiedades de los Cristales Proteicos..........................................................................4
Materiales y equipos.........................................................................................................5
Procedimiento...................................................................................................................5
Elaboración de las soluciones........................................................................................5
Procedimiento para el Ácido Acético 1 N..................................................................5
Procedimiento para el Sulfato de Amonio al 50%.....................................................5
Procedimiento de la Cristalización de Albumina...........................................................6
Datos teóricos y/o experimentales...................................................................................7
Datos el ácido acético glacial de partida.......................................................................7
Cálculos..............................................................................................................................8
Cálculos para la preparación la solución del ácido acético...........................................8
Resultados.........................................................................................................................8
Conclusiones......................................................................................................................9
Bibliografía.......................................................................................................................10

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Índice de figuras
Figura 1 Diagrama esquemático de fases de una mezcla de proteína y precipitante......2
Figura 2 Dependencia de la solubilidad S en función de la carga iónica I.........................4
Figura 3 Solución de ácido acético 1 N aforado y detrás la sal de sulfato de amonio en
los vasos.............................................................................................................................6
Figura 4 Agitando las claras con 0.2 ml de ácido acético.................................................6
Figura 5 Soluciones de Clara de huevo, Acido Acético y Sulfato de Amonio listo para
colocar en la centrifugadora.............................................................................................7
Figura 6 Soluciones listas para refrigerar..........................................................................7
Figura 7 Formación de cristales al segundo día de refrigeración......................................8

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Índice de gráficos

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Índice de tablas
Tabla 1 Materiales Empleados en el proceso de Cristalización de la albumina................5
Tabla 2 Equipos Empleados en el proceso de Cristalización de la albumina....................5
Tabla 3 Reactivos Empleados en el proceso de Cristalización de la albumina.................5

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Cristalización de la Albumina del Huevo

Objetivo
Obtener cristales de la albumina de la clara del huevo.

Marco Teórico
Purificación de sustancias orgánicas: Recristalización

Consideraciones teóricas
Un problema que se presenta de manera habitual en química orgánica y de los
productos naturales, es la separación de una sustancia de interés del resto de
sustancias que la acompañan y que es necesario eliminar, puesto que constituyen
impurezas. Esta problemática no es fácil de solucionar, generalmente aislar la
sustancia de interés o eliminar las impuras requiere repetidos pasos de purificación,
acompañados de estudios para verificar fehacientemente que se ha logrado obtener el
compuesto buscado en forma pura.

La recristalización es el método utilizado para obtener un compuesto puro a partir de

una mezcla de componentes sólidos. Se basa en la solubilidad diferencial de los
componentes de la mezcla en un disolvente o mezcla de ellos, lo que permite lograr la
separación de uno de ellos del resto.

Si el sólido se forma de un modo rápido, desordenado, en muchos puntos

simultáneamente (núcleos de cristalización) y las partículas son, en consecuencia, de
tamaño muy pequeño, se habla de un proceso de precipitación.

Si, por el contrario, el sólido se forma de un modo lento, ordenado, en pocos núcleos,
con la aparición de partículas poliédricas de tamaño apreciable (a veces a simple vista)
de morfología característica (cristales), se habla de un proceso de cristalización.

La diferencia entre uno y otro proceso se encuentra entonces en la velocidad con la

que se llevan a cabo y en el grado de control se ejerzas obre las variables que en él
intervenga (presión, temperatura) más que en el grado de cristalinidad de las muestras
obtenidas. [ CITATION Lam081 \l 1034 ]

Cristalización de proteínas

Hoy en día hay dos métodos fundamentales para determinar la estructura

tridimensional de una proteína. Por un lado está la resonancia magnética nuclear
(NMR) y, por el otro, la cristalografía de rayos X. Con el método NMR solo se pueden
estudiar moléculas con un peso molecular aproximado de hasta 25.000 Da (25 kDa, o

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aproximadamente 220 aminoácidos); la cristalografía de rayos X es más apropiada para

determinar la estructura de proteínas más grandes o complejos macromoleculares. Las
primeras estructuras analizadas con este método fueron la mioglobina (1950) y la
hemoglobina (1955), estudios que fueron premiados en 1962 con el premio Nobel de
química.

Figura 1 Diagrama esquemático de fases de una mezcla de proteína y precipitante

El primer paso para determinar una estructura por medio de la cristalografía–y, al

mismo tiempo, el más complicado- radica en la obtención de cristales de suficiente
tamaño. Un cristal es una estructura tridimensional formada por bloques básicos (en
este caso, moléculas proteicas) dispuestos de manera regular. ¿Cómo podemos lograr
cristales partiendo de una molécula tan compleja como es la proteína?

Para pasar del estado líquido al cristalino, hay que reducir primero la solubilidad de la
molécula. Por regla general, esto entraña la formación de una precipitación amorfa.
Sin embargo, si las condiciones se han elegido de tal manera que en la superficie de la
molécula se hallan áreas complementarias entre sí, se pueden dar variaciones
especificas entre las moléculas proteicas. Si la geometría de estas variaciones es
favorable, se formarán cristales.

En la cristalización se distinguen principalmente dos pasos: (1) la nucleación y (2) el

crecimiento del cristal. Ambos pasos tienen lugar, si las condiciones son favorables, en
la zona sobresaturada del diagrama de fases.

Desafortunadamente, para la nucleación se requiere más sobresaturación que para el

crecimiento. El área de formación nuclear donde se da la sobresaturación también se
denomina zona inestable o lábil, mientras que el área de crecimiento se conoce como
zona metaestable. Para la nucleación es necesario que la solución llegue a la zona lábil.
Sin embargo, una vez allí ́ los núcleos crecerán demasiado rápido y los cristales

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resultantes serán muchos y muy pequeños. Como nos interesa formar cristales lo más
grandes posibles (ca. 0,5 mm de largo) es necesario limitar la cantidad de núcleos en
formación. En el experimento, por tanto, hay que aproximarse a la fase de nucleación
muy lentamente, para garantizar que los núcleos tengan tiempo suficiente para crecer.

El paso de una solución estable a una sobresaturada se puede realizar fácilmente

variando la proporción de la mezcla de proteína y precipitante guiándose por el
diagrama de fases. Para ello, se puede aumentar la concentración de la proteína o la
del precipitado. Los procesos físicos que se prestan para lograr un cambio de
concentración son la diálisis y la difusión. Ambos se caracterizan por el transporte de
materia. El método de difusión por vapor, ha demostrado ser especialmente idóneo
para la cristalización.

¿Qué Materiales se Pueden Usar Como Precipitante?

En principio, se puede usar cualquier material que pueda influir sobre la solubilidad de
la proteína, siempre que no la desnaturalice en elevadas concentraciones.

Los distintos precipitantes usados comúnmente en la cristalización de proteínas se

pueden catalogar según sus efectos sobre la solución. Por ejemplo, las sales como
(NH4)2SO4, NaCl, LiCl, KH2PO4, etc., cambian la carga iónica de la solución. La Figura
demuestra como varía la solubilidad de las proteínas en función de la carga iónica.

El área a la izquierda del máximo de solubilidad proteica también se denomina área de

salado (“salting-in”); el área a la derecha, de desalado (“salting-out”). En la zona de
“salting-in” la solubilidad aumenta debido a la elevada constante dieléctrica de la
solución. Gracias a este aumento, las cargas de la superficie de la proteína pueden
interactuar mejor con su entorno. En la zona de “salting-out” la solubilidad vuelve a
descender, ya que las cargas de precipitante entran en competencia por las moléculas
de agua con las cargas de la superficie de la proteína.

Los precipitados orgánicos como el etanol, el metanol, el propanol, el MPD

(metilopentanediol) o el acetonitrilo, entre otros, disminuyen la solubilidad proteica ya
que bajan la constante dieléctrica de la solución. El mismo efecto provocan los
polímeros orgánicos como, por ejemplo, los PEGs (polietilenglicoles), que se pueden
encontrar con diversos pesos moleculares (de 400 a 20.000 Da).

Otro parámetro importante que influye en la solubilidad de las proteínas es el factor

de pH. La solubilidad es más baja, por lo general, en el punto isoeléctrico de la proteína
(IEP), puesto que allí ́ es donde la proteína contiene una carga neta de cero.

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Figura 2 Dependencia de la solubilidad S en función de la carga iónica I

Existen muchos factores que pueden influir en la cristalización, y normalmente

disponemos de una cantidad reducida de proteína; como consecuencia, resulta
prácticamente imposible probar todos y cada uno de los parámetros existentes en el
espectro. Es importante, por tanto, desarrollar una estrategia que nos permita obtener
resultados rápidos sin gastar demasiado material.

Propiedades de los Cristales Proteicos

En principio, los cristales proteicos están formados de igual manera que los cristales de
moléculas pequeñas o cristales salinos, y su empaquetamiento molecular y su simetría
se rigen por las mismas reglas. Sin embargo, hay algunas diferencias fundamentales
que afectan tanto a las propiedades mecánicas y ópticas de los cristales como a su
composición. Los cristales proteicos son muy blandos y contienen normalmente entre
un 30% y un 70% de agua, la mayor parte de forma relativamente desordenada dentro
del cristal.

La integridad del cristal está dictada por la interacción entre las moléculas proteicas;
sin embargo, entre las proteínas se encuentran espacios vacíos de un tamaño
considerable, que están llenos de agua y/o moléculas amortiguadoras. Por
consiguiente, las moléculas proteicas se encuentran en un medio casi natural, es decir,
acuoso. Su estructura original (los pliegues de la proteína, fundamentales para permitir
la actividad proteica) se mantiene, algo que se puede comprobar por medio de test de
actividad enzimática realizadas en proteínas cristalizadas. En algunos casos, la forma
cristalina es una forma natural de reserva, como ocurre por ejemplo con la insulina.
[ CITATION DrW \l 1034 ]

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Materiales y equipos
Tabla 1 Materiales Empleados en el proceso de Cristalización de la albumina

Materiales Cantidad Capacidad

Probeta 2 100ml
Vaso de precipitación 2 100ml
Varilla 2 ----
Hornilla 1 ----
Pipeta Volumétrica 1 1ml
Pipeta Volumétrica 1 10ml
Pera 1 ----
Tubo de ensayo 4 ----
Balón de aforo 2 100ml
Caja Petri 2 ----
Embudo 1 ----
Gaza 2 ----

Tabla 2 Equipos Empleados en el proceso de Cristalización de la albumina

Equipos Cantidad Capacidad

Centrifugadora 1 6000rpm
Refrigeradora 1 ----

Tabla 3 Reactivos Empleados en el proceso de Cristalización de la albumina

Reactivos Cantidad
Albumina (clara de huevo) 3
Ácido Acético 1N 20g
Sulfato de Amonio 50% 6,12g

Procedimiento
Elaboración de las soluciones

Procedimiento para el Ácido Acético 1 N

Se pesa en un pesa ácidos 6.12 gramos de ácido acético glacial y se afora a 100 ml
en un balón de aforo.

Procedimiento para el Sulfato de Amonio al 50%

Se pesan 20 gramos de sulfato de amonio anhídrido y se diluye con un poco de
agua y calor, al ser esta una solución sin mayor requerimiento de precisión se
terminara de completar su volumen en una probeta hasta alcanzar 40 ml; así
obtenemos nuestra solución de sal neutra al 50%

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Figura 3 Solución de ácido acético 1 N aforado y detrás la sal de sulfato de amonio en los vasos

Procedimiento de la Cristalización de Albumina

Se mide 20 ml de clara de huevo en una probeta, posteriormente se agita las claras
se coloca 0.2ml de ácido acético 1 N.

Figura 4 Agitando las claras con 0.2 ml de ácido acético

Con el fin de romper las membranas lo máximo posible, se pasa las claras agitadas
con el ácido por una gaza con ayuda de un embudo.
Al pasante se le añaden 20 ml de sulfato de amonio y se forma una solución turbia
lechosa.
Se coloca esta solución en tubos de ensayos y se centrifugan durante 1 hora a 6000
r.p.m. hasta que se separe el sobrenadante (albumina) del precipitado blanco
(globulina).

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Figura 5 Soluciones de Clara de huevo, Acido Acético y Sulfato de Amonio listo para colocar en la centrifugadora.

Medimos el sobrenadante en una probeta y colocamos la mitad de este volumen

de sulfato de amonio al 50% hasta formar un precipitado lechoso que agitaremos
esporádicamente
Se coloca la solución en una caja Petri con la menor superficie posible y se deja en
refrigeración durante 5 días.

Figura 6 Soluciones listas para refrigerar

Datos teóricos y/o experimentales

Datos el ácido acético glacial de partida

g
M =60
mol

Kg
ρ=1,19
m3

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Riqueza=98 %

Cálculos
Cálculos para la preparación la solución del ácido acético
1000 ml 60 EQ
100 ml x
x= 6EQ
6g 100% puros
x 98%
x= 6.12 gramos

Resultados
Al segundo día se observó si había formación de cristales y se visualizó que estos si
estaban en proceso de formación

Figura 7 Formación de cristales al segundo día de refrigeración

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Conclusiones
Para la formación completa de cristales de la albumina se necesita mínimo 5 días, pero
pudimos cerciorarnos que el proceso realizado fue correcto ya que claramente se
observa que los cristales se están formando.

Ya que el huevo tiene un alto porcentaje de la albumina (60-65%) y al ser esta un

proteína la formación de los cristales es rápida, y al seguir este proceso se concentró
más la albumina a la que se le añade el ácido acético y el sulfato de amonio, con la
intención de reducir la solubilidad de la proteína y generar una precipitación
controlada de la misma. Si posteriormente se fuerza un incremento paulatino de
concentración y se controlan las condiciones normalmente se generan diminutos
núcleos cristalinos cuyo ulterior crecimiento puede dar lugar a cristales de tamaño
adecuado para los experimentos de difracción (entre 0.1 y 0.5 mm).

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Bibliografía
Dr. Weiss, M. S. (s.f.). JBS Kit de Iniciación a la Cristalización de Proteínas. Obtenido de
Jena Bioscience: http://www.jenabioscience.com/images/0f4b2c43de/CS-
401ES.pdf

Lamarque, A. (2008). Fundamentos teorico-practicos de quimica organica/ Theoretical

and practical organic chemistry. (E. Brujas, Ed.)

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